結直腸癌周圍淋巴結CK20蛋白檢測的臨床應用研究

王佳雷,李霖

(南寧市第二人民醫(yī)院胃腸外科,廣西 南寧 530031)

結直腸癌周圍淋巴結CK20蛋白檢測的臨床應用研究

王佳雷,李霖

(南寧市第二人民醫(yī)院胃腸外科,廣西 南寧 530031)

目的：探討免疫組化(IHC)檢測結直腸癌區(qū)域淋巴結微轉移的細胞角蛋白20(CK20)對結直腸癌術后臨床分期、預后判斷和治療干預的可行性和臨床應用價值。方法：選取40例常規(guī)HE病理檢查淋巴結轉移陰性的結直腸癌患者為研究對象，術前抽取外周血行循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)測定；術中、后沿亞甲藍染劑標識的區(qū)域淋巴結按4站次淋巴結分別摘除、放置并標記，應用IHC技術檢測淋巴結中CK20，統(tǒng)計淋巴結微轉移患者的陽性例數(shù)及陽性率及其在各不同站次的分布情況，并對HE、CTC和IHC CK20方法檢測的結果進行比較。結果：淋巴結CK20測定與HE染色法的淋巴結微轉移陽性檢出率間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；不同站次間淋巴結微轉移陽性檢出率存在統(tǒng)計學差異(P<0.01或P<0.05)；全組CK20檢測有存在淋巴結微轉移11例(11/40，27.5%)；7例患者TNM分期提高，HE染色法重新分期率為17.5%(7/40)。全組CTC檢測顯現(xiàn)陽性7例，陽性表達率為17.5%(7/40)，其中6例對應于IHC淋巴結CK20(+)患者，1例為IHC淋巴結CK20(-)患者，且CTCs細胞學分型表達與結直腸癌腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度呈正相關性。結論：CK20免疫組化法是檢測淋巴結微轉移可靠而敏感的方法，結合亞甲藍染色法顯影淋巴結可簡便、快速地發(fā)現(xiàn)微轉移灶，與CTC檢測聯(lián)用可達互補效能，進一步提高微轉移檢出率，減少假陰性發(fā)生。

結直腸癌; 細胞角蛋白20; 淋巴結; 循環(huán)腫瘤細胞; 微轉移

結直腸癌是消化道最為常見的惡性腫瘤之一，隨著外科手術和輔助手段不斷改進，患者總體預后得到很大改善，但目前困擾結直腸癌臨床治療的主要問題仍是腫瘤的復發(fā)和轉移[1]。研究[2]表明，眾多結直腸癌患者術前已發(fā)生不同程度的腫瘤微轉移，淋巴結轉移是其最主要的轉移途徑，結直腸癌淋巴結轉移與否是臨床最為重要的診斷治療參考指標。然而傳統(tǒng)組織學檢查對淋巴結轉移，尤其是微轉移的診斷有很大的局限性。本研究通過免疫組織化學法(IHC)，對結直腸癌區(qū)域淋巴結細胞角蛋白20(CK20)進行測定，并結合CanpatrolTM CTC檢測方法檢測外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)，探討這些因子的表達與結直腸癌復發(fā)和轉移之間的關系，為提高臨床分期的準確性，早期預后判斷和治療干預提供理論和臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年4月至2014年12月收治40例常規(guī)HE病理檢查淋巴結轉移陰性的結直腸癌患者(術后篩選)為研究對象，均符合結直腸癌診斷標準，結直腸癌區(qū)域淋巴結常規(guī)病理蘇木精-伊紅(HE)染色陰性者，且術前無施行新輔助放化療史。排除合并肝、肺、腹膜等遠處轉移者。其中男性28例，女性12例，年齡32～75歲，平均43.3歲；升、橫結腸癌9例，降、乙狀結腸癌21例，高位直腸癌10例；腫瘤分化程度：高分化腺癌4例，中分化腺癌8例，低分化腺癌28例；PTNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期23例，Ⅲ期13例。

1.2 方法與試劑

1.2.1 CanpatrolTM CTC檢測 全組結直腸癌患者術前抽取外周靜脈血5 mL，隨行血標本裂解紅細胞，通過納米技術利用CTCs與白細胞大小的差異行CTCs分離和富集，并利用多重mRNA原位分析法對富集CTCs進行特異性基因核酸定位，進而對其鑒定和分型。掃描結果：紅色熒光標記為上皮型CTCs(Ⅰ型)；藍色熒光標記為上皮和間質細胞混合表型CTCs(Ⅱ型)；綠色熒光標記為間質型CTCs(Ⅲ型)。

1.2.2 取材方法 全組病例全麻下腹腔鏡下或開腹探查腹腔，明確無腹腔及肝臟遠處轉移后，距結直腸腫瘤緣1.0～1.5 cm上下左右4處，于腸壁漿膜層及黏膜下層分別注射亞甲藍染色劑0.5 mL，共計2 mL，注射畢10～15 min后行結直腸癌根治術。術中、后沿結直腸系膜藍染途徑分別摘取、標記結腸旁淋巴結(N1)、結腸局部腸系膜淋巴結(N2)、腸系膜上動脈周圍及根部淋巴結(N3)、腹主動脈周圍淋巴結(N4)四站淋巴結。每站每枚淋巴結標本統(tǒng)一編號，福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，一半常規(guī)病理檢查HE染色，另一半預留行IHC CK20測定。

1.2.3 試劑及HE染色、IHC測定 全組40例患者共396枚HE染色陰性的淋巴結納入本研究。淋巴結標本均制成厚度4 μm石蠟切片，取HE染色陰性的另一半預留淋巴結石蠟標本，經二甲苯脫蠟、梯充酒精脫水后，檸檬酸緩沖液微波法修復抗原；3 %過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶的活性，加入抗體，4 ℃過夜；DAB顯色，顯微鏡下觀察3～10 min，陽性染色為棕褐色或黃色；蒸餾水沖洗，蘇木精復染，0.1 %鹽酸分化，PBS返藍；切片經梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固；光鏡下觀察結果。以PBS代替一抗作陰性對照，直腸癌組織作為陽性對照。結果判斷：CK20以胞漿黃染或棕褐色為陽性；淋巴結內出現(xiàn)少量CK20陽性細胞認為淋巴結中存在微轉移灶。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 40例患者淋巴結微轉移與臨床病理特征關系

40例結直腸癌切除的淋巴結標本共396枚，其中N168枚，N2124枚，N3148枚，N456枚。全組IHC CK20陽性淋巴結共43枚，其中N120枚，N214枚，N38枚，N41枚；CK20淋巴結微轉移檢出率為10.9%(43/396)，N1～N4淋巴結CK20淋巴結微轉移檢出率分別為5.1%(20/396)、3.5%(14/396)、2.0%(8/396)、0.3%(1/396)。淋巴結CK20測定與HE染色法的淋巴結微轉移陽性檢出率間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；不同站次間淋巴結微轉移陽性檢出率存在統(tǒng)計學差異(N1vsN2；N2vsN3；N3vsN4；N1vsN3；N2vsN4；N1vsN4；P<0.01或P<0.05)。見圖1。

2.2 淋巴結微轉移與臨床病理特征關系

40例結直腸癌患者行腫瘤區(qū)域淋巴結CK20檢測有11例患者存在淋巴結微轉移，陽性表達率為27.5%(11/40)；7例患者TNM分期提高，其中Ⅰ期→ⅢA 1例，ⅡA期→ⅢA 5例，ⅡA期→ⅢC 1例，HE染色重新分期率為17.5%(7/40)。40例患者淋巴結微轉移與臨床病理特征關系見表1。

2.3 CTCs細胞學分型表達與臨床病理特征關系

全組40病例經CTC檢測顯現(xiàn)陽性共7例，陽性表達率為17.5%(7/40)，其中6例對應于IHC淋巴結CK20(+)患者，1例為IHC淋巴結CK20(-)患者，且CTCs細胞學分型表達與結直腸癌腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度呈正相關性。詳見圖2-圖4，表2。

表1 40例患者淋巴結微轉移與臨床病理特征關系

3 討論

盡管目前結直腸癌的治療療效較過去有了相當大的提高，但臨床上仍有30%～50%患者術后出現(xiàn)復發(fā)和遠處轉移[3]，即使在常規(guī)病理檢查未發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移的Ⅰ、Ⅱ期患者，仍有約30%患者5年內死于局部復發(fā)和遠處轉移[4-5]。分析其原因可能是淋巴結、血液、骨髓中存在微小轉移灶，用傳統(tǒng)的病理檢查方法很難檢出，而導致臨床無法及時、準確治療[6]。目前，雖然淋巴結轉移對結直腸癌預后價值已達成共識，但對于淋巴結微轉移和預后的關系仍存在較大分歧。有學者認為，淋巴結微轉移對預后無影響[7]，但Clarke等[8-9]研究結果顯示：Ⅱ期結直腸癌患者約1/4存在淋巴結微轉移，且與術后復發(fā)轉移相關；有淋巴結微轉移的Ⅰ～Ⅱ期結直腸癌患者術后復發(fā)率更高，3年無瘤生存率更低。

表2 CTCs細胞學分型表達與臨床病理特征關系

作為傳統(tǒng)病理學檢查的HE染色法，針對淋巴結病檢只是選取淋巴結具有代表性的一個切面，而不能普查淋巴結大部分組織，故有可能忽略淋巴結微轉移的存在。近年來，隨著組織化學和分子生物學技術的發(fā)展，利用IHC法可發(fā)現(xiàn)常規(guī)HE染色所不能發(fā)現(xiàn)的單個癌細胞和/或孤立腫瘤細胞巢。CK20屬細胞角蛋白家族，其具有嚴格的上皮組織特異性，主要分布于胃、腸黏膜細胞及相應癌細胞中，在大腸癌中高度表達，在正常間葉組織中無表達，且侵襲、轉移、擴散至其它組織器官時始終保持穩(wěn)定，使之成為檢測大腸癌微轉移敏感而特異的腫瘤標志物。本研究運用IHC方法重新分析了結直腸癌40例396枚HE染色呈陰性的淋巴結，結果發(fā)現(xiàn)11例43枚淋巴結存在微轉移，CK20淋巴結微轉移檢出率為10.9%，淋巴結微轉移例數(shù)達27.5%，其中7例TNM分期提高，HE染色重新分期率為17.5%，與報道[10-11]一致。表明HE染色不能全面反映淋巴結微轉移的情況，同時，也進一步表明IHC方法對淋巴結微轉移檢測更具可靠性和敏感性。

經淋巴轉移是結直腸癌的主要轉移途徑，正確識別、判斷淋巴結轉移程度并合理清掃顯得十分重要。區(qū)域淋巴結的組織病理學狀態(tài)可推測腫瘤分期和預后，但臨床上區(qū)域淋巴結的部位和范圍往往是根據(jù)操作者的經驗估計而定，受各種主、客觀因素的影響其準確性不高。本研究術中首行腫瘤周緣漿膜和黏膜下注射亞甲藍染液，充分利用亞甲藍快速直觀和在淋巴管消退緩慢、染色穩(wěn)定可靠的特點，使之較清晰地標識結直腸癌區(qū)域淋巴結和淋巴回流途徑，盡可能減少因淋巴結個體小、系膜組織肥厚及多向性和“跳躍性”淋巴轉移等因素而影響淋巴結的全面、完整取材。研究顯示：全組病例區(qū)域淋巴結取材平均達9.9枚，不同站次淋巴結CK20(+)檢出率分別為N15.1%、N23.5%、N32.0%、N40.3%，組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.01或P<0.05)。其中，N1更能反映結直腸癌區(qū)域淋巴結的微轉移狀況，間接印證了結直腸癌遠處轉移模式[12]。結果表明，通過藍染法和IHC CK20檢測的聯(lián)合應用利于提高淋巴結微轉移的檢出率和準確性。

循環(huán)腫瘤細胞是指從原發(fā)或繼發(fā)腫瘤脫落進入外周血循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞。近年來研究表明，腫瘤在發(fā)生轉移前，原發(fā)灶腫瘤細胞通常會在其微環(huán)境影響下經歷一種被稱為上皮間質轉化(EMT)的改變。EMT過程中，除了細胞形態(tài)和移動性發(fā)生改變外，細胞基因表達譜特別是上皮、間質分子標志物及其轉錄因子的表達也發(fā)生改變。發(fā)生EMT的腫瘤細胞被賦予干細胞特性，細胞間粘附改變，遷移和侵襲能力增強。因此，CTCs已被認為是導致腫瘤遠處轉移的主要根源。另外，血液中的循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)量對腫瘤的轉移有相關性，更重要的是循環(huán)腫瘤細胞的分子特性。處在EMT途徑的循環(huán)腫瘤細胞具有更強的侵襲性，更能在遠處形成新的腫瘤病灶。因此分析腫瘤細胞EMT分子特性，能早期發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移的風險和預后判斷。

本研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌外周血中CTCs的表達與腫瘤分化和浸潤程度密切相關，表明隨著癌細胞侵襲腸壁深度的加深，腫瘤發(fā)生血行轉移的比例也隨之增加。但微轉移陽性表達率方面，CTC的17.5%(7/40)與CK20的27.5%(11/40)相比存在一定差距，推測為血循環(huán)腫瘤細胞到達肝臟后容易被肝臟Kupffer細胞所吞噬[13-14]。因此，CTCs的陽性檢出率還取決于肝臟免疫系統(tǒng)功能。另外，CTC檢測陽性表達病例中1例為IHC CK20(-)患者，術后病理證實為TNM Ⅲ期直腸浸潤性癌，病灶大，與周圍組織粘連融合，癌栓堵塞淋巴管，致淋巴結取材呈CK20(-)。這表明淋巴結CK20微轉移檢測仍存在一定的局限性和假陰性。

綜上，CK20免疫組化法是檢測淋巴結微轉移可靠而又敏感的方法，其結合亞甲藍染色法顯影淋巴結可簡便、快速地發(fā)現(xiàn)微轉移灶；與CTC檢測聯(lián)用可達互補效能，進一步提高微轉移的檢出率，減少假陰性的發(fā)生，對進行正確的臨床分期，合理的后續(xù)治療提供了依據(jù)。但淋巴結存在微轉移并不一定是真正意義上的淋巴結轉移，微轉移的檢測可間接作為預后的監(jiān)測指標，需后期加大樣本進一步分析驗證。

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(學術編輯：任亦星)

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Study on clinical application of colorectal carcinoma peripheral lymph node CK20 protein detection

WANG Jia-lei,LI Lin

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,NanningSecondPeople’sHospital,Nanning530031,Guangxi,China)

Objective：To explore the feasibility and clinical application value of immunohistochemical (IHC) method detecting cytokeratin 20 (CK20) of colorectal carcinoma (CRC) lymph node micrometastasis in the postoperative clinical staging,prognostic diagnosis and therapeutic interventions for patients with CRC.Methods：A total of 40 patients with negative CRC lymph node metastasis by hemotoxylin and eosin HE pathological examination,and peripheral blood circulating tumor cells (CTCs) were collected preoperatively.The lymph nodes were incised,placed and marked every 4 locations along methylene blue stain-marked regional lymph nodes during and after operation,IHC was used to detect CK20 in lymph nodes,the number of patients with positive lymph node micrometastasis and its distribution in different stations were recorded,and the detection results of HE,CTC and IHC CK20 were compared.Results：There was significant differences in the positive detection rate of lymph node micrometastasis between lymph node CK20 and HE stain (P<0.01),and the differences were also significant in the positive detection rate of lymph node micrometastasis among different locations (P<0.01 orP<0.05).According to full-set CK20 detection,11 (11/40,27.5%) patients had lymph node micrometastasis;7 patients had increased TNM stages,and the re-staging rate of HE stain was 17.5% (7/40).Full-set CTC detection showed that 7 patients were positive,with positive expression rate being 17.5% (7/40),in whom 6 were corresponding to IHC lymph node CK20(+) while 1 to IHC lymph node CK20(-).Meanwhile,CTCs cytological typing expression was in positive association with CRC tumor differentiation severity and tumor infiltration depth.Conclusion：CK20 immunohistochemical method,as a reliable and sensitive method for the detection of lymph node micrometastasis,can simply and quickly find the micrometastatic nidi combing with methylene blue stain,and has synergistic effect with CTC detection to further increase the detection rate of lymph node micrometastasis and reduce the occurrence of false negative detection.

Colorectal carcinoma;Cytokeratin 20;Lymph node;Circulating tumor cell;Micrometastasis

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.01.023

廣西南寧市科學研究與技術開發(fā)計劃項目(201003045c-7)

2016-08-11

王佳雷(1980-)，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：Wjl_0518@163.com

李霖，E-mail：lilin_661220@163.com

時間：2017-3-6 21∶08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170306.2108.046.html

1005-3697(2017)01-0082-04

R735.3

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