miRNA21抑制物對食管癌細胞凋亡的影響

鄭鵬超,李磊

(荊門市第二人民醫(yī)院心胸外科，湖北 荊門 448000)

miRNA21抑制物對食管癌細胞凋亡的影響

鄭鵬超,李磊

(荊門市第二人民醫(yī)院心胸外科，湖北 荊門 448000)

目的：利用miRNA21抑制物抑制食管癌細胞系ECA-109中miRNA21的表達，觀察對ECA-109細胞凋亡的影響，為探討miRNA21抑制物在食管癌治療中的應用提供理論參考。方法：以正常培養(yǎng)的ECA-109細胞為空白對照組，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物陰性對照物作為陰性對照組，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物作為實驗組，通過MTT法、流式細胞術、實時熒光定量PCR研究miRNA21抑制物對ECA-109細胞增殖、凋亡及凋亡相關基因表達的影響。結(jié)果：與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物能夠顯著性地抑制ECA-109細胞的增殖 (P<0.05)，并且明顯提高ECA-109細胞的凋亡率(P<0.05)，促進細胞凋亡。同時，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制劑的實驗組ECA-109細胞中促凋亡基因caspase3、p53、在mRNA水平的表達均顯著升高 (P<0.05)，而抗凋亡基因Bcl-2的表達則被顯著抑制 (P<0.05)。結(jié)論：miRNA21抑制劑能夠抑制食管癌細胞ECA-109的增殖，增強促凋亡相關基因的表達，促進癌細胞的凋亡；miRNA21具有明顯的原癌基因樣功能，可作為食管癌細胞治療的靶標。

食管癌；miRNA21；miRNA21抑制物；細胞凋亡

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類保守的非編碼RNA，其長度約為20～24個核苷酸，能夠與mRNA特異性性結(jié)合，介導靶基因mRNA的降解，從而參與基因的表達調(diào)控[1-2]。目前，miRNA21是唯一被報道在多種實體腫瘤(如肺癌、乳腺癌、食管癌)中都呈現(xiàn)過表達的miRNA，能夠參與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3-5]。因此，探索miRNA21抑制物在癌細胞凋亡中的作用，能夠為臨床癌癥治療提供重要的理論參考。本文以反義寡核苷酸作為miRNA21抑制物，轉(zhuǎn)染食管癌細胞系ECA-109，初步探討miRNA21抑制物對食管癌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

食管癌細胞系ECA-109 (中國科學院上海細胞庫)；miRNA21抑制物和miRNA21抑制物陰性對照物 (上海艾博思生物公司)；DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑 (美國Thermo)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、臺盼藍、噻唑藍 (MTT)、二甲基亞砜 (DMSO)、青霉素、鏈霉素 (上海索萊寶生物公司)；TRIzol、cDNA快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR mixture試劑盒 (北京天跟生物公司)；imark全自動酶標儀、IQ5實時熒光定量PCR儀、S3全自動化流式細胞儀 (美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 食管癌上皮細胞ECA-109為貼壁生長細胞，采用單層貼壁式培養(yǎng)?；A培養(yǎng)液為RPMI1640，加入10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于37 ℃培養(yǎng)箱 (5% CO2)恒溫培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前48 h，將細胞轉(zhuǎn)移至不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中，用六孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)至細胞匯合度達80%左右。用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基將miRNA21抑制物及其陰性對照物稀釋至200 ng/mL，將二者分別與RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后的DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑 (1∶100稀釋) 等體積混合，室溫靜置5～10 min。將含miRNA21抑制物的混合液1 mL加入1個細胞培養(yǎng)孔，作為實驗組 (miRNA21 inhibitor)；將含miRNA21抑制物陰性對照物的混合液1 mL加入1個細胞培養(yǎng)孔，作為陰性對照組 (miRNA21 inhibitor NC)；將1 mL不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基加入一個培養(yǎng)孔，作為空白對照組 (Blank)。

1.2.2 MTT法檢測細胞增值 將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化成單細胞懸液，取少量用臺盼藍染色法計數(shù)。將細胞密度稀釋至1×104個/mL，并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；24 h后，按照上述方法進行細胞轉(zhuǎn)染實驗。每組于轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h分別取出一板用于MTT法檢測細胞增長，每個時間點每組設定3個平行孔。MTT法具體實驗方法是：每孔加入25 μL MTT溶液(5 μg/μL)，置于37 ℃溫箱中孵育4～5 h，小心吸去上清液；每孔加入200 μL DMSO，輕搖至結(jié)晶沉淀物溶解；用imark全自動酶標儀測定490 nm波長的吸光度值A；以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線；細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 將處于對數(shù)生長期的細胞按照上述方法調(diào)整細胞濃度至5×105個/mL，采用無血清培養(yǎng)進行細胞同步化處理；隨后，按上述方法進行細胞轉(zhuǎn)染實驗；72 h后，將細胞消化成單細胞懸液，用PBS緩沖液洗滌2～3次，將細胞密度稀釋至1×106個/mL；置于4 ℃，用70%乙醇固定12 h以上；用5 mg/L溴乙錠染色20 min；用500目尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 實時熒光定量PCR實驗 將進行細胞轉(zhuǎn)染實驗48 h的各組細胞收集 (每組收集3個培養(yǎng)孔)，用PBS洗滌2～3次，加入1 mL TRIzol試劑裂解細胞，并按照酚-氯仿抽提法提取細胞總RNA。參照天根生物科技公司的cDNA快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的使用說明進行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成。用實時熒光定量PCR法檢測凋亡相關基因Caspase3、p53、Bcl2基因的表達變化。所用引物序列如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR實驗所用引物序列

1.3 統(tǒng)計學分析

利用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；利用GrahPad Prism5.0繪制折線圖及柱形圖。

2 結(jié)果

2.1 miRNA21抑制物對ECA-109細胞增殖的影響

利用MTT比色法繪制細胞增殖曲線，由圖1所示：在各測定時間點，空白對照組與陰性對照組的細胞增值曲線相互重合，未產(chǎn)生明顯差異；而轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物則能夠顯著抑制ECA-109細胞的增殖 (P<0.05)，且隨著時間延長抑制效果增強；與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染48 h時細胞增殖抑制率為31%，72 h抑制率為53.7%，96 h抑制率為58.8%，120 h抑制率為59.2%。

2.2 miRNA21抑制物對ECA-109細胞凋亡的影響

表2所示為細胞凋亡率的變化。空白對照組和陰性對照組中細胞的凋亡率分別為 (12.23±1.12)%、(13.18±0.98)%，二者無顯著性差異 (P>0.05)；轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物的實驗組細胞凋亡率為 (35.27±1.34)%，顯著高于空白對照組和陰性對照組 (P<0.05)。

組別細胞凋亡空白對照組12．23±1．12陰性對照組13．18±0．98抑制物35．27±1．34

注：凋亡率代表3次獨立平行實驗。

2.3 miRNA21抑制物對ECA-109細胞中凋亡相關基因表達的影響

在細胞凋亡中，caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶，是細胞凋亡的執(zhí)行者；p53作為一種抗癌基因產(chǎn)物，能夠誘導細胞凋亡；Bcl-2作為一種原癌基因產(chǎn)物，能夠參與調(diào)控線粒體功能，阻斷p53誘導的細胞凋亡[6-8]。因此，我們通過檢測miRNA21抑制物對caspase-3、p53、Bcl-2基因的表達，探討miRNA21抑制物影響細胞凋亡的可能機制。如圖2所示，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA21陰性對照物的陰性對照組細胞中caspase-3、p53、Bcl-2基因的表達均未出現(xiàn)顯著性變化 (P>0.05)；而轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物的實驗組細胞中，促凋亡基因caspase-3、p53基因的表達明顯高于空白對照組和陰性對照組 (P<0.05)，抗凋亡基因Bcl-2基因的表達則明顯降低 (P<0.05)。

3 討論

食管癌是最常見的消化道腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。我國是世界上食管癌高發(fā)區(qū)之一，每年有超過15萬人死于食管癌。目前，食管癌的治療以手術治療為首要療法，但仍需配合化學治療、放射治療方能穩(wěn)定療效。然而，放射治療和化學治療所帶來的不良反應嚴重影響患者生活質(zhì)量。因此，亟需開發(fā)新的食管癌質(zhì)量手段，以避免不良反應、穩(wěn)定療效、提高治愈率。

miRNA作為重要的基因轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控因子，已被證明在多種癌細胞增殖、遷移和凋亡中都發(fā)揮著至關重要的調(diào)節(jié)功能[9]。目前，已有大量的研究證實miRNA-21在心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多種疾病中都具有重要的調(diào)節(jié)功能，參與多種腫瘤細胞的增殖、遷移、腫瘤血管生成和抗藥性形成等。在非小細胞肺癌、肝癌等癌組織中，miRNA21都有異常性的升高表達，循環(huán)中的miRNA21已被選擇多種癌癥早期檢測的標志物[10-11]。在惡性膠質(zhì)細胞瘤、舌鱗狀細胞癌中，miRNA21被證實能夠作為凋亡抑制因子，保護癌細胞免受化療誘導的細胞凋亡[12-13]。這些研究成果充分證實miRNA21在腫瘤細胞凋亡中發(fā)揮著至關重要的功能，拮抗miRNA21抗細胞凋亡作用有可能成為癌癥治療的新靶點。

本研究利用miRNA21抑制物拮抗miRNA21的功能，對miRNA21抑制物在人食管癌細胞凋亡中的功能進行了初步探討。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物48 h后，人食管癌細胞系ECA-109細胞增殖受到顯著性地抑制，并且隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，細胞增殖抑制率明顯升高，最高可達59.2% (轉(zhuǎn)染后120 h)；而轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物的陰性對照物則不對ECA-109細胞的增殖產(chǎn)生顯著影響。更重要的是，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物能夠顯著提高ECA-109細胞的凋亡率。轉(zhuǎn)染72 h后，miRNA21抑制物轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率可達 (35.27±1.34)%，顯著高于陰性對照組的 (13.18±0.98)%。這些結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物能夠有效地拮抗miRNA21抗細胞凋亡的作用，抑制食管癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。

為進一步證實上述結(jié)論，實驗檢測了miRNA21抑制物對幾種凋亡相關基因表達的影響。有文獻研究證實miRNA21能夠通過影響B(tài)cl-2的表達、調(diào)節(jié)caspase-3和p53活性等方式參與細胞凋亡的調(diào)控[14-16]。本研究選擇caspase-3、p53和Bcl-2作為代表，檢測miRNA21抑制物對凋亡相關基因表達的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物能夠明顯地提高促凋亡基因caspase-3、p53基因在mRNA水平的表達，而抗凋亡基因Bcl-2在mRNA水平的表達則被顯著抑制。這些結(jié)果進一步證實miRNA21抑制物能夠拮抗miRNA21的功能，促進食管癌細胞的凋亡。

本研究研究了miRNA21抑制物對食管癌細胞凋亡的影響，證實miRNA21抑制物能夠拮抗miRNA21的功能，調(diào)控凋亡相關基因的表達，抑制食管癌細胞的增值，促進癌細胞凋亡。這些研究成果證實應用miRNA21抑制物能夠作為臨床應對食管癌的新療法，相應的研究成果為miRNA21抑制物的臨床應用提供了重要的理論參考。

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(學術編輯：李祖茂)

The influence of miRNA21 inhibitor on esophageal carcinoma cell apoptosis

ZHENG Peng-chao，LI Lei

(DepartmentofCardio-ThoracicSurgery,TheSecondPeople’sHospitalofJingmen,Jingmen448000,Hubei,China)

Objective：The purpose of this study was to provide theoretical reference for the application of miRNA21 inhibitor in the treatment of esophageal carcinoma,by using miRNA21 inhibitor miRNA21 expression in ECA-109 esophageal cancer cell lines,to observe the influence of the ECA-109 cell apoptosis.Methods：The cultured ECA-109 cells were divided into blank control group (normally cultured),negative control group transfected with negative miRNA21 inhibitor,and the experimental group transfected with miRNA21 inhibitor.The influence of miRNA21 inhibitor on cell proliferation,apoptosis and apoptosis-related gene expression of ECA-109 cells was repectively investigated by MTT method,flow cytometry and real-time fluorescence quantitative PCR.Results：Compared with blank and negative control groups,the transfection of miRNA21 inhibitor significantly inhibited the proliferation of ECA-109 cells (P<0.05),significantly elevated the percent of apoptotic cells (P<0.05) and promoted its apoptosis.While,the expression of pro-apoptotic genes as caspase3 and p53 was significantly elevated in ECA-109 cells of experimental group (P<0.05).However,anti-apoptotic gene Bcl-2 was significantly inhibited (P<0.05).Conclusion：miRNA21 inhibitors can inhibit the proliferation of esophageal cancer cell ECA-109,enhance the expression of pro-apoptotic genes and promote the apoptosis of esophageal carcinoma cells.Therefore,miRNA21 has the similar function of oncogene,which can be used as a target for the treatment of esophageal carcinoma cells.

Esophageal cancer;miRNA21;miRNA21 inhibitor;Apoptosis

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.01.022

2016-08-20

鄭鵬超(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail：1085209450@qq.com

時間：2017-3-6 21∶08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170306.2108.044.html

1005-3697(2017)01-0078-04

R735.1

A