FimH黏附素對F18ac+大腸桿菌黏附能力和生物被膜形成能力的影響

段強德,許保疆,王錄軍,付宏岐,朱國強

(1.渭南職業(yè)技術學院,陜西 渭南714026; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學院，河南 鄭州 450002; 3.揚州大學 獸醫(yī)學院,江蘇 揚州225009)

FimH黏附素對F18ac+大腸桿菌黏附能力和生物被膜形成能力的影響

段強德1,許保疆2,王錄軍1,付宏岐1,朱國強3

(1.渭南職業(yè)技術學院,陜西 渭南714026; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學院，河南 鄭州 450002; 3.揚州大學 獸醫(yī)學院,江蘇 揚州225009)

為研究Ⅰ型菌毛FimH黏附素在F18ac+大腸桿菌(F18ac+E.coli)致病機制中的作用，采用λ-Red同源重組方法成功構建了F18ac+E.coli的fimH基因缺失株(F18ac△fimH)。并使用體外仔豬上皮細胞感染模型，探討FimH黏附素缺失后對F18ac+E.coli黏附能力和體外生物被膜形成能力的影響。結果表明，與野生株相比，F(xiàn)18ac△fimH缺失株對易感仔豬上皮細胞系IPEC-1和IPEC-J2的黏附能力和體外生物被膜形成能力均顯著下降，且其黏附能力可被8%的D-甘露糖所抑制。但是F18ac△fimH/pfimH回補株的黏附能力以及生物被膜形成能力均基本恢復至野生株水平。可見，F(xiàn)imH黏附素是介導F18ac+E.coli黏附的重要黏附因子。

F18ac+大腸桿菌； Ⅰ型菌毛； FimH黏附素； 黏附； 生物被膜

F18+大腸桿菌(F18+E.coli)根據(jù)其表達菌毛類型的不同，可以分為F18ab和F18ac變異種。F18ab+E.coli屬于產(chǎn)志賀氏樣毒素的E.coli(shiga-like toxicE.coli， SLTEC)，主要引起仔豬水腫病(edema disease，ED)；F18ac+E.coli屬于產(chǎn)腸毒素性E.coli(enterotoxigenicE.coli，ETEC)，是引起斷奶仔豬腹瀉(post-weaning diarrhea,PWD)的主要病原菌之一[1-2]。F18ac+E.coli在多種黏附因子介導下，首先粘附定植到仔豬小腸上皮細胞，然后通過分泌毒素引起機體水、電解質(zhì)紊亂而最終導致腹瀉。目前,已知參與介導F18ac+E.coli對仔豬小腸上皮細胞的黏附因子有F18ac菌毛和鞭毛[3-4]。另外，潛在的黏附因子包括與擴散粘附有關的黏附素(adhesin involved in diffuse adherence,AIDA-I)[5]和Ⅰ型菌毛，但它們在F18ac+E.coli黏附過程中的作用仍然不清楚。

Ⅰ型菌毛在病原性大腸桿菌中廣泛表達，并作為主要的黏附因子發(fā)揮毒力作用。Ⅰ型菌毛的骨架由約3 000個重復的fimA亞基構成，但是其黏附性能則取決于位于菌毛頂部的具有凝集素特性的fimH亞基。FimH黏附素包括凝集素結構域和菌毛結構域，相互之間由1個短的四肽環(huán)連接。FimH黏附素介導多種致病菌與宿主細胞的黏附，包括尿道致病性大腸桿菌(uropathogenicE.coli，UPEC)、黏附侵襲性大腸桿菌(adherent-invasiveE.coli,AIEC)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)等[6-8]。FimH黏附素通過與宿主細胞表面的D-甘露糖受體結合介導病原菌的黏附。盡管已知Ⅰ型菌毛在多方面參與了多種病原菌的致病過程，但其是否參與F18ac+E.coli的黏附過程還不清楚。為此，通過比較F18ac+E.coli野生株和F18ac△fimH缺失株對易感仔豬上皮細胞系IPEC-1和IPEC-J2黏附能力的變化，探討FimH黏附素在F18ac+E.coli黏附過程中的作用，旨在為研究F18ac+E.coli致病機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細胞系

F18ac+E.coli標準株(O157:H19:F18ac,4P-,STa+,STb+)和pBR322表達載體均由渭南職業(yè)技術學院微生物實驗室保存。λ-Red同源重組所需質(zhì)粒pKD46、pKD3和Pcp20均系美國賓夕法尼亞大學獸醫(yī)學院微生物實驗室饋贈。仔豬小腸上皮細胞系IPEC-1和IPEC-J2由美國堪薩斯州立大學微生物實驗室饋贈。

1.2 缺失突變株及互補株的構建

F18ac△fimH缺失株根據(jù)Datsenko等[9]的λ-Red同源重組技術進行構建。首先以質(zhì)粒pKD3為模板，利用引物F18ac△fimH-F/F18ac△fimH-R (表1)擴增，將純化好的帶有fimH基因同源臂的氯霉素抗性基因PCR擴增產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至攜帶有質(zhì)粒 pKD46的F18ac+E.coli感受態(tài)細胞，在Red同源重組酶的作用下，借助兩端與靶基因兩翼同源的序列與染色體上對應區(qū)域發(fā)生同源重組，實現(xiàn)一步法構建F18ac△fimH::Cat。2次重組中利用溫度敏感性，編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，消除Cat抗性基因標志。通過PCR鑒定(PBR-fimH-F/PBR-fimH-R，表1)及DNA測序結果確定缺失株是否成功構建。

表1 PCR引物寡核苷酸序列和擴增片段長度

注：下劃線為fimH基因序列。

以F18ac+E.coli野生株基因組DNA為模板，PBR-fimH-F和PBR-fimH-F為引物(表1)PCR擴增fimH全長基因，經(jīng)測序驗證正確后克隆至表達載體pBR322中，進一步將重組質(zhì)粒pBR322-fimH轉(zhuǎn)化到F18ac△fimH缺失株中，獲得攜帶fimH基因的回補株，并命名為F18ac△fimH/pfimH。

1.3 生物學特性的測定

將F18ac+E.coli野生株、F18ac△fimH缺失株以及F18ac△fimH/pfimH回補株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第2天按1︰50比例轉(zhuǎn)接于10 mL新鮮LB培養(yǎng)液中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取樣測定1次OD600值，記錄并重復上述試驗4次，繪制生長曲線。

血凝試驗 (hemagglutination，HA)和甘露糖敏感性血凝試驗(mannose-sensitive hemagglutinin，MSHA)參照Allan等[10]的方法進行，酵母凝集試驗和凝集抑制試驗參照Sokurenko等[11]的方法進行。

1.4 黏附試驗與黏附抑制試驗

黏附試驗按照 Duan等[3]的方法進行，將對數(shù)期生長的細菌按20︰1的比例加至在48孔板中已經(jīng)生長好的IPEC-1或IPEC-J2單層細胞，并于CO2細胞培養(yǎng)箱中共孵育1 h,然后將未與細胞黏附的細菌用PBS洗滌去掉。與細胞表面黏附的細菌則用0.5%的Triton X-100裂解，然后按1︰10的比例進行梯度稀釋涂布LB平板進行單菌落計數(shù)。

黏附抑制試驗中，先用8%D-甘露糖重懸F18ac+E.coli野生菌株，再以20︰1的比例加入IPEC-1或IPEC-J2單層細胞共孵育1 h，細胞黏附細菌總數(shù)的計數(shù)方法同上。試驗均重復4次，每次試驗每個樣品均設置3個平行孔。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Student’st-test軟件。

1.5 生物被膜定量檢測

將在30 ℃用LB培養(yǎng)的過夜菌液按1︰100的比例接種BF誘導培養(yǎng)基，再加入96孔板中，每孔150 μL。將96孔板置于30 ℃恒溫搖床(80 r/min)中培養(yǎng)24 h，棄菌液后，用蒸餾水將未附著的細菌充分洗滌干凈，以2%的結晶紫于室溫染色15 min，用蒸餾水沖洗干凈后，每孔加入200 μL 95%乙醇溶解結晶紫，采用酶標儀讀取其OD600值。試驗重復3次，每個樣品設置7個平行孔。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Student’st-test軟件。

2 結果與分析

2.1 △fimH缺失株的構建

分別以F18ac+E.coli野生株、1次重組株和2次重組株基因組為模板，用鑒定引物PBR-fimH-F和PBR-fimH-R(表1)PCR擴增fimH基因。對照野生株擴增片段的長度為 903 bp，1次重組體和2次重組體長度分別為1 353 bp和425 bp(圖1)，結果均與預期相同。2次重組株測序結果表明,fimH基因中霉素抗性基因Cat已丟失，在同源區(qū)內(nèi)只留下1個FRT位點。

M: DNA Marker；1.F18ac+E.coli野生株；2.F18ac△fimH::Cat 1次重組體；3.F18ac△fimH 2次重組體；4.F18ac△fimH/pfimH回補株

2.2fimH基因缺失不影響F18ac+E.coli的生物學特性

從圖 2可以看出，F(xiàn)18ac+E.coli野生株、F18ac△fimH缺失株和F18ac△fimH/pfimH回補株在各個生長時期的生長曲線基本一致，表明fimH基因缺失不影響F18ac+E.coli的生長。

圖2 F18ac+E.coli生長曲線

FimH凝集素能夠與動物的紅細胞和酵母細胞發(fā)生明顯的凝集反應，并且該凝集現(xiàn)象能夠被8%的D-甘露糖抑制。F18ac+E.coli野生株能夠與2%豬血紅細胞和酵母細胞凝集，呈細小的顆粒狀或大塊的片狀，F(xiàn)18ac△fimH缺失株則對2%豬血紅細胞和酵母細胞均無凝集現(xiàn)象，而回補株的凝集能力得到恢復。

2.3 FimH黏附素促進F18ac+E.coli的黏附

F18ac+E.coli對新生仔豬小腸上皮細胞系IPEC-1和IPEC-J2均具有很好的黏附能力。與野生株相比，F(xiàn)18ac△fimH缺失株對上述2個細胞系的黏附能力均顯著下降。其中，F(xiàn)18ac△fimH缺失株對IPEC-1細胞的黏附能力僅為野生株黏附能力的57%(圖3)，對IPEC-J2細胞的黏附能力則僅為野生株黏附能力的36%(圖4)。F18ac△fimH/pfimH回補株的黏附能力則恢復至野生株水平。在黏附抑制試驗中，8% D-甘露糖能顯著抑制F18ac+E.coli對IPEC-1和IPEC-J2細胞的黏附(圖3、4)。上述結果表明，F(xiàn)imH黏附素是F18ac+E.coli重要的黏附因子。

*代表與野生株相比差異顯著(P≤0.05)，下圖同

圖4 IPEC-J2細胞黏附結果

2.4 FimH黏附素促進F18ac+E.coli體外生物被膜的形成

生物被膜定量檢測結果表明，與野生株相比，△fimH缺失株形成生物被膜的能力顯著下降，OD600分別為0.360和0.248，同樣當生物被膜誘導培養(yǎng)基中加入8%的D-甘露糖后，能顯著抑制F18ac+E.coli體外生物被膜的形成。在F18ac△fimH/pfimH回補株中，生物被膜形成能力恢復到了野生株約90%的水平(OD600為0.328)(圖 5)。

圖5 生物被膜定量檢測結果

3 結論與討論

FimH黏附素通過與宿主上皮細胞表面的甘露糖受體結合而介導細菌的黏附，因此，該黏附過程能被外源性的D-甘露糖所抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)基中添加8%的D-甘露糖時，F(xiàn)18ac+E.coli與IPEC-1和IPEC-J2細胞的黏附均被顯著抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與野生菌株相比，F(xiàn)18ac△fimH基因缺失株對IPEC-1和IPEC-J2細胞的黏附能力均顯著下降，而F18ac△fimH/pfimH回補株的黏附能力可恢復至野生株水平。F18ac菌毛和鞭毛是F18ac+E.coli重要的黏附因子[3-4]，所以，F(xiàn)imH黏附素缺失后并沒有完全廢除其黏附能力。上述結果表明，F(xiàn)imH黏附素在F18ac+E.coli黏附過程中發(fā)揮了重要的作用，是其重要的黏附因子之一。

越來越多的證據(jù)表明，Ⅰ型菌毛在生物被膜形成過程中發(fā)揮著重要的作用[8,12]。與F18ac+E.coli野生株相比，F(xiàn)18ac△fimH基因缺失株形成生物被膜的能力明顯減弱。此外，當生物被膜誘導培養(yǎng)基中添加8%的D-甘露糖時，野生株形成生物被膜的能力同樣能被抑制，這表明，F(xiàn)imH黏附素是F18ac+E.coli體外生物被膜形成的重要影響因素。

綜上，Ⅰ型菌毛的FimH黏附素在F18ac+E.coli的黏附和體外生物被膜形成過程中發(fā)揮著重要的作用，這有利于進一步加深對F18ac+E.coli引起PWD致病機制的認識，同時也為研制預防F18ac+E.coli感染的多價疫苗提供了新的策略。

[1] Bertschinger H U,Bachmann M,Mettler C,etal.Adhesive fimbriae producedinvivobyEscherichiacoliO139:K12 (B):H1 associated with enterotoxaemia in pigs [J].Vet Microbiol,1990,25(2/3):267-281.

[2] Nagy B,Whipp S C,Imberechts H,etal.Biological relationship between F18ab and F18ac fimbriae of enterotoxigenic and verotoxigenicEscherichiacolifrom weaned pigs with oedema disease or diarrhoea [J].Microb Pathog,1997,22:1-11.

[3] Duan Q D,Zhou M X,Zhu X F,etal.Flagella from F18+Escherichiacoliplay a role in adhesion to pig epithelial cell lines[J].Microb Pathog,2013,55:32-38.

[4] Frydendahl K.Prevalence of serogroups and virulence genes inEscherichiacoliassociated with post-weaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches [J].Vet Microbiol,2002,85:169-182.

[5] Ravi M,Ngeleka M,Kim S H,etal.Contribution of AIDA-I to the pathogenicity of a porcine diarrheagenicEscherichiacoliand to intestinal colonization through biofilm formation in pigs [J].Vet Microbiol,2007,120(3/4):308-319.

[6] Kaper J B,Nataro J P,Mobley H L.PathogenicEscherichiacoli[J].Nat Rev Microbiol,2004,2:123-140.

[7] Dreux N,Denizot J,Martinez-Medina M，etal.Point mutations in FimH adhesin of Crohn’s disease-associated adherent-invasiveEscherichiacolienhance intestinal inflammatory response[J].PLoS Pathog,2013,9(1):e1003141.

[8] Kuzminska-Bajor M,Grzymajio K,Ugorski M.Type 1 fimbriae are important factors limiting the dissemination and colonization of mice bySalmonellaEnteritidis and contribute to the induction of intestinal inflammation duringSalmonellainvasion[J].Front Microbiol,2015,6:276.

[9] Datsenko K A,Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640-6645.

[10] Allan B J,van den Hurk J V,Potter A A.Characterization ofEscherichiacoliisolated from cases of avian colibacillosis[J].Can J Vet Res,1993,57(3):146-151.

[11] Sokurenko E V,Courtney H S,Ohman D E,etal.FimH family of type 1 fimbrial adhesins:Functional heterogeneity due to minor sequence variations amongfimHgenes[J].J Bacteriol,1994,176(3):748-755.

[12] Grzymajlo K,Ugorski M,Kolenda R,etal.FimH adhesin from host unrestrictedSalmonellaEnteritidis binds to different glycoprotein ligands expressed by enterocytes from sheep,pig and cattle than FimH adhesins from host restrictedSalmonellaAbortus-ovis,SalmonellaCholeraesuis andSalmonellaDublin[J].Vet Microbiol,2013,166(3/4):550-557.

FimH Adhesins Contribute to F18ac+E.coliAdhesion and Biofilm FormationinVitro

DUAN Qiangde1,XU Baojiang2,WANG Lujun1,FU Hongqi1,ZHU Guoqiang3

(1.Weinan Vocational and Technical College,Weinan 714026,China; 2.Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

In order to investigate the role of fimH adhesins in the pathogenesis of F18ac+E.coli,F18ac△fimH isogenic mutant was generated by λ Red-based homologous recombination system.The adhesion and biofilm(BF) formation ability of F18ac△fimH mutant and wild-type strains were compared using aninvitropiglet epithelial cell infection model.In theinvitrobacterial adherence assay,our results showed that the isogenic F18ac△fimH mutant correlated with the significantly decreased adhesion to both porcine epithelial IPEC-1 and IPEC-J2 cells when compared with the F18ac+E.coliwild-type strains.In addition,the adherence of F18ac+E.colito these cell lines was also blocked by 8% D-mannose in the cell culture medium.In consistent with less adherence ability,the F18ac△fimH mutant also reduced their ability to form biofilm.These results indicated that fimH adhesins of type Ⅰ fimbriae play an important in F18ac+E.coliadhesion.

F18ac+E.coli; type Ⅰ fimbriae; FimH adhesins; adherence; biofilm

2016-10-20

渭南市科技創(chuàng)新項目(2013KYJ-3);陜西省科技新星項目(2015KJXX-97)

段強德(1983-)，男，湖南衡陽人，副教授，博士，主要從事動物基因疫苗的開發(fā)。E-mail:dqd8358@163.com

S852.61

A

1004-3268(2017)03-0134-04