河南地區(qū)NADC30-like PRRSV毒株的增殖特性與遺傳進(jìn)化分析

王林建，郭振華，喬松林，陳鑫鑫*，張改平*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002)

河南地區(qū)NADC30-like PRRSV毒株的增殖特性與遺傳進(jìn)化分析

王林建1,2，郭振華2，喬松林2，陳鑫鑫2*，張改平1,2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002)

為研究河南地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的流行特點(diǎn)和遺傳變異情況，采集河南省滑縣地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)發(fā)病豬場(chǎng)中的病料，經(jīng)研磨、稀釋、離心處理后將懸液上清接種于原代豬肺泡巨噬細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，結(jié)果顯示，PAM出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)，將得到的分離株命名為HNhx。應(yīng)用PRRSV N蛋白的特異抗體進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)，結(jié)果表明，接種HNhx分離株的PAM出現(xiàn)特異性熒光，證明該分離株為PRRSV。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)Nsp2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增分析，根據(jù)擴(kuò)增目的產(chǎn)物大小推測(cè)HNhx分離株為NADC30-like毒株。遺傳分析發(fā)現(xiàn)，與其他參考毒株相比，HNhx毒株的ORF3、ORF4和ORF5基因與NADC30毒株的同源性最高?；贠RF3、ORF4和ORF5序列構(gòu)建進(jìn)化樹,系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果表明，HNhx歸于NADC30-like亞群。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒； 分離； 鑒定； 序列分析

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以妊娠母豬流產(chǎn)和各年齡段豬呼吸障礙為主要特征的傳染病。上世紀(jì)80年代，該病首先出現(xiàn)在美國(guó)和加拿大，然后在全球范圍內(nèi)傳播，成為全球豬病控制上的一大難題[1-2]。自1995年我國(guó)首次報(bào)道PRRS以來(lái)，該病一直長(zhǎng)期流行[3-9]。尤其是2006年，由高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)引發(fā)的以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的疫情，對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成前所未有的打擊[10]。

PRRSV按基因型分為以VR-2332株為代表的北美洲型和以LV株為代表的歐洲型。2種基因型毒株之間引發(fā)的PRRS臨床癥狀相似，但是病毒的抗原性、基因組成及結(jié)構(gòu)存在較大的差異。PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬，其基因組全長(zhǎng)約15 kb，除去頭尾的5′UTR和3′UTR還包含10個(gè)開放閱讀框。ORF1a和ORF1b分別編碼pp1a和pp1ab 2種多聚蛋白，pp1a和pp1ab分別被酶切裂解為Nsp1α、Nsp1β、Nsp2—Nsp6、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8，以及Nsp9—Nsp12。ORF2a、ORF2b、ORF3—ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3—GP5、GP5a、M和N[11-12]。由于缺少校正酶，PRRSV在病毒復(fù)制過(guò)程中極易引入突變，因此，PRRSV是變異率最高的病毒之一。其中，Nsp2是不同毒株基因組之間差異最大的區(qū)域。與經(jīng)典毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2相比，HP-PRRSV的Nsp2存在30個(gè)不連續(xù)的氨基酸缺失，而2008年美國(guó)分離株NADC30則存在131個(gè)不連續(xù)的氨基酸缺失。這些不同數(shù)目氨基酸的缺失可以作為區(qū)分不同亞型毒株的分子標(biāo)志。

自2006年以來(lái)，HP-PRRSV毒株已成為國(guó)內(nèi)主要的流行毒株，但PRRSV存在較大的遺傳變異[13-14]。從2013年開始，多個(gè)省份相繼報(bào)道在豬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)了與美國(guó)NADC30毒株同源性很高的毒株，研究人員將其命名為NADC30-like毒株[15]。NADC30-like毒株Nsp2區(qū)存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。隨后的分子流行病學(xué)調(diào)查研究也顯示，NADC30-like毒株在我國(guó)多個(gè)地區(qū)逐漸呈流行態(tài)勢(shì)[16-17]。當(dāng)前，我國(guó)正在廣泛使用的商業(yè)化疫苗是以HP-PRRSV為親本的弱毒苗。有研究表明，這些疫苗不能提供有效的保護(hù)，免疫后的豬仍能被NADC30-like毒株感染。鑒于此，分離目前流行的NADC30-like毒株，并研究其致病性和進(jìn)化情況，以期為研制預(yù)防NADC30-like毒株的疫苗和實(shí)現(xiàn)對(duì)PRRS的整體防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒株與菌種

高致病性PRRSV毒株HN07-1、Marc-145細(xì)胞株均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。原代豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)取自6周齡左右大小的PRRSV陰性豬。將豬麻醉處死后，取出完整的肺部，無(wú)菌PBS緩沖液清洗肺部表面，用HBSS緩沖液經(jīng)氣管注入左右肺并且反復(fù)灌洗肺組織。收集灌洗液，400g離心15 min收集細(xì)胞，RPMI 1640培養(yǎng)液重懸洗滌2次，收集細(xì)胞用凍存液凍存，液氮保存。使用時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶中。JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Solarbio公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；Q5超保真聚合酶和T4連接酶購(gòu)自NEB公司；病毒基因組提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix、RACE 5′/3′試劑盒和pMD?19-T Simple載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自Abbkine公司；PRRSV N蛋白抗體由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 病毒的分離與增殖

疑似陽(yáng)性的病料經(jīng)研磨后按1︰10稀釋于RPMI 1640培養(yǎng)基中，-80 ℃反復(fù)凍融3次，4 000g離心10 min，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾后接種于PAM。37 ℃孵育1 h后，加入新鮮的含10%FBS和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基。在37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察病變情況。若無(wú)病變，反復(fù)凍融后轉(zhuǎn)接下一代直至出現(xiàn)病變。收集分離到的病毒，以不同的MOI的毒量接種于新的PAM，36 h后觀察細(xì)胞病變情況。

(2)壓縮機(jī)壓縮液化過(guò)程:10 m3儲(chǔ)罐內(nèi)的BOG經(jīng)閥門V2、2 m3儲(chǔ)罐內(nèi)的氣體經(jīng)閥門V3進(jìn)入壓縮機(jī)加壓后，經(jīng)閥門V5進(jìn)入10 m3儲(chǔ)罐液相空間;當(dāng)2 m3儲(chǔ)罐壓力降低時(shí)(罐內(nèi)氣體基本被抽空時(shí))，關(guān)閉閥門V3，打開閥門V1，繼續(xù)上述壓縮液化過(guò)程。

1.4 HNhx毒株間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)

接種PRRSV培養(yǎng)24 h后，棄掉PAM細(xì)胞的培養(yǎng)基，PBST洗滌后，用含2%雙氧水的甲醛溶液固定細(xì)胞。PBST洗滌3次后，加5%脫脂奶后于37 ℃封閉1 h，之后加入1︰2 000稀釋的鼠源抗PRRSV的N蛋白抗體，于37 ℃溫育1 h。PBST洗滌3次，加入1︰1 000稀釋的Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗于37 ℃溫育1 h。PBST洗滌3次后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 毒株鑒定

使用病毒基因組提取試劑盒提取病毒的總RNA，并按PrimeScript RT Master Mix操作步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用Nsp2鑒定引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增片段大小。并將目的片段克隆到pMD?19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。涂氨芐青霉素抗性的LB平板，于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 所用引物序列及產(chǎn)物大小

1.6 HNhx毒株生長(zhǎng)曲線繪制

將Marc-145細(xì)胞或者分離的原代PAM鋪滿6孔板，按MOI為0.1接種HNhx病毒。分別在接毒6、12、24、36、48、60、72、96 h后吸取100 μL培養(yǎng)上清，經(jīng)10倍梯度稀釋處理后，接種于培養(yǎng)單層PAM的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)120 h后，觀察CPE情況，按Reed-Mucnch法計(jì)算TCID50，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 HNhx毒株ORF3、ORF4和ORF5擴(kuò)增和測(cè)序

依據(jù)病毒基因組提取試劑盒使用說(shuō)明書從培養(yǎng)液中提取病毒總RNA，并按PrimeScript RT Master Mix操作步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用6對(duì)特異引物(表1)，以cDNA為模板，經(jīng)Q5超保真聚合酶擴(kuò)增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳并利用凝膠回收試劑盒回收得到目的片段。將目的片段連接到pMD?19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布到氨芐青霉素抗性的LB平板中，過(guò)夜培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

利用DNAMAN和DNAStar等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與CH-1R、JXA1、HB-1(sh)/2002、NADC30等參考毒株(表2)進(jìn)行核酸和氨基酸相似性分析。并使用MEGA 6.06軟件對(duì)分離毒株ORF3、ORF4和ORF5進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

表2 PRRSV參考毒株背景信息

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離與增殖結(jié)果

組織病料經(jīng)研磨、反復(fù)凍融和過(guò)濾后接種于原代PAM。放置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接下一代，直至第3代PAM開始裂解。PAM細(xì)胞病變達(dá)50%時(shí)，凍存于-80 ℃。反復(fù)凍融3次，過(guò)濾后保存病毒，并將其命名為HNhx毒株。使用PAM測(cè)定其病毒滴度為107.5TCID50/mL。以不同的MOI的毒量接種于新的PAM，36 h后可清楚觀察到PAM出現(xiàn)裂解、皺縮、脫落等PRRSV感染的典型病變(圖1)。

2.2 HNhx毒株IFA結(jié)果

以MOI為0.1的病毒量分別將HNhx與HN07-1毒株接種于PAM和Marc-145細(xì)胞，24 h后使用抗PRRSV N蛋白的特異性抗體進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果顯示，HNhx毒株和HN07-1毒株感染的PAM和Marc-145細(xì)胞均出現(xiàn)特異紅色熒光(圖2)，證明分離株HNhx確為PRRSV毒株。

2.3 HNhx毒株鑒定結(jié)果

從分離株培養(yǎng)液中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用能區(qū)分經(jīng)典毒株(C-PRRSV)、HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的特異引物Nsp2F/R(表1)進(jìn)行RT-PCR鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，HP-PRRSV、HN07-1毒株擴(kuò)增得到的目的片段大小為950 bp左右，而分離毒株擴(kuò)增得到目的片段約為647 bp，據(jù)此推測(cè)分離株可能為NADC30-like毒株(圖3)。為了進(jìn)一步確定毒株的分類，將目的片段進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。結(jié)果顯示，分離毒株與NADC30-like毒株有相似的特征，即在非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2區(qū)存在不連續(xù)的131個(gè)氨基酸的缺失。因此，可確定HNhx為NADC30-like毒株。

A.Mock；B.MOI=0.02；C.MOI=0.2；D.MOI=2

A.PAM；B.Marc-145

M.DL2000 DNA Marker；1.HNhx毒株Nsp2；2.HN07-1毒株Nsp2

2.4 HNhx毒株生長(zhǎng)曲線

HNhx毒株生長(zhǎng)曲線如圖4所示，在感染PAM 36 h后病毒滴度達(dá)到頂峰，之后開始緩慢降低。而HNhx毒株感染Marc-145細(xì)胞后，滴度緩慢上升，96 h達(dá)到107.5TCID50/mL。結(jié)果表明，HNhx毒株在PAM上具有更好的增殖特性，PRRSV感染Marc-145后，滴度較低，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，滴度緩慢升高。因此，推測(cè)HNhx經(jīng)多次繁殖后也可在Marc-145上適應(yīng)。

圖4 HNhx毒株生長(zhǎng)曲線

2.5 HNhx毒株ORF3、ORF4和ORF5基因擴(kuò)增結(jié)果

從分離株培養(yǎng)液中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用表1中引物擴(kuò)增HNhx毒株的ORF3、ORF4和ORF5基因。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，ORF3、ORF4、ORF5基因大小分別約為780、550、650 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

M.DL2000 DNA Marker；1.ORF3；2.ORF4；3.ORF5

2.6 HNhx毒株ORF3、ORF4和ORF5基因序列比對(duì)結(jié)果

將HNhx毒株的ORF3、ORF4和ORF5的基因序列與國(guó)內(nèi)外不同來(lái)源的PRRSV毒株(表2)序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸相似性分析。結(jié)果如表3、4所示，HNhx毒株與美國(guó)分離株NADC30的相似性最高，ORF3、ORF4和ORF5基因與NADC30毒株的相似性依次為94.51%、96.28%和94.20%，氨基酸序列相似性依次為93.79%、93.82%和92.50%。雖然同源性很高，但HNhx毒株和NADC30毒株之間仍然有6.21%、6.18%和7.50%的差異。而HNhx毒株ORF3、ORF4和ORF5基因與國(guó)內(nèi)流行的高致病性毒株JXA1的核酸相似性為82.35%、85.10%和84.08%，氨基酸相似性依次為79.92%、84.27%和83.00%。

表3 核酸序列相似性比較 %

表4 氨基酸序列相似性比較 %

2.7 HNhx毒株ORF3、ORF4和ORF5進(jìn)化樹構(gòu)建與分析結(jié)果

為了進(jìn)一步分析分離得到的PRRSV流行毒株HNhx與其他流行毒株在遺傳進(jìn)化上的關(guān)系，將其基因組變異較大的ORF3、ORF4和ORF5基因與國(guó)內(nèi)外主要流行的參考毒株(表2)分別建立系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果如圖6—8所示。HNhx毒株屬于NADC30-like PRRSV亞群，而NADC30-like PRRSV亞群中所有的毒株又被分為不同的分支，其中NDAC30和XW015位于同一分支，HNhx的ORF3和ORF4與HENAN-HEB在同一分支，而ORF5與FJY04和FJZ03在同一分支中。進(jìn)化關(guān)系上的差異顯示了NADC30-like PRRSVs分離株在我國(guó)的進(jìn)化情況。

圖6 基于分離毒株和參考毒株的ORF3基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖7 基于分離毒株和參考毒株的ORF4基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖8 基于分離毒株和參考毒株的ORF5基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

PRRSV長(zhǎng)期在我國(guó)流行，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。2006年，由HP-PRRSV引起的高熱、高死亡率的疫情，更是對(duì)我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成前所未有的打擊[4]。近期，我國(guó)多個(gè)省份又相繼爆發(fā)了PRRS疫情，研究發(fā)現(xiàn)，這是由北美地區(qū)輸入的NADC30毒株引起的。本研究從河南省滑縣地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)中采集陽(yáng)性病料，并成功分離到PRRSV毒株HNhx。IFA、RT-PCR試驗(yàn)和Nsp2序列比對(duì)分析結(jié)果證明，該分離毒株為目前流行的NADC30-like毒株。HNhx毒株體外生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，HNhx毒株的病毒滴度最高可以達(dá)到107.5TCID50/mL，并且與我國(guó)流行的高致病性毒株相似，能夠引起宿主細(xì)胞迅速產(chǎn)生明顯的病變。因此，HNhx毒株較強(qiáng)的復(fù)制能力可能是導(dǎo)致被感染豬出現(xiàn)急性癥狀的主要原因。

依據(jù)HNhx毒株ORF3、ORF4和ORF5核酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，HNhx毒株屬于NADC30-like PRRSV亞群。而NADC30-like PRRSV亞群中所有的毒株又被分為不同的分支，其中NDAC30和XW015位于同一分支，HNhx的ORF3和ORF4與HENAN-HEB在同一分支，而ORF5與FJY04和FJZ03在同一分支中。進(jìn)化距離和關(guān)系上的差異表明了NADC30-like PRRSV分離株進(jìn)化演變的復(fù)雜性。HNhx毒株ORF3、ORF4和ORF5核酸序列與JXA1(HP-PRRSV)的相似性依次為82.35%、85.10%和84.08%，序列比對(duì)結(jié)果表明，NADC30-like毒株與HP-PRRSV毒株之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而目前我國(guó)臨床上使用的疫苗主要是以HP-PRRSVs為親本研制的弱毒疫苗，所以臨床上正在廣泛使用的商業(yè)化疫苗并不能為免疫宿主提供有效保護(hù)，這可能是導(dǎo)致NADC30-like毒株在我國(guó)多個(gè)地區(qū)相繼流行的主要原因。

PRRSV的高度變異性是預(yù)防和治療PRRS極其困難的主要原因。對(duì)分離的HNhx毒株的ORF3、ORF4和ORF5氨基酸序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，與其他毒株相比，HNhx毒株的ORF3、ORF4和ORF5基因和氨基酸序列都與美國(guó)分離株NADC30毒株的相似性最高，但是他們之間仍然有6.21%、6.18%和7.50%的差異。核酸序列之間的差異性表明，HNhx毒株是由親本毒株NADC30流入后進(jìn)化演變而來(lái)。NADC30-like毒株不斷進(jìn)化和突變也加劇了PRRS防控的難度。

NADC30毒株的流入不僅增加了我國(guó)流行毒株的多樣性，且其變異速度快，易與其他毒株重組，進(jìn)一步增加了控制疫情的難度。分離河南地區(qū)流行的NADC30-like毒株，并進(jìn)行毒株特性研究和進(jìn)化分析，將為研制抵抗NADC30-like PRRSV毒株的疫苗，探索PRRSV感染機(jī)制及病原生物學(xué)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

[1] Baron T,Albina E,Leforban Y,etal.Report on the first outbreaks of the porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) in France.Diagnosis and viral isolation[J].Ann Rech Vet,1992,23(2):161-166.

[2] Wensvoort G,Terpstra C,Pol J M,etal.Mystery swine disease in the Netherlands:The isolation of Lelystad virus[J].Vet Q,1991,13(3):121-130.

[3] Zhou L,Yang H.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China[J].Virus Res,2010,154(1/2):31-37.

[4] 王小敏,何孔旺,周忠濤,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的分離鑒定及遺傳變異分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2014,29(1):232-238.

[5] 蔣志政,張改平,劉明陽(yáng),等.抗豬FcγRⅡb多抗阻斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體依賴增強(qiáng)作用研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,41(4):139-142,145.

[6] 侯婕,李睿,馬紅芳,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒入侵受體唾液酸黏附素的表達(dá)與純化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,45(3):130-134.

[7] 趙樸,鄭玉姝,趙坤,等.豬呼吸道疾病綜合征常見病毒多重PCR方法的建立及應(yīng)用[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2014,29(3):64-67.

[8] 張美玲,簡(jiǎn)子健,陸桂麗,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒新疆株的分離與鑒定[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,20(11):31-34.

[9] 韓一超,劉文俊,姚敬明,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒Shanxi-6株全基因序列分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2014,29(2):62-65.

[10] Tian K,Yu X,Zhao T,etal.Emergence of fatal PRRSV variants:Unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One,2007,2(6):e526.

[11] Johnson C R,Griggs T F,Gnanandarajah J,etal.Novel structural protein in porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by an alternative ORF5 present in all arteriviruses[J].J Gen Virol,2011,92(Pt 5):1107-1116.

[12] Stadejek T,Oleksiewicz M B,Potapchuk D,etal.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains of exceptional diversity in eastern Europe support the definition of new genetic subtypes[J].J Gen Virol,2006,87(Pt 7):1835-1841.

[13] 張明亮,張春杰,程相朝,等.豫西地區(qū)PRRSV新近流行株ORF5基因變異及Nsp2基因特征分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,41(1):137-141.

[14] 盧曉燕,周永輝,劉偉娟,等.豫西地區(qū)PRRSV豬繁殖與呼吸綜合征病毒河南分離株NSP2和GP5基因遺傳變異分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2012,27(2):100-104.

[15] Zhou L,Wang Z,Ding Y,etal.NADC30-like strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus,China[J].Emerg Infect Dis,2015,21(12):2256-2257.

[16] Zhao K,Ye C,Chang X B,etal.Importation and recombination are responsible for the latest emergence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].J Virol,2015,89(20): 10712-10716.

[17] Li Y,Ji G,Wang J,etal.Complete genome sequence of an NADC30-Like porcine reproductive and respiratory syndrome virus characterized by recombination with other strains[J].Genome Announc,2016,4(3):e00330-16.

Proliferation Characteristics and Phylogenetic Analysis of One NADC30-like PRRSV Strain Isolated in Henan

WANG Linjian1,2,GUO Zhenhua2,QIAO Songlin2,CHEN Xinxin2*,ZHANG Gaiping1,2*

(1.College of Life Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture/Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to investigate the epidemic characteristics and genetic diversity of PRRSV in Henan province,lungs from diseased pigs showing clinical signs suspected of PRRSV were collected from pig farm in Huaxian area of Henan province.The samples were homogenized,diluted and centrifuged and the obtained supernatants were inoculated into PAM to isolate PRRSV.PAM showed obvious cytopathic effect(CPE),which revealed that PRRSV strain was isolated and was named HNhx.The result of indirect immunofluorescence(IFA) showed that the PAM infected with HNhx were positive for N protein of PRRSV.The isolated HNhx strain was identified as a NADC30-like PRRSV by RT-PCR using specific primers of NSP2.Genetics analysis showed that ORF3,ORF4 and ORF5 shared highest similarity with NADC30,respectively.Moreover,phylogenetic tree based on ORF3,ORF4 or ORF5 revealed that the PRRSV strain HNhx was clustered into NADC30-like subgroup.

PRRSV; isolation; identification; sequence analysis

2016-09-16

國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(31490601);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(生豬)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金項(xiàng)目(CARS-36);河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(生豬)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(S2012-06)

王林建(1991-)，男，河南新鄉(xiāng)人，在讀碩士研究生，研究方向：分子病原學(xué)和免疫學(xué)。E-mail:wljgnn@126.com

*通訊作者：陳鑫鑫(1987-)，女，河南蘭考人，助理研究員，博士，主要從事動(dòng)物病毒疫病免疫機(jī)制研究。 E-mail:summerr_2016@163.com 張改平(1960-)，男，河南內(nèi)黃人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)及疫病快速檢測(cè)技術(shù)研究。 E-mail:zhanggaiping2003@163.com

S852.4

A

1004-3268(2017)03-0122-07