中藥治療硬皮病纖維化的分子機制研究

楚海燕+劉慶梅+屠文震+郭剛+吳文育+王久存

摘 要 系統(tǒng)性硬皮病是一種以皮膚及內(nèi)臟纖維化為顯著特征并有微循環(huán)改變的免疫性疾病。其病理機制不清晰，尚無FDA批準的有效治療手段，而中藥顯示了良好的治療效果。本文介紹中醫(yī)治療硬皮病的基礎(chǔ)研究，主要介紹本項目組近年在硬皮病纖維化中藥治療中的研究進展及成果。

關(guān)鍵詞 硬皮病 中藥 分子機制

中圖分類號：R593.25 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）S1-0063-04

Molecular mechanistic investigations into the treatment of Traditional Chinese Medicine for systemic sclerosis-related fibrosis*

Haiyan Chu1**， Qingmei Liu1， 2， Zhenwen Tu3， Gang Guo4， Wenyu Wu2***， Jiucun Wang1****（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438； 2. Department of Dermatology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai， 200040； 3. Department of Rheumatology， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai TCM-integrated Hospital， Shanghai， 200082； 4. Department of Rheumatology， Hebei Yiling Hospital， Shijiazhuang， 050091）

ABSTRACT Systemic sclerosis （Scleroderma， SSc） is a kind of severe autoimmune disease， characterized by fibrosis in skin and visceral organs. The underlying pathogenesis and mechanisms are still unknown. Furthermore， there is no FDAapproved effective therapeutic strategy， whereas traditional Chinese medicine （TCM） appears as a promising approach in SSc treatment recently. Here we review therapeutical benefits and possible mechanisms of TCM for the treatment and prevention of scleroderma-related fibrosis， mainly focusing on the results based on our current studies.

KEY WORDS Scleroderma； Traditional Chinese Medicine； Molecular Mechanism

硬皮?。╯cleroderma），又稱系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc），是一種復(fù)雜的纖維化疾病。自身免疫反應(yīng)（高免疫球蛋白血癥及血清中存在多種自身抗體）、血管病變（小血管內(nèi)膜損傷以及肢端、內(nèi)臟頻發(fā)雷諾現(xiàn)象）和皮膚、內(nèi)臟組織中的膠原纖維增生是導(dǎo)致硬皮病產(chǎn)生多系統(tǒng)損害的3大因素[1-2]。SSc患病率在結(jié)締組織病中僅次于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）位居第三位[3]。而內(nèi)臟器官的纖維化是引起硬皮病患者高死亡率的最重要因素，在美國，硬皮病的5年生存率為50%，與腫瘤相當[4-6]。對于硬皮病，以西藥為主的治療措施效果欠佳或不良反應(yīng)較大，迄今沒有任何美國食品藥品管理局（FDA）及我國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的硬皮病治療藥物。因此，尋找效果顯著且不良反應(yīng)小的硬皮病藥物已成為當務(wù)之急，同時需要對各種候選藥物的治療機制進行深入細致的研究。臨床結(jié)果顯示，中醫(yī)藥治療硬皮病具有獨特的療效，在一定程度上可改善硬皮病患者的生活質(zhì)量及生存率，中藥作為一種治療硬皮病的藥物逐漸得到人們的重視和認可。

1 硬皮病中醫(yī)療效初探

近年來，中藥治療硬皮病取得了較好的療效，活血化瘀和溫陽補腎兩類中藥對SSc患者皮膚成纖維細胞的增殖影響的研究已為臨床組方提供了客觀依據(jù)。為探討活血化瘀類中藥治療硬皮病的藥理機制，李明等[7]以體外培養(yǎng)的硬皮病患者皮膚成纖維細胞為研究對象，對21種活血化瘀類中藥的水溶性提取物對該細胞的影響進行了研究，結(jié)果顯示，其中17種藥物對該細胞增殖具有明顯抑制作用[8]。血管內(nèi)皮細胞的損傷是硬皮病另一重要病理過程，硬皮病的血管病變是免疫復(fù)合物介導(dǎo)的免疫損傷，血液中的免疫復(fù)合物沉積于血管壁，激活補體，通過一系列途徑，損傷血管內(nèi)皮細胞引發(fā)纖維化發(fā)生[9]?，F(xiàn)代實驗和臨床研究表明，桃仁、當歸、川芎等能降低血液黏度，改善微循環(huán)，修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，調(diào)節(jié)免疫功能，并能抑制成纖維細胞亢進的膠原合成，同時對膠原分解有促進作用，從而使硬化的結(jié)締組織軟化。

許多研究也已經(jīng)證明中藥單體對纖維化病變有較好的改善。黃芪可以抑制成纖維細胞的分泌功能，減少膠原合成，抑制膠原的沉積。對細胞免疫和抗體生成具有調(diào)節(jié)作用，能提高毛細血管抗損傷能力，并且有強心利尿、降血壓、保肝等作用[10]。丹參的化學(xué)成分復(fù)雜，其中已經(jīng)闡明的成分將近50種。其中脂溶性成分主要為丹參酮類型的二萜類化合物，如異參酮Ⅰ、Ⅱ、ⅡB等，隱丹參酮、左旋二氫丹參酮Ⅰ等；水溶性成分主要有丹參素、丹參酸乙、丹參酸丙、丹參酸A、丹參酸C、原二茶醛和迷迭香酸等。已有研究表明[11]，丹參注射液（水溶性提取物）、丹參素及原兒茶醛作用于正常人皮膚成纖維細胞24 h后，對該細胞Ⅰ、Ⅲ 型前膠原mRNA表達具有顯著抑制作用，對膠原酶mRNA表達具有顯著促進作用，并可通過增加膠原酶的產(chǎn)生或增強膠原酶的活性而促進膠原降解。

2 中藥復(fù)方治療硬皮病皮膚纖維化成果

近年來本研究組也對中藥作用于硬皮病的療效及作用機制進行了研究探索，并有以下研究發(fā)現(xiàn)。

上海中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，益氣活血中藥聯(lián)合青霉胺小劑量遞加療法治療系統(tǒng)性硬皮病，對其皮膚硬化、雷諾現(xiàn)象、肺纖維化均有明顯的改善，且不良反應(yīng)較西藥組低[12]，在此基礎(chǔ)上本實驗室探討了益氣活血中藥復(fù)方在皮膚纖維化小鼠模型上的作用。益氣活血復(fù)方由黃芪、丹參、當歸等12味中藥組成。在給予博萊霉素且硬皮病尚未發(fā)生的同時（預(yù)防組）及只給予博萊霉素發(fā)生硬皮病之后（治療組），分別給與小鼠不同藥物治療，以觀察益氣活血復(fù)方對硬皮病治療的作用。用益氣活血復(fù)方治療模型小鼠，獲得目標組織，分別在基因表達水平、蛋白表達水平（膠原蛋白含量）及組織學(xué)水平進行檢測。結(jié)果表明，注射博萊霉素處的小鼠皮膚膠原蛋白的表達及膠原含量顯著增加，而預(yù)防性給藥、治療給藥時復(fù)方都可顯著降低膠原蛋白等細胞外基質(zhì)的表達及膠原蛋白的含量以及肌成纖維細胞增殖分化，可緩解病理組織變化。

此外，本項目組培養(yǎng)了硬皮病患者和正常人皮膚成纖維細胞，對比發(fā)現(xiàn)硬皮患者細胞可高表達膠原產(chǎn)生的相關(guān)基因，而利用復(fù)方處理患者成纖維細胞，結(jié)果顯示，復(fù)方可抑制膠原等細胞外基質(zhì)基因表達和膠原蛋白含量。進而利用TGF-β （transforming growth factor-beita）刺激NIH/3T3成纖維細胞建立的體外硬皮病成纖維細胞模型進行實驗，發(fā)現(xiàn)復(fù)方仍可抑制TGF-β誘導(dǎo)的與膠原產(chǎn)生相關(guān)的基因的高表達。在TGF-β信號通路中，SMAD3作為一個重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其磷酸化水平直接關(guān)系著TGF-β信號通路的活性，也就影響著受TGF-β信號通路調(diào)節(jié)的下游細胞外基質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄活性。另外，在膠原啟動子區(qū)域包含一段Smad蛋白結(jié)合元件（Smadbinding element， SBE）序列，介導(dǎo)了TGF-β信號通路對于膠原基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。我們檢測了SMAD3蛋白在不同處理情況下的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過中藥處理之后SMAD3蛋白的磷酸化水平顯著下降，說明中藥治療能夠?qū)⑾到y(tǒng)性硬皮病中異常激活的TGF-β信號通路恢復(fù)到較為正常的水平。另外，中藥處理之后膠原啟動子區(qū)SBE的活性也顯著降低。綜上所述，中藥可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路中SMADs蛋白的磷酸化水平，從而降低了膠原基因啟動子區(qū)SBE的活性，由此降低膠原生成，最終緩解系統(tǒng)性硬皮病纖維化的發(fā)生和發(fā)展[5]。因此，實驗研究證實益氣活血復(fù)方對硬皮病有獨特療效，并闡明其作用機制是通過抑制TGF-β信號通路而實現(xiàn)抑制皮膚纖維化。

3 中藥復(fù)方制劑治療硬皮病肺纖維化研究成果

硬皮病兼具皮膚纖維化和危害性極大的肺纖維化或其它內(nèi)臟的纖維化，是典型的纖維化疾病。肺是硬皮病常累及的器官之一，肺間質(zhì)性病變或肺纖維化是硬皮病死亡的主要原因。中醫(yī)在對肺纖維化的病因、病機、病理變化等理論方面也進行了一定闡明。在中醫(yī)學(xué)中無肺纖維化病名。但其臨床表現(xiàn)可散見于中醫(yī)學(xué)古醫(yī)籍中，本病應(yīng)歸屬中醫(yī)的“肺痹”的范疇[13]?，F(xiàn)代醫(yī)家對本病的病因病機也有一定的認識歸納：早期各種外界邪毒感染機體，造成氣虛，而痰淤阻絡(luò)，津血不足，絡(luò)虛失養(yǎng)，遷延不愈而導(dǎo)致纖維化發(fā)生[14]。已在多種肺纖維化的動物模型上證明丹參、當歸、雷公藤、銀杏葉制劑等能夠明顯抑制肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展[15]。

河北以嶺醫(yī)院根據(jù)臨床經(jīng)驗總結(jié)出了對硬皮病患者肺纖維化有顯著療效的參麥開肺散（Shenks）中藥制劑，該制劑由西洋參、麥冬、半枝蓮等組成，臨床實踐顯示，Shenks能明顯改善硬皮病相關(guān)肺纖維化患者的臨床癥狀及中醫(yī)癥候如氣短、咳嗽、痰量、乏力、舌質(zhì)和舌苔等，通過調(diào)節(jié)患者體內(nèi)促纖維化細胞因子及抑纖維化細胞因子的平衡，從而有效改善纖維化的進程，改善患者肺功能，提高生活質(zhì)量，同時血、尿、便常規(guī)、肝腎功能、心電圖和空腹血糖等安全性指標均為正常水平，證明了Shenks的安全性[16] 。

我們建立硬皮病纖維化不同時期的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)無論是預(yù)防性給藥還是治療性給藥，Shenks均可有效緩解博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，可抑制肺組織中炎性細胞浸潤，膠原纖維蛋白沉積；可顯著抑制博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺組織中膠原基因表達；此外，Shenks可抑制促纖維化（Ctgf、Tgf-β）及促炎（Tnf-α、Il-1β）因子的表達，同時可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（metallopeptidase inhibitor 1， Timp1）的表達，提示Shenks可促進膠原蛋白的降解而抑制纖維化發(fā)生。同時，本項目選用環(huán)磷酰胺為陽性對照藥物，以評估Shenks的療效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shenks效果與環(huán)磷酰胺相當。在明確Shenks可有效緩解體內(nèi)外硬皮病相關(guān)肺纖維化的基礎(chǔ)上，對其治療機制進行了深入研究。由于正常人體肺組織存在著氧化、抗氧化的平衡，可消除吸入的或炎癥細胞釋放的氧活性物質(zhì)。纖維化性肺泡炎時，氧代謝活性產(chǎn)物大量增加，使氧化、抗氧化物質(zhì)失衡，造成肺組織的氧化損傷，促進肺纖維化的發(fā)生[17]。我們針對Shenks在抗氧化損傷方面的功能及機制進行體內(nèi)、體外實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其抑制氧化損傷基因（Nox-4、Rac-1）表達的同時增加抗氧化相關(guān)基因（Gclc、Ec-sod）的表達，調(diào)節(jié)還原型谷胱甘肽（GSH）水平，抑制TGF-β信號通路，降低TGF-β誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生及氧化損傷（表現(xiàn)為抑制蛋白及脂質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物水平），阻止博萊霉素造成的小鼠肺組織的氧化損傷，從而緩解纖維化。

4 中藥單體分子治療硬皮病纖維化研究成果

在以上研究的基礎(chǔ)上，我們還對益氣活血復(fù)方中主要成分丹參的單體分子對硬皮病纖維化的作用進行了細致的研究[18]。在NIH/3T3成纖維細胞中益氣活血復(fù)方顯著抑制TGF-β增高的SBE活性。進一步檢測扣除方及各單方對SBE活性的影響，結(jié)果表明，在12味中藥中丹參對SBE活性的抑制作用最強，與益氣活血復(fù)方相當；而益氣活血復(fù)方扣除丹參后抑制SBE活性的能力顯著降低?？梢?，丹參是益氣活血復(fù)方抑制TGF-β信號通路的關(guān)鍵成分。而丹酚酸B（salvianolic acid B， SAB）是丹參中含量最高的水溶性組分（約8%），也是目前上市的從丹參中提煉出的唯一的一種單體成分。此外，丹參也是Shenks制劑中的主要成分。

本研究組利用體內(nèi)、體外實驗對其進行了細致研究。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，SAB抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥細胞浸潤，減少肺組織膠原沉積，降低膠原及促纖維化基因表達。體外實驗針對3類肺纖維化發(fā)生相關(guān)細胞進行研究，結(jié)果如下：①成纖維細胞是產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的主要細胞，SAB抑制成纖維細胞的增殖，降低TNF-α誘導(dǎo)的細胞炎癥基因的表達，且抑制作用可能是通過NF-κB通路而實現(xiàn)，抑制TGF-β增高的膠原表達及促纖維化基因表達，且該作用可能與其抑制TGF-β誘導(dǎo)的ERK及JNK的磷酸化相關(guān)；②上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是成纖維細胞的一個來源，對于肺纖維化發(fā)生有重要貢獻，利用肺上皮細胞A549研究表明，TGF-β聯(lián)合TNF-α可成功誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT，而SAB可抑制EMT細胞表型變化及EMT標志基因和蛋白的表達，Western blot 結(jié)果顯示，SAB可能是通過降低ERK及JNK的磷酸化發(fā)揮抑制EMT的作用；③內(nèi)皮細胞損傷被認為是肺纖維化發(fā)生的始動因素，而內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-tomesenchymal transition， EndoMT）是成纖維細胞的另一來源，應(yīng)用H2O2處理EA.hy926細胞建立內(nèi)皮細胞損傷模型，利用TGF-β處理EA.hy926細胞建立EndoMT細胞模型，內(nèi)皮細胞研究結(jié)果顯示，SAB可抑制H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷凋亡，增加H2O2抑制的緊密連接相關(guān)基因表達，進一步研究表明，SAB可能是通過抑制H2O2誘導(dǎo)ERK信號通路活化從而對內(nèi)皮細胞的氧化損傷發(fā)揮保護作用，此外，顯微鏡檢結(jié)果顯示，SAB可抑制TGF-β誘導(dǎo)的EA.hy926內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)化。因此，SAB有良好的抗纖維化效果且是通過調(diào)節(jié)促纖維化通路及抑制內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化而實現(xiàn)。

5 結(jié)語

以上研究結(jié)果充分顯示了中藥復(fù)方及中藥單體在硬皮病纖維化治療中有著顯著的療效及廣闊的臨床應(yīng)用前景。系統(tǒng)性硬皮病屬于體內(nèi)微環(huán)境紊亂，從而導(dǎo)致多種器官、系統(tǒng)代謝異常。在中國文化傳統(tǒng)中，中醫(yī)學(xué)極為崇尚“陰陽調(diào)和”理論，所謂“陰陽”，即指新陳代謝。系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)生正是因為內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到了嚴重的擾亂，而中藥正是根據(jù)“陰陽調(diào)和”進行配伍。因此，中藥由于其溫和的藥性及眾多成分，兼顧調(diào)控纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激等一系列通路，能夠?qū)ο到y(tǒng)性硬皮病這一類病因極其復(fù)雜的疾病發(fā)揮多途徑和多靶點的綜合作用優(yōu)勢。

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