響應面法優(yōu)化血管保健果醋發(fā)酵工藝參數(shù)

王鋒，孫科

(1.徐州生物工程職業(yè)技術學院 生物工程系，江蘇 徐州 221006；2.徐州生物職業(yè)技術學院高教研究所，江蘇 徐州 221006)

山楂富含多種有機酸和黃酮類化合物，具有舒張血管、調(diào)節(jié)心機、增大冠狀動脈血流量、降低膽固醇和降血壓等作用[1]。木耳具有疏通血管、清除血管中膽固醇、降血糖、降血脂、防止血栓形成，預防腦血管疾病的發(fā)生等作用[2]。紅棗有很好的增強肌力、消除疲勞、擴張血管、增加心肌收縮力、改善心肌營養(yǎng)等作用[3]。把山楂、木耳、紅棗和生姜按一定比例混合，具有很好的疏通血管、降血壓、降血脂的作用[4]。果醋飲品也具有調(diào)節(jié)酸堿平衡、降血壓、降血脂、促進血液循環(huán)等功效[5]。在山楂果醋的釀造過程中，按比例加入木耳、紅棗和生姜會提高果醋的血管保健作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂、木耳、生姜、紅棗、蔗糖：市售；葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌、醋酸菌XZSW001：徐州生物工程職業(yè)技術學院生物工程實訓中心保藏；果膠酶：上海玉博生物科技有限公司；抗壞血酸(分析純)：上海譜振生物科技有限公司；焦亞硫酸鈉(分析純)：上海宏順生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基：上海創(chuàng)賽科技有限公司；麥芽汁培養(yǎng)基：上海谷研生物科技有限公司。

1.2 設備與儀器

20 L小型發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司；AX324ZH型奧豪斯電子天平 上海奔普儀器科技有限公司；PHS-3C型pH計 上海鼎科科學儀器有限公司；JHY-120ET型酒精計 廈門金河源科技有限公司；PAL-3型糖度儀 深圳市白鰭豚生物科技有限公司；JK-JH01型單人(單面)垂直超凈工作臺 安徽杰克歐德實驗室設備有限公司；小型粉碎機 濟南天宇專用設備有限公司；小型切片機 興化市祥和制藥機械有限公司；小型打漿機 杭州億大科技實業(yè)有限公司。

1.3 方法

酒精發(fā)酵過程中以酒精產(chǎn)生量(%)和乳酸產(chǎn)生量(g/L)為研究對象，考察了接種量(%)、初始pH值、初始糖度(%)和發(fā)酵溫度(℃)4個因素對結(jié)果的影響，通過單因素試驗和正交試驗得出酒精發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵條件組合。

醋酸發(fā)酵過程中以果醋專家感官綜合評分為研究對象，考察了接種量(%)、酒精濃度(%)和發(fā)酵溫度(℃)3個因素對結(jié)果的影響，通過單因素試驗和響應面優(yōu)化方法得出醋酸發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件。

1.3.1 工藝流程

1.3.2 酒精發(fā)酵試驗

1.3.2.1 乳酸菌接種量的確定

乳酸菌和酵母菌生活條件相似，代謝產(chǎn)物相互影響、相互制約。乳酸菌和酵母菌混菌發(fā)酵，可以改良醋酸的口感，增加醋酸的風味?；炀l(fā)酵的關鍵是確定二者的比例關系，在酵母菌接種量為2.5%，初始糖度為18%，初始pH值為4.5，發(fā)酵溫度為29 ℃的情況下，調(diào)整乳酸菌的接種量分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，發(fā)酵結(jié)束后測定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.2 初始pH值的確定

乳酸菌和酵母菌都是酸性菌，發(fā)酵的pH值相近，混菌發(fā)酵時要綜合考慮兩種菌都適宜的pH值。在酵母菌接種量為2.5%，乳酸菌接種量為1.5%，發(fā)酵溫度為29 ℃的情況下，設定發(fā)酵初始pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，發(fā)酵結(jié)束后分別測定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.3 初始糖度的確定

在酵母菌接種量為2.5%，乳酸菌接種量為1.5%，初始pH值為4.5，發(fā)酵溫度為29 ℃情況下，設定初始糖度為10%，12%，14%，16%，18%，20%，發(fā)酵結(jié)束后分別測定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.4 發(fā)酵溫度的確定

在酵母菌接種量為2.5%，乳酸菌接種量為1.5%，初始糖度為18%，初始pH值為4.5情況下，設定發(fā)酵溫度為21，23，25，27，29，31 ℃，發(fā)酵結(jié)束后分別測定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇乳酸菌接種量(A)、初始pH值(B)、初始糖度(C)和發(fā)酵溫度(D)4個因素，以酒精度為評價指標進行L9(34)正交試驗，從而確定最優(yōu)的酒精發(fā)酵工藝條件。正交因素和水平見表1。

表1 酒精發(fā)酵正交因素水平表Table 1 Factors and levels of alcohol fermentation orthogonal test

1.3.3 醋酸發(fā)酵試驗

1.3.3.1 接種量的確定

在初始酒精度為9.0%，發(fā)酵溫度為32 ℃情況下，設定醋酸菌的接種量分別為2%，4%，6%，8%，10%，12%，發(fā)酵結(jié)束后計算果醋專家感官綜合評分。

1.3.3.2 初始酒精度的確定

在醋酸菌接種量為8.0%，發(fā)酵溫度為32 ℃情況下，調(diào)整初始酒精度分別為2%，4%，6%，8%，10%，12%，發(fā)酵結(jié)束后計算果醋專家感官綜合評分。

1.3.3.3 發(fā)酵溫度的確定

在醋酸菌接種量為8.0%，初始酒精度為9.0%情況下，設定發(fā)酵溫度分別為24，26，28，30，32，34 ℃，發(fā)酵結(jié)束后計算果醋專家感官綜合評分。

以醋酸菌接種量、初始酒精度和發(fā)酵溫度為影響因素，專家感官綜合評分為考察指標，設計響應面試驗。

1.3.4 測定方法

酒精含量的測定：化學氧化法[6]；乳酸含量的測定：內(nèi)標氣相色譜法[7]；總糖含量的測定：斐林試劑法；總酸的測定：酸堿中和滴定法。

果醋感官評分見表2[8]。

表2 果醋感官評分表Table 2 Fruit vinegar sensory score

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵的單因素試驗

2.1.1 乳酸菌接種量對酒精發(fā)酵的影響

乳酸菌的接種量對酒精發(fā)酵的影響結(jié)果見圖1。

圖1 乳酸菌接種量對酒精發(fā)酵和乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of lactic acid bacteria inoculum size on alcoholfermentation and lactic acid production

由圖1可知，乳酸菌的接種量從0.5%逐步增加到3%時，酒精的產(chǎn)出量逐漸從9.6%減少到5.5%，而乳酸的產(chǎn)生量卻逐漸從1.4 g/L增加到3.3 g/L。當乳酸菌接種量為2.0%時，乳酸菌和酵母菌協(xié)同發(fā)酵的效果最好，酒精度為7.3%，乳酸產(chǎn)生量為3.1 g/L。是說乳酸菌的接種量為2.0%時，對酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵最適宜。

2.1.2 初始pH值對酒精發(fā)酵的影響

初始pH值對酒精發(fā)酵的影響結(jié)果見圖2。

圖2 初始pH值對酒精發(fā)酵和乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of initial pH values on alcohol fermentation and lactic acid production

由圖2可知，初始pH值從3.0增加到5.5時，酒精的產(chǎn)生量和乳酸的產(chǎn)生量都呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢。當初始pH值為4.5時，酒精的產(chǎn)生量和乳酸的產(chǎn)生量同時達到最高值，分別為9.6%和3.3 g/L，即初始pH值為4.5時，對酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵最適宜。

2.1.3 初始糖度對酒精發(fā)酵的影響

初始糖度對酒精發(fā)酵的影響結(jié)果見圖3。

圖3 初始糖度對酒精發(fā)酵和乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of initial sugar content on alcohol fermentation and lactic acid production

由圖3可知，初始糖度從10%增加到20%過程中，酒精的產(chǎn)生量是逐漸增加的，而乳酸的產(chǎn)生量呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢。當初始糖度為16%時，酒精的產(chǎn)生量為9.5%，乳酸的產(chǎn)生量為3.3 g/L。酒精度過高或過低都會影響菌種的發(fā)酵，所以初始糖度為16%時，對酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵最適宜。

2.1.4 溫度對酒精發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度對酒精發(fā)酵的影響結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對酒精發(fā)酵和乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on alcohol fermentation and lactic acid production

由圖4可知，發(fā)酵溫度從21 ℃增加到32 ℃過程中，酒精的產(chǎn)生量是先逐漸增加后減小的趨勢但幅度很小，乳酸的產(chǎn)生量也呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢，但比較劇烈。當發(fā)酵溫度為29 ℃時，酒精的產(chǎn)生量為9.8%，乳酸的產(chǎn)生量為3.4 g/L。酒精產(chǎn)生量和乳酸產(chǎn)生量都達到最大，所以發(fā)酵溫度為29 ℃時，對酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵最適宜。

2.2 酒精發(fā)酵的正交試驗

根據(jù)以上的單因素試驗結(jié)果，設計正交試驗，以確定最佳的酒精發(fā)酵工藝條件，正交試驗設計表見表3。

表3 酒精發(fā)酵正交試驗及結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments foralcoholic fermentation

由表3可知，混菌酒精發(fā)酵最優(yōu)的條件組合是：A2B2C2D2，即乳酸菌接種量為2.0%，初始pH值為4.5，初始糖度為16%，發(fā)酵溫度為29 ℃。由表3還可知4個因素對酒精產(chǎn)量和乳酸產(chǎn)量影響的順序為：D>A>B>C，即發(fā)酵溫度>乳酸菌接種量>初始pH值>初始糖度。對混菌發(fā)酵的最優(yōu)組合A2B2C2D2進行3組平行試驗驗證，發(fā)酵結(jié)果為酒精度9.6%，乳酸產(chǎn)量3.4 g/L。

2.3 醋酸發(fā)酵的單因素試驗

2.3.1 醋酸菌接種量對總酸度的影響

醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響結(jié)果見圖5。

圖5 醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of acetic acid bacteria inoculation amounton acetic acid fermentation

由圖5可知，發(fā)酵液的總酸度隨著醋酸菌接種量的增加逐漸增大，接種量從2%增加到12%的過程中，總酸度從2.9%增大到5.9%。但總酸度的增加呈逐漸變緩趨勢，綜合考慮成本因素，醋酸菌接種量取10%，對醋酸發(fā)酵最適宜。

2.3.2 初始酒精度對總酸度的影響

初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響結(jié)果見圖6。

圖6 初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation

由圖6可知，發(fā)酵液的總酸度隨著初始酒精度的增加呈現(xiàn)先增加然后減少的趨勢，初始酒精度為10%時，總酸度最大，為5.9 mL/dL。因為酒精度增加會抑制菌種的活性，所以初始酒精度取10%，對醋酸發(fā)酵最適宜。

2.3.3 發(fā)酵溫度對總酸度的影響

發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響結(jié)果見圖7。

圖7發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effect on fermentation temperature on acetic acid fermentation

由圖7可知，發(fā)酵液的總酸度隨著發(fā)酵溫度的增加呈現(xiàn)出先增加然后迅速減少的趨勢，發(fā)酵溫度為30 ℃時，總酸度最大為5.8 mL/dL，因為溫度增加會抑制菌種的活性，所以發(fā)酵溫度取30 ℃，對醋酸發(fā)酵最適宜。

2.4 醋酸發(fā)酵的響應面試驗[9,10]

2.4.1 醋酸發(fā)酵的響應面試驗設計因素與水平

以單因素試驗為依據(jù)，設計醋酸發(fā)酵的響應面設計因素水平，見表4。

表4 醋酸發(fā)酵響應面設計因素水平表Table 4 Factors and levels of response surface methodology on acetic acid fermentation

2.4.2 醋酸發(fā)酵的響應面試驗結(jié)果與方差分析

醋酸發(fā)酵響應面試驗結(jié)果見表5。

表5 醋酸發(fā)酵響應面試驗設計及結(jié)果Table 5 The response surface design and experimental results on acetic acid fermentation

醋酸發(fā)酵響應面試驗方差分析見表4。

表6 醋酸發(fā)酵響應面試驗方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis of response surface methodology on acetic acid fermentation

注：“*”表示差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由表6可知,模型的P值<0.0001，表明回歸性極顯著；失擬項F值(0.79)>0.05，表明影響不顯著；可行度分析R2=93.62%，表明該模式能夠解釋93.62%的醋酸發(fā)酵變化。所以該模型的擬合度較好，實驗的誤差較小，能代替真實的試驗對醋酸發(fā)酵工藝條件進行分析預測。由表6可知，發(fā)酵參數(shù)A,C,A2,C2和BC對最后果醋專家的綜合評分影響極顯著，B和B2專家綜合評分影響顯著，而AB和AC對專家的綜合評分影響不顯著。

2.4.3 醋酸發(fā)酵的響應面試驗各因素之間交互作用分析

醋酸發(fā)酵各因素之間交互作用對專家綜合評分的影響見圖8～圖10。

圖8 酒精度和接種量對專家評分的影響Fig.8 Effect of alcohol content and inoculum size on the expert evaluation

圖9 溫度和接種量對專家評分的影響Fig.9 Effect of temperature and inoculum size on the expert evaluation

圖10 溫度和酒精度對專家評分的影響Fig.10 Effect of temperature and alcohol content on the expert evaluation

2.4.4 醋酸發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)確定

以軟件Design-Expert 9.0 對模型進行回歸分析可以發(fā)現(xiàn)：當回歸模型值最大時，接種量(A)為9.88%，初始酒精度(B)為10.32%，發(fā)酵溫度(C)為30.18 ℃，此時的專家平均評分為98.6分。結(jié)合實際情況以及為了操作方便，接種量按10%、初始酒精度按10%、發(fā)酵溫度按30 ℃進行3次平行試驗，專家的綜合評分為98.2分，與預測值98.5分非常接近，表明該模型能非常好地預測發(fā)酵實際情況。

3 結(jié)論

通過單因素試驗確定血管保健醋的酒精發(fā)酵影響參數(shù)：乳酸菌接種、初始糖度、初始pH值和發(fā)酵溫度的大致范圍，然后通過正交試驗確定酒精發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)：乳酸菌接種量為2.0%，初始pH值為4.5，初始糖度為16%，發(fā)酵溫度為29 ℃。在第二階段醋酸發(fā)酵過程，首先通過單因素試驗確定醋酸發(fā)酵的影響參數(shù)：醋酸菌接種量、初始酒精度和發(fā)酵溫度的大致范圍，然后通過響應面方法確定醋酸發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)：醋酸菌接種量為10%，初始酒精度為10%，發(fā)酵溫度為30 ℃。