DNA甲基化檢測方法及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

聶燕釵，俞麗娟，管樺，趙穎，榮海博，姜伯瑋，張濤

（公安部第一研究所，北京 100022）

DNA甲基化檢測方法及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

聶燕釵，俞麗娟，管樺，趙穎，榮海博，姜伯瑋，張濤

（公安部第一研究所，北京 100022）

DNA甲基化是表觀遺傳標(biāo)記的重要組成部分，參與基因表達(dá)的調(diào)控，在生物發(fā)育、衰老以及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。由于具有相對穩(wěn)定性、可遺傳、含量豐富、隨齡變化等特點(diǎn)，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，DNA甲基化可以作為DNA序列相關(guān)經(jīng)典遺傳標(biāo)記的有效補(bǔ)充，用于年齡推斷、組織體液來源檢測、同卵雙生子的鑒定等。DNA甲基化的檢測方法主要有基于甲基化敏感限制性內(nèi)切酶、重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化以及甲基化CpG結(jié)合蛋白等原理而建立的一系列方法，近年研究表明，第三代測序技術(shù)也可用于DNA甲基化檢測。本文就DNA甲基化檢測方法及在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)行回顧與綜述，以期為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐提供參考。

法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA甲基化；綜述；雙生，單卵；三代測序

表觀遺傳學(xué)（epigenetics）是研究DNA序列不變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生可遺傳變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科[1]，主要包括DNA甲基化、染色質(zhì)重組、組蛋白修飾等，與印記基因形成、基因沉默、X染色體失活、胚胎發(fā)育（干細(xì)胞分化）及腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。其中，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要的遺傳修飾形式，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine，SAM）為甲基供體，將甲基添加到CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）。在人基因組中，約有3×107個CpG位點(diǎn)，據(jù)估計(jì)，約60%～90%的CpG處于甲基化狀態(tài)，而處于去甲基化狀態(tài)的CpG大都成簇出現(xiàn)，被稱為CpG島，位于基因啟動子區(qū)，參與基因表達(dá)的調(diào)控[2]。一般認(rèn)為，DNA甲基化對基因的表達(dá)是抑制的。本研究根據(jù)近年來對DNA甲基化的研究成果，對人類DNA甲基化的特點(diǎn)、檢測方法的進(jìn)展以及在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化的特點(diǎn)

1.1 多態(tài)性標(biāo)記

一般認(rèn)為，DNA甲基化在基因組中有兩種存在形式，即甲基化和去甲基化，表現(xiàn)出類似SNP“二等位基因”的狀態(tài)（二態(tài)性）。然而與SNP的“二態(tài)性”所不同的是，同一CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)在不同組織、不同細(xì)胞間有可能不同，因此將DNA甲基化分為低甲基化、中等程度甲基化和高甲基化三種狀態(tài)。新近有研究表明，甲基化的CpG在去甲基化過程中會產(chǎn)生中間產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）、5-甲?；撗醢奏ぃ?-formyldeoxycytydine，5-fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxydeoxycytidine，5caC）[3，4]，其中，5-hmC被稱為“第六種堿基”[5]。假使5-hmC在基因組中含量豐富，且有成熟的檢測方法，那么檢測DNA甲基化所獲得的多態(tài)性信息量則更為豐富。

1.2 隨齡變化

DNA甲基化與年齡之間存在一定的相關(guān)性。有研究證明，隨著年齡的增長，人類總體DNA甲基化水平下降[6，7]，在細(xì)胞分化的過程中，DNA保持甲基化的能力降低[8]。然而也有研究[9，10]表明，在基因組整體甲基化水平降低的同時(shí)，也伴有一些基因甲基化水平增高的現(xiàn)象，比如在中樞組織中DNA甲基化水平隨著年齡的增長而上升。

1.3 組織特異性

胚胎細(xì)胞中基因調(diào)控區(qū)的CpG島區(qū)域不存在甲基化，在個體發(fā)育過程中逐步形成相應(yīng)的甲基化模式，用以調(diào)控基因的差異化表達(dá)。全基因組研究發(fā)現(xiàn)，在染色體的特定位置上存在組織特異性差異甲基化區(qū)域（tissue-specific differentially methylated regions，tDMR），在不同細(xì)胞核組織中表現(xiàn)出不同的甲基化模式[11-13]。

1.4 親源特異性

DNA甲基化作為一種共價(jià)標(biāo)記，參與印跡基因的形成。所謂印跡基因是指一方親本來源的同源基因表達(dá)，而另一方不表達(dá)。人類是二倍體，基因拷貝一個來自父親，一個來自母親。大多數(shù)情況下兩個等位基因是同等表達(dá)。但對于少部分基因，在父親或母親傳遞給子代時(shí)發(fā)生了DNA甲基化修飾，由此造成了一方基因表達(dá)沉默，兩個等位基因表現(xiàn)出親源依賴性的表達(dá)特性[14]。

2 DNA甲基化的檢測方法

根據(jù)檢測目的的不同，DNA甲基化的檢測方法可以分為針對單個位點(diǎn)和整個基因組的甲基化掃描。根據(jù)檢測原理的不同，可以分為四類：（1）對未甲基化的胞嘧啶進(jìn)行化學(xué)修飾；（2）利用甲基化敏感限制性內(nèi)切酶（methylation sensitive restriction enzymes，MSRE）進(jìn)行檢測；（3）利用甲基化CpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG-binding protein，MeCP）進(jìn)行分析；（4）利用單分子測序（single-molecule sequencing，SMS）方法直接檢測。

2.1 對未甲基化的胞嘧啶進(jìn)行化學(xué)修飾

對未甲基化的胞嘧啶進(jìn)行化學(xué)修飾，將表觀遺傳信息的差異轉(zhuǎn)換成DNA序列的差異。用重亞硫酸鹽對DNA進(jìn)行處理，可以將未甲基化的胞嘧啶C轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，而甲基化的胞嘧啶不發(fā)生轉(zhuǎn)變[15]。在隨后的PCR過程中，尿嘧啶U被轉(zhuǎn)化成為胸腺嘧啶T。轉(zhuǎn)化后的片段通常可以結(jié)合一代測序技術(shù)（雙脫氧核苷酸法），用于單個位點(diǎn)或者特定片段的DNA甲基化檢測。

同時(shí)，該方法也可以用于全基因組甲基化的檢測，包括（1）甲基化芯片陣列。芯片陣列上固定有能夠識別甲基化與非甲基化CpG的探針，將經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA片段經(jīng)擴(kuò)增后與探針結(jié)合，從而檢測甲基化位點(diǎn)。Illumina公司的HumanMethylation450 BeadChip（HM450）[16，17]以及Infinium MethylationEPIC BeadChip[18]都屬于此類。（2）全基因組亞硫酸氫鹽測序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）。檢測步驟是文庫制備及測序?；蚪MDNA被打斷成片段，末端加A修飾后與甲基化連接頭（methylated adapters）連接[19]，經(jīng)片段大小篩選后采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，然后PCR擴(kuò)增并測序。WGBS是目前國際上研究甲基化的項(xiàng)目機(jī)構(gòu)如美國國立衛(wèi)生研究院（national institute of health，NIH）路線圖計(jì)劃（Roadmap）、由美國人類基因組研究所和歐洲生物信息研究所牽頭的ENCODE計(jì)劃、基因藍(lán)圖計(jì)劃（Blueprint）等采用的標(biāo)準(zhǔn)DNA甲基化檢測方法。（3）簡化代表性亞硫酸氫鹽測序法（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）。RRBS是由Meissner等[20]為降低全基因組DNA甲基化檢測的成本在2008年提出，采用Msp1限制性內(nèi)切酶消化、重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化進(jìn)行文庫制備，結(jié)合二代測序技術(shù)進(jìn)行檢測。

相對而言，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化保留了完整的DNA序列，并且所需的DNA模板量較低，因此成為法醫(yī)DNA甲基化分析常用的方法，用于甲基化的定性和定量分析。然而該方法對轉(zhuǎn)化條件要求苛刻，會造成DNA的降解。同時(shí)，可能存在轉(zhuǎn)化不完全的情況，導(dǎo)致對DNA甲基化比例的過高估計(jì)。經(jīng)轉(zhuǎn)化之后的堿基U在隨后的PCR過程中被DNA聚合酶視作T，因此也有可能造成非特異性擴(kuò)增。

2.2 基于MSRE的技術(shù)

MSRE技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶對所識別序列內(nèi)甲基化位點(diǎn)敏感性的差異來進(jìn)行甲基化檢測[21]。MSRE包括BstUⅠ、HpaⅡ、NotⅠ等，在所識別序列未甲基化時(shí)能夠?qū)π蛄羞M(jìn)行剪切，甲基化時(shí)則不能切割。該方法簡單、穩(wěn)定，但是有兩點(diǎn)不足，一是消化不完全對分析結(jié)果造成影響，二是在全基因組DNA中酶的識別序列有限，因此對DNA甲基化位點(diǎn)的檢測也有限。

2.3 基于MeCP的分析方法

該方法是利用MeCP將酶切或者超聲之后的DNA片段進(jìn)行甲基化富集，隨后采用芯片陣列、二代測序等方法進(jìn)行檢測，所采用的結(jié)合蛋白包括甲基CpG結(jié)合域蛋白（methyl-CpG-binding domain，MBD）[22]和5-mC特異性抗體，后者也稱為甲基化DNA免疫共沉淀（methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）法[23]。MeCP技術(shù)常用于基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)掃描，但是對CpG密度以及拷貝數(shù)有偏向性，優(yōu)先富集CpG密度較高的片段[24]。

2.4 利用SMS方法直接檢測

SMS技術(shù)，也被稱為第三代測序（third generation sequencing，TGS）技術(shù)，無需PCR擴(kuò)增的過程，實(shí)現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨(dú)測序[25]。TGS技術(shù)主要包括三種：（1）單分子合成測序，包括單分子實(shí)時(shí)測序（single-molecule real-time sequencing，SMRT）技術(shù)[26，27]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)[28]；（2）納米孔測序（nanopore-sequencing）技術(shù)，如對穿過納米孔的堿基電信號差異的檢測[29，30]、光信號差異的檢測[31]等；（3）利用顯微鏡對DNA分子直接成像，如透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）技術(shù)[32]、掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope，STM）技術(shù)[33]。其中SMRT以及納米孔測序技術(shù)為DNA甲基化的檢測提供了新的可能。

2.4.1 SMRT技術(shù)

SMRT技術(shù)是由Pacific Biosciences公司所開發(fā)，采用零模波導(dǎo)（zero-mode waveguides，ZMW）芯片的合成測序技術(shù)。ZMW孔徑小于激光波長，因此激光無法直接穿過小孔，而是發(fā)生衍射，形成熒光信號檢測區(qū)，在該區(qū)域內(nèi)錨定有DNA聚合酶。進(jìn)行測序時(shí)，正確配對的堿基進(jìn)入該區(qū)域并滯留數(shù)十毫秒，堿基磷酸基團(tuán)上標(biāo)記的熒光分子受激光激發(fā)發(fā)出相應(yīng)種類的熒光信號，從而獲得序列信息。

SMRT所產(chǎn)生的熒光信號的特征不僅僅包括顏色、波長等，還包括熒光信號的持續(xù)時(shí)間以及兩個信號的間隔[27]，后面兩者體現(xiàn)的是DNA合成動力學(xué)相關(guān)的信息。Flusberg等[26]研究表明，DNA甲基化對DNA聚合酶的動力學(xué)有影響，甲基化位點(diǎn)5-mC在進(jìn)行SMRT時(shí)產(chǎn)生的熒光信號持續(xù)時(shí)間比非甲基化位點(diǎn)C要長得多。根據(jù)信號持續(xù)時(shí)間以及間隔時(shí)間的差異可以檢測不同種類的表觀遺傳學(xué)修飾，包括5-mC、5-hmC以及N6-mA[34]等。與二代測序技術(shù)相比，SMRT技術(shù)的長讀長、不受GC重復(fù)的影響等特點(diǎn)使其能夠很好地應(yīng)用于高GC重復(fù)區(qū)域CpG位點(diǎn)的檢測。Suzuki等[35]采用SMRT技術(shù)成功對人類高GC重復(fù)區(qū)域如長散在重復(fù)序列（long interspersed nuclear elements，LINE）的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測，并構(gòu)建新的算法，提高了檢測的準(zhǔn)確度。

2.4.2 納米孔測序技術(shù)

Oxford Nanopore公司開發(fā)的納米孔單分子測序技術(shù)是基于電信號測序的原理，當(dāng)DNA分子通過結(jié)合有核酸外切酶的納米孔時(shí)，通過孔道的堿基被剪切產(chǎn)生一個阻斷并形成阻斷電流，根據(jù)阻斷電流的變化檢測出相應(yīng)堿基的種類，最終得到DNA的序列。Laszlo等[36]的研究表明，甲基化的堿基5-mC以及5-hmC與未甲基化的堿基C通過納米孔通道時(shí)所產(chǎn)生的電流均有差異，由此可用于DNA甲基化的檢測。

SMS技術(shù)為DNA甲基化的檢測提供了新的可能。但由于DNA甲基化多態(tài)性的特點(diǎn)（同一CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)在不同組織、不同細(xì)胞間有可能不同），SMS技術(shù)檢測DNA甲基化最終的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式依然分為低甲基化、中等程度甲基化和高甲基化三種。同時(shí)，受限于SMS技術(shù)本身的缺點(diǎn)，比如較高的錯誤率、相對低的通量，SMRT技術(shù)會出現(xiàn)插入和缺失錯誤，納米孔測序技術(shù)不能進(jìn)行重復(fù)測序等，目前尚未能應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。如果克服了準(zhǔn)確率以及通量等的局限，相信SMS技術(shù)將能很好地應(yīng)用于DNA甲基化的檢測。

3 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

3.1 年齡推斷

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的年齡推斷也發(fā)展到分子水平。Meissner等[37]總結(jié)了四種可以用于年齡推斷的機(jī)制，包括DNA損傷的累積（主要體現(xiàn)在線粒體DNA片段缺失率）、端粒長度的縮短、天冬氨酸外消旋化以及晚期糖基化終末產(chǎn)物的變化。然而大多數(shù)方法對年齡推斷的誤差都太大。近年，Zubakov等[38]提出了一種基于信號結(jié)合T細(xì)胞受體刪除環(huán)（signal joint T-cell receptors excision circles，sjTREC）定量的方法，認(rèn)為隨著年齡的增長sjTREC降低，并且兩者具有相關(guān)性。Ou等[39]的研究成果與其一致。然而該方法的局限性在于對年齡推斷的精度不夠，對其他不含有T細(xì)胞的組織體液無法使用，同時(shí)還受檢材來源者免疫狀態(tài)的影響。

DNA甲基化具有隨齡變化的特點(diǎn)，主要成因包括在機(jī)體生長過程中隨機(jī)累積的DNA甲基化變化[40]以及基因組中特定位點(diǎn)因基因表達(dá)需要而改變甲基化狀態(tài)[41]。隨著年齡的增長，由于DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1a酶活性的進(jìn)行性缺失，總體的DNA甲基化水平呈下降趨勢[42]，但在一些特殊位點(diǎn)反而上升，均呈現(xiàn)一定相關(guān)性。

很多學(xué)者在整體基因組水平對DNA甲基化與年齡的相關(guān)性進(jìn)行了研究。Bocklandt等[43]采用Illumina HumanMethylation27 BeadChip（HM27），檢測了來源于34對女性同卵雙胞胎檢材的88個DNA甲基化位點(diǎn)，最終基于其中三個CpG位點(diǎn)（NPTX2、EDARADD、TOM1L1）的甲基化狀態(tài)構(gòu)建一個年齡推斷的回歸模型，誤差為5.2年。Koch等[44]采用同樣的方法對來自13種組織細(xì)胞類型的檢材進(jìn)行了檢測，最終篩選出5個CpG位點(diǎn)構(gòu)建模型，包括NPTX2、TRIM58、GRIA2、KCNQ1DN以及BIRC4BP，誤差為9.3年。Hannum等[45]對71個CpG位點(diǎn)進(jìn)行檢測，能夠達(dá)到誤差3.9年的精度。Freire-Aradas等[46]從已報(bào)道的數(shù)據(jù)中篩選出177個CpG位點(diǎn)，采用EpiTYPER方法對725份歐洲人群樣本進(jìn)行了檢測，最終選擇出7個與年齡高度相關(guān)的位點(diǎn)，并一改以往采用的線性回歸方法，采用了多元分位數(shù)回歸分析，隨后在104對同卵雙胞胎中進(jìn)行了驗(yàn)證，可達(dá)到誤差3.07年的精度。

然而，整體基因組水平的甲基化分析對檢材的要求較高，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域則需尋求一種對檢材要求量少、操作簡便、精確度相對較高的方法。Weidner等[47]針對3個CpG位點(diǎn)（ITGA2B、ASPA和PDE4C）建立了一個模型，對年齡預(yù)測的誤差為4.3年。Silva等[48]僅對GRIA2和NPTX2兩個位點(diǎn)，采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合焦磷酸測序的技術(shù)進(jìn)行分析，分別構(gòu)建了兩個模型，GRIA2對年齡的預(yù)測誤差為6.9年，而NPTX2較高，為9.2年。Yi等[49]報(bào)道了3個新的甲基化位點(diǎn)并構(gòu)建了模型，對年齡推斷的精度可達(dá)4年。

3.2 組織體液來源鑒定

組織體液來源的鑒定有助于刻畫犯罪現(xiàn)場、重現(xiàn)犯罪過程，為案件的偵破提供線索與證據(jù)。當(dāng)前常用的來源鑒定方法包括形態(tài)學(xué)、血清學(xué)、mRNA以及DNA甲基化等。形態(tài)學(xué)方法受檢材的限制；血清學(xué)方法通過免疫層析檢測細(xì)胞特異性蛋白對體液來源進(jìn)行鑒定，存在不穩(wěn)定性和非特異性；對組織體液來源鑒定研究較多的方法是進(jìn)行組織特異性mRNA的檢測[50，51]，但是該方法也存在一些不足之處，比如在不同體液之間mRNA的表達(dá)有較多重疊，在降解或者時(shí)間太久的檢材中mRNA可能降解等。

追根溯源，組織體液間的差異是來自于基因表達(dá)的差異，這種差異與DNA甲基化密切相關(guān)[52-54]。全基因組研究發(fā)現(xiàn)，在染色體的特定位置上存在tDMR[13]。根據(jù)組織細(xì)胞類型的不同，tDMR呈現(xiàn)不同的甲基化模式，在某些組織內(nèi)呈現(xiàn)去甲基化，而在其他組織內(nèi)則呈現(xiàn)不同程度的甲基化[55，56]。Eckhardt等[57]的研究表明，基因組特定區(qū)域甲基化水平在男性和女性之間、不同年齡組之間的差異要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于不同組織之間，分別為0.1%、0.275%以及7.1%。因此，穩(wěn)定性高、特異性較好的DNA甲基化成為一種組織體液來源鑒定的生物標(biāo)記。

Frumkin等[58]最先把DNA甲基化用于組織體液來源鑒定，其采用MSRE-PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳的方法，成功對血液、唾液、精液、皮膚、尿液以及陰道分泌液等進(jìn)行了區(qū)分。甲基化程度高的位點(diǎn)則產(chǎn)生較強(qiáng)的信號，低甲基化的則信號較低，然而非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物也會對信號產(chǎn)生影響，因此采用位點(diǎn)間信號比值來進(jìn)行組織類型推斷。Lee等[12]則采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合測序的方法對tDMR進(jìn)行了檢測，并篩選出兩個精液特異性的tDMR，分別位于DACT1和USP49基因調(diào)控區(qū)上。在精液中，兩個位點(diǎn)去甲基化率均超過90%，而在其他組織（如血液、唾液、陰道分泌液）中則保持著相當(dāng)高的甲基化率。同時(shí)，VASA基因的tDMR也被證明可用于精液的鑒定，因?yàn)槠渲辉诰褐斜磉_(dá)[56]。上述兩種方法都只能做到對DNA甲基化的定性，而重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合焦磷酸測序技術(shù)可以達(dá)到定量的目的，是一種穩(wěn)定、常用的方法。Madi等[59]采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合焦磷酸測序技術(shù)篩選針對血液、唾液、皮膚以及精液的tDMR位點(diǎn)。由于能夠達(dá)到定量水平，針對各個特異性位點(diǎn)的分析精確度則更高，比如ZC3H12D基因上5個CpG位點(diǎn)，在血液、唾液及皮膚中顯示出82%～100%的甲基化水平，而在精液中的甲基化水平則低于12%。結(jié)果顯示，ZC3H12D和FGF7能用于精液的鑒定，C20orf117能用于血液的鑒定，BCAS4則可用于唾液的鑒定。Forat等[60]則在基因組水平對組織特異性甲基化位點(diǎn)進(jìn)行了篩選，采用Illumina公司的HM27 BeadChips和HM450K Beadchips，針對靜脈血、月經(jīng)血、陰道分泌液、唾液和精液的150個候選位點(diǎn)進(jìn)行了分析，并使用甲基化特異的單核苷酸擴(kuò)增技術(shù)（single nucleotide primer extension，SNuPE）和下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）進(jìn)行驗(yàn)證，最終篩選出9個特異性位點(diǎn)。Wasserstrom等[61]則將精液特異性的5個DNA甲基化位點(diǎn)加3個質(zhì)量控制位點(diǎn)制作成了試劑盒，稱為Nucleix DSI-Semen試劑盒，對檢材檢測結(jié)果可信度達(dá)到0.9999。

DNA甲基化以其穩(wěn)定性和特異性在組織體液鑒定中受到較多關(guān)注，但由于所提供的不是全或無的結(jié)果，因此在對混合樣本使用時(shí)受到限制。很多CpG位點(diǎn)甲基化同時(shí)存在于多種組織體液中，同時(shí)DNA甲基化受年齡、環(huán)境、生活方式的影響也會發(fā)生變化，因此在篩選CpG位點(diǎn)的過程中，不僅需要對不同組織進(jìn)行檢測以確定特異性，還需進(jìn)行大量人群調(diào)查以排除個體特異性。疾病如癌癥等對DNA甲基化水平的影響也是需要關(guān)注的內(nèi)容之一。

3.3 同卵雙胞胎的鑒別

每1000次分娩約有3次是同卵雙胞胎[62]，因此在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中對同卵雙胞胎的鑒定并不少見。由于同卵雙胞胎的DNA序列完全一致，采用常規(guī)的STR檢測方法無法對兩者進(jìn)行區(qū)分。研究發(fā)現(xiàn)，在同卵雙胞胎的DNA序列中存在著微小變異以及表觀遺傳學(xué)差異。Weber-Lehmann等[63]采用二代測序方法對一對雙胞胎兄弟的精液以及其中一個孩子的血液進(jìn)行了檢測，在父子二人的基因組DNA中發(fā)現(xiàn)5個SNP位點(diǎn)，而雙胞胎兄弟則不含有該突變。Wang等[64]認(rèn)為，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的突變率要高于核基因組DNA，因此檢測同卵雙胞胎的mtDNA序列有助于對二者進(jìn)行鑒定，該研究采用二代測序的方法對10對同卵雙胞胎的血樣進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法可以用于同卵雙胞胎的區(qū)分。

同卵雙胞胎在表觀遺傳學(xué)方面，主要是DNA甲基化的差異[65]。甲基化在某種程度上反映著環(huán)境對基因組的影響[66]，包括飲食、生活習(xí)慣、生活經(jīng)歷等，因此即使是同卵雙胞胎，DNA甲基化也會存在差異性。Boks等[67]采用基因陣列的方法檢測了全基因組約1 500個CpG位點(diǎn)，Gervin等[68]采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合焦磷酸測序檢測了1760個位點(diǎn)，均證明在同卵雙胞胎之間存在DNA甲基化差異。Li等[69]對年齡為17～74歲的13對女性同卵雙胞胎和9對男性同卵雙胞胎的外周血進(jìn)行了檢測，在3616個CpG位點(diǎn)中篩選出92個具有差異性的位點(diǎn)，能夠成功對22對同卵雙胞胎進(jìn)行鑒別。作者還指出由于92個差異性位點(diǎn)是由外周血檢測而得出，因此只能用于血液樣本的檢測。Zhang等[70]采用Illumina公司HM450 Beadchips對10對同卵雙胞胎的全基因組DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在同卵雙胞胎之間有0.087%～1.530%的CpG位點(diǎn)存在差異。同時(shí)，由于DNA甲基化具有隨齡變化的特性，在法醫(yī)學(xué)檢案中，用于同卵雙胞胎鑒別的DNA甲基化位點(diǎn)的穩(wěn)定性就顯得十分重要，因此Zhang等[70]還對8個個體（包括一對同卵雙胞胎）的血樣在時(shí)間維度上進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明在9個月的時(shí)間內(nèi)DNA甲基化沒有十分大的變化。此外，Stewart等[71]的研究表明，采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合高分辨率熔解曲線分析對Alu家族的Alu-E2F3以及Alu-SP進(jìn)行檢測也可用于同卵雙胞胎的鑒別。

3.4 其他

早在1993年，Natio等[72]就將DNA甲基化用于性別鑒定，檢測與X染色體相關(guān)的DXZ4基因甲基化狀態(tài)。Boks等[67]則選擇了1 505個常染色體相關(guān)的CpG位點(diǎn)，采用Illumina公司GoldenGate陣列對46個男性、46個女性以及92個對照樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明DNA甲基化狀態(tài)在性別之間存在差異。

由于具有親源特異性，DNA甲基化可用于親本來源的鑒定。Zhao等[73]采用MSRE-PCR的方法，對印記基因座rs220028進(jìn)行了研究，證明子代甲基化的等位基因來自于母親。Nakayashiki等[74，75]采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合測序的方法對5個印跡基因的DNA甲基化進(jìn)行了檢測，確定了H19為母系來源表達(dá)基因，而HYMA1、SNRPN以及PEG3則為父系來源表達(dá)基因。采用DNA甲基化對印記基因座親本來源進(jìn)行鑒定是對傳統(tǒng)STR分型的有效補(bǔ)充。

此外，DNA甲基化還可用于DNA樣本的確證。Frumkin等[76]的研究表明，采用適當(dāng)?shù)姆椒?，DNA樣本可以在體外人工合成，如果放置于犯罪現(xiàn)場將誤導(dǎo)偵查。該研究同時(shí)指出，人工合成的DNA均無甲基化，因此可以應(yīng)用甲基化檢測以鑒別是否人工合成。

4 小結(jié)

DNA甲基化含有豐富的信息量，可以作為STR、SNP等經(jīng)典遺傳標(biāo)記的有效補(bǔ)充，提供檢材性別、體液來源、年齡、同卵雙胞胎甄別等信息，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出一定的應(yīng)用價(jià)值。但DNA甲基化較為復(fù)雜，在應(yīng)用過程中需注意位點(diǎn)的篩選、檢材的選擇以及檢測方法的選擇。選擇已知的位點(diǎn)或者通過全基因組檢測篩選新的合適的位點(diǎn)，是DNA甲基化應(yīng)用的前提。由于甲基化在不同組織中可能存在不同的狀態(tài)，因此在構(gòu)建應(yīng)用位點(diǎn)體系時(shí)，尤其是在體液來源鑒定時(shí)，對檢材組織類型的篩選十分重要。檢測方法需要靈敏度高、特異性好，以適應(yīng)微量或降解檢材的需求。TGS技術(shù)為DNA甲基化的檢測提供了新的途徑。相信隨著研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，DNA甲基化在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)泻芎玫膽?yīng)用前景。

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Research Progress on the Detection Method of DNA Methylation and Its Application in Forensic Science

NIE Yan-chai,YU Li-juan,GUAN Hua,ZHAO Ying,RONG Hai-bo,JIANG Bo-wei,ZHANG Tao
（First Research Institute of the Ministry of Public Security of PRC,Beijing 100022,China）

As an important part of epigenetic marker,DNA methylation involves in the gene regulation and attracts a wide spread attention in biological auxology,geratology and oncology fields.In forensic science,because of the relative stable,heritable,abundant,and age-related characteristics,DNA methylation is considered to be a useful complement to the classic genetic markers for age-prediction,tissueidentification,and monozygotic twins’discrimination.Various methods for DNA methylation detection have been validated based on methylation sensitive restriction endonuclease,bisulfite modification and methylation-CpG binding protein.In recent years,it is reported that the third generation sequencing method can be used to detect DNA methylation.This paper aims to make a review on the detection method of DNA methylation and its applications in forensic science.

forensic genetics;DNA methylation;review;twins,monozygotic;third generation sequencing

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.017

1004-5619（2017）03-0293-08

2016-11-21）

（本文編輯：張素華）

聶燕釵（1988—），女，碩士，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用和研究；E-mail：nieyanchai＠163.com