設(shè)施輸液管道淤堵物的微生物鐵還原特征

王娟娟++劉玲玲++金婷++楊靜++盛海君

摘要：結(jié)合理化分析、礦物分析與微生物方法，研究水肥一體化設(shè)施管道淤積物樣品鐵還原潛勢及對鐵氧化物存在的影響。結(jié)果表明，樣點FS1與樣點FS2的水樣均為弱酸性，接近6，而樣點FS1的含鐵量與鐵還原潛勢均高于樣點FS2；添加外源有機碳源對樣品的三價鐵還原速率有促進作用，其中以乳酸促進作用最為明顯，甲酸對體系的鐵還原速率的促進作用則較小。不同樣品對有機碳源的反應(yīng)有差異，可能與微生物組成及鐵氧化物成分不同有關(guān)。外加碳源培養(yǎng)后，與鐵還原有關(guān)的微生物明顯富集，以地桿菌屬（Geobacter sp.）、脫硫芽孢彎曲菌屬（Dsulfosporosinus sp.）及脫亞硫酸菌屬（Desulfitobacterium）為代表。由結(jié)果可知，可以通過調(diào)節(jié)管道的氧化還原狀態(tài)及選擇有機碳源種類，加速氧化鐵的還原溶解，從而緩解管道淤堵。

關(guān)鍵詞：微生物；鐵還原；設(shè)施管道；淤堵物

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0509-05

收稿日期：2016-09-13

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20160468）。

作者簡介：王娟娟（1979—），女，江蘇泗洪人，博士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)微生物資源利用研究。E-mail：wangjuanjuan@yzu.edu.cn。

通信作者：盛海君，碩士，高級農(nóng)藝師，主要從事環(huán)境科學(xué)研究。E-mail：hjsheng@yzu.edu.cn。

鐵（Fe）是地球上較豐富的金屬元素，鐵的循環(huán)影響各種地球化學(xué)及生物化學(xué)過程。微生物通過參與調(diào)控鐵元素的氧化或還原，為其生長提供能源，微生物參與的鐵循環(huán)過程受到越來越多的關(guān)注[1]。鐵在自然界中主要存在形態(tài)為二價[Fe（Ⅱ）]與三價[Fe（Ⅲ）]，前者可以通過化學(xué)過程與微生物作用使鐵氧化生成Fe（Ⅲ）氧化物。這類氧化鐵常見于富鐵的土壤、礦山、濕地以及工業(yè)系統(tǒng)如管道等[2-4]。微生物鐵氧化物的形成與去向具有重要的生態(tài)意義[5]。一方面，鐵的氧化與還原過程存在電子的轉(zhuǎn)移，影響著其他地球化學(xué)循環(huán)；另一方面，鐵氧化物因其比表面積大并帶有電荷，對環(huán)境中各種重金屬及有機污染物有較強的吸附固定能力。鐵氧化作用消耗氧氣，從而形成微厭氧環(huán)境，為異化還原微生物生長提供環(huán)境條件。氧化鐵的存在為鐵還原微生物提供電子受體，用于厭氧呼吸。鐵氧化物的形態(tài)與種類影響異化還原過程[6]，而異化鐵還原過程則會促使鐵形態(tài)發(fā)生改變[7]。

自然界中三價鐵的還原主要通過異化還原過程進行，常見于淹水土壤、底泥及其他地下環(huán)境等[8]。異化鐵還原是指微生物利用細胞外三價鐵為末端電子的受體，通過氧化作為電子供體的有機物將Fe（Ⅲ）還原為Fe（Ⅱ），獲得能量以維持生長。微生物異化還原鐵利用多種有機酸作為電子供體與碳源，因而對主要元素的地質(zhì)環(huán)境循環(huán)，尤其是碳循環(huán)有著深刻的影響。甚至有研究認為，微生物鐵還原是地球上最早將有機碳轉(zhuǎn)化為二氧化碳的過程[9-10]。鐵還原過程還可耦聯(lián)有機物的氧化降解，包括氯代有機物、偶氮染料等，并影響到一些重金屬和有毒元素的形態(tài)[11-14]，因而在環(huán)境污染與修復(fù)領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。

參與鐵氧化過程的微生物在形態(tài)與分類學(xué)上各異。已知分離菌種包括嗜熱、嗜酸與嗜堿的細菌與古菌[10]。其中，研究較為廣泛的代表性菌屬有地桿菌屬（Geobacter）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、金屬還原地桿菌（Geobacter metal lireducens） GS-15是首次分離的異化鐵還原細菌，在Fe（Ⅲ）還原的過程中同時分解苯和甲苯等芳香族化合物[15]。此類細菌常使用小分子脂肪酸如甲酸、乙酸、乳酸及H2等。其主要反應(yīng)式如下：

[JZ（]CHCOO-+2Fe3++H2O→HCO3-+2Fe2++2H+；[JZ）][JY]（1）

[JZ（]CH3COO-+4Fe3++2H2O→2HCO3-+8Fe2++9H+；[JZ）][JY]（2）

CH3—CHOH—COO-+4Fe3++2H2O→CH3COO-+HCO3-+4Fe2++5H+。[JY]（3）

在水肥一體化設(shè)施栽培中，管道淤堵是較為常見的問題，而在鐵含量較高的情況下，氧化鐵的形成往往是形成管道淤堵的直接因素[4]。因其產(chǎn)生速度較快[16]，清理和修復(fù)工作較為困難。異化還原細菌可利用氧化態(tài)鐵作為電子受體，同時導(dǎo)致鐵氧化物的還原與溶解。因此，研究不同條件下鐵氧化還原，對于調(diào)控鐵氧化物的去向、清除管道淤堵具有重要意義。本研究比較2個樣點的排水管道中的不同鐵氧化的微生物還原潛勢以及參與鐵還原的主要微生物群落，以探明不同樣品中鐵還原的影響因子，為了解水肥一體化設(shè)施管道環(huán)境中鐵氧化物的存在與轉(zhuǎn)移規(guī)律提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

本試驗共設(shè)定2個區(qū)域（FS1、FS2），各2個樣點（FS1A、FS1B、FS2C、FS2D），采集管道內(nèi)水樣與淤堵物（主要為鐵氧化物）。樣品采集用嚴格的滅菌設(shè)備與方法。鐵氧化物用不銹鋼藥匙收集，存入無菌離心管內(nèi)。分2份保存：用于室內(nèi)培養(yǎng)以及鐵氧化物礦物分析的樣品存放于冷卻箱內(nèi)，而用于常規(guī)DNA分離的樣品則立刻用干冰冷凍保存。同時，采集水樣，1份冷藏保存，用于室內(nèi)培養(yǎng)；1份用0.2 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜過濾，分別用50%硝酸或50%鹽酸酸化，用于測定水樣鐵及其他元素含量。

1.2培養(yǎng)試驗

對于鐵還原潛勢測定，樣品處理過程均為嚴格無菌厭氧操作，在厭氧箱內(nèi)進行。每個樣品稱取5 g鐵氧化物，加同地點采樣的水樣（經(jīng)吹氮氣去氧處理）至體積75 mL，于密封血清瓶內(nèi)混勻。分別添加甲酸、乙酸及乳酸，使得最終濃度為10 mmol/L。另設(shè)不加任何碳源的對照（預(yù)試驗結(jié)果表明，加入殺菌劑與否與常規(guī)對照相比沒有明顯區(qū)別，因而為操作安全方便，對照只使用不加碳源不加殺菌劑處理）。對照與處理各重復(fù)3次，在室溫（25 ℃）下避光培養(yǎng)。隔0～3 d從各處理中取1 mL混合培養(yǎng)液，過濾后測定樣品pH值及二價鐵含量變化，持續(xù)采樣至4周以后。

1.3理化分析與測定

常規(guī)理化性質(zhì)包括pH值、溫度、含氧量、電導(dǎo)率等，在現(xiàn)場用便攜式電極測定。

鐵氧化物礦物采用拉曼光譜分析，波長為532 nm，物鏡為100倍，獲取時間為300～1 800 s，光譜分辨率為6 cm-1。

金屬離子含量用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）及電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測定。

鐵元素測定用鄰菲羅啉顯色、紫外-可見分光光度計測定。硫酸根離子用氯化鋇顯色、紫外-可見分光光度計測定。

1.4分子生物學(xué)測定

稱取0.3 g樣品用于DNA提取，采用十六烷基三甲基溴化銨-十二烷基硫酸鈉（CTAB-SDS）處理、酚-三氯甲烷-異戊醇提取、異丙醇沉淀方法，具體操作步驟與條件見文獻[17]。提取后的DNA用通用細菌16S基因片段引物27F/1 492R擴增，巢式擴增采用通用引物341F（GC）與907R。擴增后的產(chǎn)物用于變性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（DGGE）。電泳條件為100 V，60 ℃，16 h?；厥罩饕獥l帶，繼續(xù)擴增，并送至Macrogen Inc測定基因片段序列。

1.5數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)圖表生成用Excel或SigmaPlot。方差分析用SPSS，其中P<0.1為差異顯著。用統(tǒng)計分析軟件R（Jaccard相似度）來分析樣品變性梯度凝膠電泳（DGGE）凝膠圖譜的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。

2結(jié)果與分析

2.1幾個水樣的理化性質(zhì)

表1結(jié)果顯示，幾個樣品總鐵含量均較高，最高達32505 mg/L，但2個樣點之間差異明顯；還原態(tài)鐵與總鐵之間不存在相關(guān)性，以樣品FS1B還原態(tài)鐵比例最低，約占總鐵含量38%，其他幾個樣品還原態(tài)鐵比例則高達90%～95%；所有樣品的pH值介于5.15～6.06之間，均為弱酸；溶解氧含量較高，F(xiàn)S1、FS2樣品平均分別為12.00、3.15 mg/L。雖然樣品的含氧量不低，其還原態(tài)鐵含量仍較高，這可能與地下水不斷供給有關(guān)。溶解氧含量測定結(jié)果與總鐵量成正比，樣點FS1平均值明顯高于樣品FS2。

2.2外源電子供體對鐵還原的影響

圖1表明，所有樣品在培養(yǎng)前2 d均未有鐵還原過程發(fā)生。其中，添加乳酸的樣品FS1A自4 d開始有鐵還原發(fā)生，其還原性鐵濃度為116.6 mg/kg，到培養(yǎng)結(jié)束時，二價鐵濃度則達到507.5 mg/kg。樣品FS1B中的二價鐵濃度自培養(yǎng)6 d開始以平均每天1.4 mg/kg的速率積累，并在培養(yǎng)結(jié)束時濃度達到與樣品FS1A接近；另1個采樣點的2個樣FS2C與FS2D的總鐵還原速率則與樣點1相近，不同的是在培養(yǎng)9～13 d其二價鐵濃度增加較為緩慢，有1個短暫的滯后期。

圖1-b為添加外源乙酸后樣品鐵還原動態(tài)，可以看出，對于樣品FS1A、FS1B、FS2C，在培養(yǎng)前2周內(nèi)添加乙酸并不影響鐵還原；樣品FS2D的Fe（Ⅱ）濃度在6～11 d所增加，之后變化較小；在13 d時，樣品FS1A與FS2C中二價鐵開始有所增加，其中樣品FS1A還原速率較高，在這段時間內(nèi)，其增加速率為17.6 mg/（kg·d），最終達到397.2 mg/kg。從增加趨勢看，樣品FS2C最高，F(xiàn)S1A與FS1B接近，而樣品FS2D最低。

甲酸的增加（圖1-c）對樣品體系鐵還原過程影響較小，其中樣品FS1A、FS1B與對照（圖1-d）幾乎沒有差異。樣品FS2C、FS2D只是在培養(yǎng)約10 d后有一些變化，鐵的還原速率稍有增加，但最終二價鐵濃度分別只達到179.1、224.9 mg/kg，平均還原速度分別為1.68、4.99 mg/（kg·d）。

2.3培養(yǎng)后體系pH值變化

與原始樣品pH值（表1）相比，添加外源有機酸后體系初始pH值略有提高，平均增加了0.20（圖2）。在培養(yǎng)1個月后，各處理體系的pH值有不同程度的提高。以乙酸與乳酸處理較為明顯。其中，添加乳酸后培養(yǎng)1個月的樣品FS1B pH值提高了1。而乳酸與乙酸的添加均使得樣品FS1A體系pH值有所提高。這與鐵還原過程釋放H+似乎有些矛盾，然而整體pH值變化并不明顯。

2.4參與鐵還原過程的微生物豐度與多樣性

對自然樣品的微生物群落結(jié)果進行了DGGE測定，并對圖像進行聚類分析。由圖3可以看出，樣品的微生物多群落結(jié)果有明顯的地域性，2個樣點的樣品各自聚為不同類群；相對于樣點FS2的2個樣品（C與D），樣點FS1的2個樣品（A與B）之間相似度稍低，Jaccard相似系數(shù)僅為 0.3，也就是兩者的微生物群落結(jié)構(gòu)有30%的相似度，而樣品FS2C、FS2D則達到45%。

為進一步了解可能參與鐵還原過程的微生物，對于添加外源有機酸培養(yǎng)后體系的主要細菌進行測序分析。結(jié)果表明，幾種豐度較大的細菌均為鐵還原細菌種屬。代表性的細菌有地桿菌屬（Geobacter sp.）、脫硫芽孢彎曲菌屬（Desulfosporosinus sp.）以及脫亞硫酸菌屬（Desulfitobacterium），這幾類占培養(yǎng)體系中細菌的大多數(shù)（圖4）。而與原始自然樣品相比，微生物群落有一定變化，鐵還原類細菌豐度（圖4所示比例）明顯增加。

[TPWJJ3.tif]

3討論與結(jié)論

鐵氧化物不僅影響到其他元素循環(huán)，還可以吸附鈍化環(huán)境中重金屬、有機污染物等，因而受到越來越多的關(guān)注。鐵氧化物的還原作用在一定程度上決定著環(huán)境中鐵氧化物的存在。在中性及偏堿性條件下，自然環(huán)境中二價鐵很容易被化學(xué)氧化[18]。而本試驗樣品pH值為5～6，這為微生物鐵氧化提供了有利條件，而其產(chǎn)物及代謝物質(zhì)可能更利于異化還原過程。雖然樣點2溶解氧含量平均達3.15 mg/L，但樣品中二[CM（25]價鐵的含量并不低。這一方面原因可能在于弱酸性pH值[CM）]

[FK（W31][TPWJJ4.tif]

減緩了化學(xué)氧化過程；另一方面可以歸結(jié)于二價鐵含量高的水源補給作用。樣品中相對較高的溶解氧含量也為微生物活動尤其是氧化鐵還原過程提供了充足的碳源。

添加外源有機碳對鐵還原影響有所不同?？傮w而言，乙酸與乳酸的加入提高了鐵還原速率，而甲酸對體系鐵還原速率的影響可以忽略。其原因可能與原樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)，偏好甲酸的鐵還原菌在樣品中含量較低[8]，因而對整個過程并無太大的促進作用。所有的處理均存在1個滯后期，此期間微生物需要適應(yīng)生長環(huán)境的變化，恢復(fù)到應(yīng)有的活動能力。滯后期長短可能與樣品內(nèi)鐵還原微生物的組成與活性有關(guān)。另外， 原樣品的鐵氧化物礦物結(jié)構(gòu)與組成也可能影響它作為三價鐵源的釋放速率[19]。相比之下，乙酸添加產(chǎn)生的滯后期較長，可能與其單分子產(chǎn)生的H+含量較高，短期內(nèi)對微生物生長產(chǎn)生一定的抑制作用有關(guān)。

厭氧培養(yǎng)明顯富集鐵還原微生物，加速三價鐵的溶解。聚丙烯酰胺凝膠圖譜表明，微生物群落結(jié)構(gòu)在添加乙酸與乳酸培養(yǎng)后明顯不同于甲酸處理與原始樣品，鐵還原菌Geobacter sp.、Desulfosporosinus sp.以及Desulfitobacterium占主導(dǎo)地位。同樣，從鐵還原潛勢看，后面2個處理沒有表現(xiàn)出較高的鐵還原速率。而乙酸與乳酸處理之間也各不同，表現(xiàn)出很強的培養(yǎng)基選擇性。此外，樣品之間也差異明顯，同樣是乳酸處理，樣品FS1A與FS1B的還原速率增長程度明顯高于樣品FS2C和FS2D。

對用于室內(nèi)培養(yǎng)的鐵氧化物樣品中微生物群落進行分析的結(jié)果可視為培養(yǎng)體系的初始微生物組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各樣品中具有鐵還原能力的菌屬含量較低，只有樣品FS1B中達到總測定序列的28%，樣品FS1A中只檢測到小于1%的Geobacter。然而，無論是添加乳酸或乙酸的處理，樣品FS1B的鐵還潛勢卻低于樣品FS1A，而2個樣品的基本理化性質(zhì)與鐵氧化礦物組成均比較接近。因此，可能還有影響鐵還原潛勢的其他重要原因存在。

研究表明，鐵還原細菌更喜好非結(jié)晶態(tài)鐵氧化物，如水鐵礦[10，20]，但也有一些細菌可以還原結(jié)晶態(tài)氧化鐵[9]。在本試驗中，樣品FS1A與FS1B的還原速率明顯高于FS2B和FS2D，而前二者氧化物主要成分為結(jié)晶度較差的施氏礦物Schwertmannite，后者則含有多種無定形與結(jié)晶態(tài)鐵氧化物。據(jù)報道，Schwertmannite較容易被微生物利用進行鐵還原[21]，不難解釋樣品鐵還原潛勢的差異。因此，調(diào)控環(huán)境中鐵氧化的存在要綜合考慮有機碳源與鐵氧化物底物因素。

pH值是影響異化鐵還原的重要因素，不但影響體系中Fe（Ⅲ）溶解度及各氧化還原體系間的化學(xué)反應(yīng)，而且還會影響微生物生長和形態(tài)及其代謝過程中的酶活性。吳超等研究發(fā)現(xiàn)，初始體系pH值與鐵還原過程呈顯著正相關(guān)，與水稻土微生物群落的鐵還原能力均有顯著負相關(guān)關(guān)系，但在pH值為6.0時效果最佳[22]。這與本試驗條件弱酸性有很好的統(tǒng)一性。

綜上所述，抽測樣點排水管道中鐵氧化物主要由施氏礦物組成，其微生物群落結(jié)構(gòu)以樣點間相似度更大。添加小分子有機酸對鐵還原潛勢有一定促進作用，不同有機酸表現(xiàn)的作用有差異，其中以乳酸的促進作用最大，甲酸最小；厭氧培養(yǎng)改變了樣品微生物群落結(jié)構(gòu)，鐵還原細菌得到了富集；培養(yǎng)前后體系的硫酸根則無明顯變化。

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