雙波長(zhǎng)法測(cè)定珍珠粟淀粉中直鏈和支鏈淀粉的含量

馬艷弘++鐘小仙++喬月芳++李亞輝++張宏志

摘要：研究建立同時(shí)測(cè)定珍珠粟直鏈和支鏈淀粉含量的檢測(cè)方法，并通過測(cè)定分析13個(gè)種質(zhì)資源中直鏈與支鏈淀粉含量的變化，為篩選適宜的加工品種提供依據(jù)。根據(jù)雙波長(zhǎng)選擇原理和掃描光圖譜，確定直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)分別為634、426 nm，支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)分別為539、763 nm。直鏈淀粉濃度在4～44 mg/L之間（r=0.999 3）、支鏈淀粉濃度在20～120 mg/L（r=0.999 3）之間，其碘復(fù)合物與吸光度呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果表明，13個(gè)珍珠粟供試樣品中直鏈、支鏈淀粉的含量分別為16.07%～23.48%、52.34%～73.80%，支鏈淀粉含量差異是引起總淀粉含量差異的主要因素。樣品88、50、59、1-1的品種優(yōu)良，可作為選種栽培、精深加工的優(yōu)選品種。

關(guān)鍵詞：雙波長(zhǎng)分光光度法；珍珠粟；直鏈淀粉；支鏈淀粉

中圖分類號(hào)： S515.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0331-04

收稿日期：2016-04-22

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（12）1005-7]；國(guó)家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系鹽城綜合試驗(yàn)站（編號(hào)：CARS-35-31）；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程（編號(hào)：SXGC[2015]334）。

作者簡(jiǎn)介：馬艷弘（1972—），女，山西中陽人，博士，副研究員，主要從事耐鹽蔬菜食品加工技術(shù)及副產(chǎn)物綜合利用研究。Tel：（025）84390613；E-mail：ma_yhhyy@126.com。

[JP2]珍珠粟（pearl millet），即御谷（Penniseetum glaucum），亦稱美洲狼尾草等，原產(chǎn)于非洲，現(xiàn)已廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，為世界上六大禾谷類作物之一，是位于印度、非洲等半干旱地區(qū)人們的主要雜糧作物。珍珠粟具有生長(zhǎng)速度快、莖葉產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)成分高、適應(yīng)性廣、適口性好、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，尤其適合在高溫、干旱、鹽堿地區(qū)生長(zhǎng)[1]，既是重要的優(yōu)質(zhì)牧草和糧食作物來源[2]，同時(shí)也是防風(fēng)固沙、改良土壤的優(yōu)良先鋒草種[3]。我國(guó)珍珠粟的栽培歷史悠久，在古代曾將其作為貢品供皇室貴族享用，因而珍珠粟也有“御谷”之稱，但是真正從事珍珠粟的研究?jī)H始于20世紀(jì)40年代。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前已陸續(xù)培育、鑒定、引進(jìn)包括寧牧26-2美洲狼尾草、寧雜3號(hào)美洲狼尾草、寧雜4號(hào)美洲狼尾草等國(guó)家審定品種在內(nèi)的300多份品種資源，栽培面積逐年增加，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)、工業(yè)造紙、生物能源等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[4-5]。

珍珠粟種子營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅含有大量淀粉，而且還含有比小麥、大米、玉米、高粱更高含量的蛋白、脂肪和鈣、鐵、鋅等營(yíng)養(yǎng)成分[6]。此外，珍珠粟還含有豐富的膳食纖維、多酚和黃酮等生物活性物質(zhì)[7]，具有清除自由基、抗氧化[8-9]、預(yù)防糖尿病、抗癌、預(yù)防便秘、控制血壓和低密度脂蛋白水平等生物學(xué)功能[10-11]，可作為預(yù)防多種疾病發(fā)生的重要食療策略[12]。但是遺憾的是，迄今為止國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)珍珠粟的研究?jī)H集中在栽培育種和莖葉的飼料發(fā)酵方面，而對(duì)珍珠粟作為雜糧的營(yíng)養(yǎng)特性、食用品質(zhì)、檢測(cè)技術(shù)等方面的研究卻未見報(bào)道。

淀粉是珍珠粟最主要的食用成分，其含量和組成對(duì)其功能、營(yíng)養(yǎng)及食味特性與加工品質(zhì)影響較大[13]。差示掃描量熱儀法（簡(jiǎn)稱DSC）、高效空間排阻色譜法（簡(jiǎn)稱HPSEC）、近紅外光譜法（簡(jiǎn)稱NIR）、熱重法（簡(jiǎn)稱TG）、酶法、雙波長(zhǎng)比色法、三波長(zhǎng)檢測(cè)法[14-15]均可用于淀粉的檢測(cè)。這些方法有的操作繁瑣，有的易受樣品中糖類、脂類等物質(zhì)干擾，有的雖然精確，但是檢測(cè)成本高、結(jié)果計(jì)算復(fù)雜，使其應(yīng)用均受到不同程度的限制。其中，雙波長(zhǎng)比色法因具有簡(jiǎn)便快速、成本低、準(zhǔn)確度高并可同時(shí)檢測(cè)支鏈、直鏈淀粉等特點(diǎn)而在植物淀粉檢測(cè)中備受關(guān)注[16-18]。本研究采用雙波長(zhǎng)比色法同時(shí)測(cè)定不同資源珍珠粟中直鏈、支鏈淀粉的含量，在建立同時(shí)測(cè)定珍珠粟中支鏈、直鏈淀粉含量的可靠分析技術(shù)的同時(shí)，進(jìn)一步分析不同種質(zhì)資源珍珠粟淀粉組分比例間的差異，為進(jìn)一步開展珍珠粟雜交育種、品質(zhì)分析、保健食品開發(fā)以及資源的綜合利用提供參考。

[BT1-*3]1材料與方法

1.1材料與試劑

供試珍珠粟資源：采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，均為通過美國(guó)引進(jìn)的Bil3B綜合種套袋自交后采集的具有不同特性的種質(zhì)資源。種子自然干燥后，用萬能粉碎機(jī)粉碎，儲(chǔ)存于封口袋內(nèi)并放置于干燥器中保存?zhèn)溆?。直鏈與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；其余常規(guī)試劑石油醚、氫氧化鉀、鹽酸、碘、碘化鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

碘試劑的配制，稱取18.5 g碘化鉀，溶于少量蒸餾水中，再加6.5 g碘，待溶解后用蒸餾水定容至100 mL，貯存于棕色瓶中備用。

1.2儀器與設(shè)備

D-8紫外可見分光光度計(jì)，南京菲勒儀器有限公司；ML204萬分之一天平，梅特勒儀器有限公司；DHG-9076A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW100萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；SZF-06A粗脂肪測(cè)定儀，上海新嘉電子有限公司；FE20 pH計(jì)，梅特勒儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備準(zhǔn)確稱取各0.100 0 g直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，分別放入100 mL燒杯中，加10 mL 1 mol/L 氫氧化鉀溶液，置于85 ℃水浴中充分?jǐn)嚢枞芙?。然后用蒸餾水定容至50 mL，混合均勻，即為2.0 mg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液和2.0 mg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2直鏈與支鏈淀粉檢測(cè)波長(zhǎng)的確定吸取1.0 mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液和0.5 mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別放入100 mL燒杯中，加25 mL蒸餾水，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至3.0，再加入0.05 mL碘試劑，并用蒸餾水定容至 50 mL。室溫下靜置25 min后以蒸餾水為空白對(duì)照，分別在紫外-可見分光光度計(jì)上進(jìn)行400～800 nm波段光譜掃描，分別獲得二者的吸收光譜圖，根據(jù)等吸收點(diǎn)作圖法確定直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)（λ1）、參比波長(zhǎng)（λ2），以及支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)（λ3）、參比波長(zhǎng)（λ4）。

1.3.3直鏈與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液于燒杯中，加 25 mL 蒸餾水，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，加0.05 mL碘試劑，用蒸餾水定容至50 mL。室溫下靜置25 min，在波長(zhǎng)λ1、λ2下分別測(cè)定吸光度D1、D2，以二者的差值ΔD為縱坐標(biāo)、直鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo)，即可繪制出雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線；分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液于燒杯中，其他操作同直鏈淀粉，根據(jù)結(jié)果即可繪制支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4珍珠粟種子的處理與淀粉含量的測(cè)定將自然風(fēng)干的珍珠粟種子用萬能粉碎機(jī)打成粉末，稱質(zhì)量，置于 60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，測(cè)得水分含量W1；稱取1.000 g烘干樣品（m），加入 80 mL 石油醚，加熱回流脫脂4 h，然后放入干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，利用粗脂肪測(cè)定儀測(cè)定粗脂肪含量W2。再稱取0.100 g脫脂樣品，加入10 mL 1 mol/L氫氧化鉀，于85 ℃水浴中充分?jǐn)嚢枞芙夂螅谜麴s水定容至50 mL，靜置20 min后過濾。各品種均取3 mL濾液，加入25 mL蒸餾水，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，樣品測(cè)定液中加 0.05 mL 碘試劑，測(cè)定液、空白液均用蒸餾水定容至50 mL。室溫靜置25 min后，以蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)定各樣品吸光度。根據(jù)直鏈、支鏈淀粉的雙波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品的直鏈、支鏈淀粉含量，二者相加即得烘干樣品總淀粉含量。直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉含量計(jì)算公式分別如下：

[JZ]直鏈淀粉含量=[SX（]C直×50×50×103×（m×1 000）×（1-W2）[SX）]×100%；

[JZ]支鏈淀粉含量=[SX（]C支×50×50×103×（m×1 000）×（1-W2）[SX）]×100%；

[JZ]總淀粉含量=直鏈淀粉含量+支鏈淀粉含量。

式中：C直、C支分別為根據(jù)直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的樣品液中直鏈、支鏈淀粉濃度，mg/mL。

1.3.5雙波長(zhǎng)法的測(cè)定穩(wěn)定性、測(cè)定精度與加標(biāo)回收率試驗(yàn)分別取直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液，每隔5 min測(cè)定1次吸光度，計(jì)算平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值，評(píng)價(jià)雙波長(zhǎng)檢測(cè)法的穩(wěn)定性；對(duì)于同一珍珠粟樣品，同時(shí)測(cè)定直鏈、支鏈淀粉的含量，進(jìn)行4次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算結(jié)果的平均值與RSD值，評(píng)價(jià)其測(cè)定精度；在已測(cè)得直鏈、支鏈淀粉含量的珍珠粟樣品中，分別添加準(zhǔn)確稱量的不同質(zhì)量的直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定直鏈、支鏈淀粉含量，按照下列公式計(jì)算加標(biāo)回收率及RSD值，以此檢驗(yàn)雙波長(zhǎng)法測(cè)定珍珠粟淀粉含量的準(zhǔn)確度：

[JZ]加標(biāo)回收率=（m1-m2 ）/m3×100%。

式中：m1為加標(biāo)準(zhǔn)品后樣品測(cè)定的總質(zhì)量，g；m2為樣品中原有直鏈或支鏈淀粉的質(zhì)量，g；m3為添加的直鏈或支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，g。

2結(jié)果與分析

2.1直鏈、支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)與參比波長(zhǎng)的確定

利用淀粉經(jīng)I2-KI復(fù)合物溶液染色后直鏈淀粉呈藍(lán)色、支鏈淀粉呈紫色的原理，將直鏈與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)碘試劑處理后，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行400～800 nm的光譜掃描。由圖1可知，直鏈、支鏈淀粉的最大吸收波長(zhǎng)分別為634 nm（λ1）、539 nm（λ3）。按照雙波長(zhǎng)測(cè)定的等吸收點(diǎn)作圖法，確定直鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)為634 nm（λ1），參比波長(zhǎng)為 426 nm（λ2）；支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)為539 nm（λ3），參比波長(zhǎng)為763 nm（λ4）。

[TPMYH1.tif]

2.2直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)法，分別于已確定的雙波長(zhǎng)條件下測(cè)定不同濃度直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液的吸光度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制的直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如圖2、圖3所示，所得直鏈淀粉的回歸方程為y直=19796 0x-0.050 3，[JP3]r2=0.999 3；支鏈淀粉的回歸方程為y支=5.000 0x-0.021 3，r2=0.999 3。結(jié)果表明，直鏈淀粉濃度在4～44 mg/L之間， 支鏈

[FK（W10][TPMYH2.tif]

淀粉濃度在 20～120 mg/L之間，其碘復(fù)合物與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3不同資源珍珠粟種子的淀粉含量變化

由表1可見，供試樣品水分含量為7.92%～9.48%，脂肪含量為5.43%～8.27%；烘干樣品中直鏈淀粉含量為1607%～23.48%，[CM（17*2]支鏈淀粉含量為52.34%～73.80%，總[CM）]

[FK（W10][TPMYH3.tif]

淀粉含量為71.11%～90.55%；品種間支鏈淀粉變異系數(shù)（10.27%）大于直鏈淀粉的變異系數(shù)（9.80%），表明珍珠粟種子間總淀粉差異主要由支鏈淀粉引起；品種間支鏈、直鏈淀粉含量比的變異系數(shù)最大（15.83%），表明不同品種珍珠粟種子的食用與加工特性有較大差異，其中樣品1-1的直鏈淀粉含量最低，支鏈淀粉含量最高。

2.4雙波長(zhǎng)法的測(cè)定穩(wěn)定性試驗(yàn)

取直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液，每隔5 min測(cè)定1次吸光度。從表2可見，直鏈、支鏈淀粉溶液在所測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)測(cè)定值的相對(duì)偏差RSD<1%，15～30 min內(nèi)檢測(cè)結(jié)果基本穩(wěn)定，表明試驗(yàn)重復(fù)性好，雙波長(zhǎng)法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定。

2.5雙波長(zhǎng)法測(cè)定精確度評(píng)價(jià)

選擇50、69、1-1樣品，經(jīng)脫水、脫脂處理后對(duì)其中的直鏈、支鏈淀粉含量分別進(jìn)行4次重復(fù)測(cè)定，由表3可見，4次試驗(yàn)值之間的一致性較好，3個(gè)樣品的直鏈、支鏈淀粉的RSD均小于1%，表明采用雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定珍珠粟淀粉樣品中直鏈、支鏈淀粉具有較高的精確度。

2.6樣品加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

為了檢測(cè)珍珠粟資源種子中淀粉含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，在已測(cè)得直鏈、支鏈淀粉含量的樣品中，選擇88號(hào)樣品，添加準(zhǔn)確稱量的直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，求其回收率。由表4可見，直鏈、支鏈淀粉其回收率在95.00%～98.29%之間，RSD均小于1.5%，滿足檢測(cè)要求，說明該分析檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確度，適用于同時(shí)測(cè)定珍珠粟種子樣品中的直鏈、支鏈淀粉含量。

3結(jié)論

雙波長(zhǎng)比色法是一種相對(duì)準(zhǔn)確、穩(wěn)定、被廣泛應(yīng)用于植物淀粉含量精細(xì)檢測(cè)的快速檢測(cè)方法。本研究利用碘試劑與淀粉發(fā)生的顯色反應(yīng)，建立了采用雙波長(zhǎng)分光光度法同時(shí)測(cè)定珍珠粟直鏈與支鏈淀粉含量的快速檢測(cè)方法。由其光譜掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，珍珠粟直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)分別為634、426 nm，支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)分別為539、763 nm；直鏈淀粉濃度在4～44 mg/L之間線性良好，支鏈淀粉濃度在20～120 mg/L之間線性良好。此方法精密度高、穩(wěn)定性好（RSD均小于1.00%）、樣品加標(biāo)回收率在95.00%～9829%之間，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差?。≧SD小于1.5%），可用于珍珠粟直鏈、支鏈淀粉含量的準(zhǔn)確檢測(cè)。

禾谷類作物中直鏈與支鏈淀粉的含量與比例會(huì)直接影響作物的色澤、香氣、柔軟性等食用品質(zhì)與出飯率、貯藏加工特性[19]。有研究認(rèn)為，含有中等偏低直鏈淀粉含量的品種或支鏈淀粉含量高的品種的品質(zhì)較好[20-21]。本研究在建立珍珠粟淀粉雙波長(zhǎng)法檢測(cè)基礎(chǔ)上，對(duì)不同品種珍珠粟中直鏈淀粉、支鏈淀粉進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：供試不同珍珠粟種質(zhì)資源的食用加工特性有較大差異，直鏈、支鏈淀粉的含量分別為 16.07%～23.48%、52.34%～73.80%，總淀粉含量為 71.11%～90.55%，支鏈淀粉含量差異是總淀粉含量差異的主要因素，其變異系數(shù)（10.27%）高于直鏈淀粉含量的變異系數(shù)。樣品88、50、59、1-1的品種優(yōu)良，直鏈淀粉含量較低、支鏈淀粉含量較高，可作為選種栽培、精深加工的主要品種。

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