香菇胞外多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗氧化活性

摘要：利用高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和紅外光譜（IR）分析法等對(duì)香菇（Lentinus edodes）發(fā)酵液中香菇胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）2種組分EPS-1、EPS-2的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行特征分析，測(cè)定其抗氧化活性。結(jié)果表明，EPS-1的單糖組成主要為鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖，其摩爾比為1.7 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]3.0；EPS-2的單糖組成主要為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖，其摩爾比為7.2 ∶[KG-*3]2.3 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]8.4；EPS-1、EPS-2均有較強(qiáng)的抗氧化活性，EPS-2 體外抗氧化活性相對(duì)更強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：香菇；胞外多糖；化學(xué)結(jié)構(gòu)；抗氧化

中圖分類號(hào)： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0313-03

收稿日期：2015-12-30

作者簡介：元向東（1970—），男，河南安陽人，碩士，講師，主要從事生物技術(shù)及分析研究。E-mail：18865489890@163.com。

香菇（Lentinus edodes）別稱花菇，世界第二大真菌門側(cè)耳科香菇屬（Lentinus）食用菌，口味鮮美，營養(yǎng)豐富，富含多糖、維生素、蛋白質(zhì)、多元酚、樸菇素、膳食纖維等多種生物活性物質(zhì)，其中，香菇多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、保肝護(hù)肝和降血糖等作用[1-2]。液體發(fā)酵是目前真菌發(fā)酵中應(yīng)用較為廣泛的一項(xiàng)技術(shù)，具有可以工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)、規(guī)模大、產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效益高等優(yōu)點(diǎn)，除在液體發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量菌絲或孢子外，還會(huì)在發(fā)酵液中分泌多糖、多肽等具有生理活性的物質(zhì)。本研究采用DEAE-52纖維素柱和G-100葡聚糖，對(duì)香菇發(fā)酵液中的胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）進(jìn)行分離純化，得到EPS-1、EPS-2等2種組分。在此基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和紅外光譜（IR）分析法等分別分析這2種組分的分子量、單糖組成、鍵型和抗氧化活性，以期為香菇液體的深層發(fā)酵及香菇胞外多糖的開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1菌株與培養(yǎng)基供試菌種香菇由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科學(xué)院真菌研究所保存并提供。深層液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、維生素B1 0.1 g、水1 L，自然pH值，于搖床25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng) 10 d。深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、維生素B1 0.1 g、蛋白胨3 g、酵母粉3 g、水1 L，自然pH值，100 L氣升式液體深層發(fā)酵罐中培養(yǎng)14 d，發(fā)酵溫度為25 ℃，連續(xù)通入無菌空氣。

1.1.2試劑30% H2O2，由天津市凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；95%乙醇，由天津市百世化工有限公司生產(chǎn)；DPPH、DEAE-52纖維素、葡聚糖G-100，由Sigma公司生產(chǎn)；苯酚，由天津市天大化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；濃硫酸、濃鹽酸，由淄博化學(xué)試劑廠有限公司生產(chǎn)；三氯乙酸，由天津大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.1.3儀器752-N紫外可見分光光度計(jì)、DK-S24型恒溫水浴鍋、DZF-6021型真空干燥箱，均由上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；GC2010氣相色譜儀，由日本島津公司生產(chǎn)；Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀，由美國熱電集團(tuán)生產(chǎn)；TDL-5-A型臺(tái)式離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；LXJ-68-02型離心機(jī)，由北京醫(yī)療儀器修理廠生產(chǎn)；1260型高效液相色譜儀，由美國安捷倫科技有限公司生產(chǎn)。

1.2多糖的提取

將香菇的發(fā)酵液離心，除去胞外產(chǎn)物；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，加入3倍體積的95%無水乙醇；4 ℃醇沉24 h，3 500 r/min 離心20 min；棄去上清液，將獲得的沉淀真空冷凍干燥即得胞外多糖。

1.3多糖組分的測(cè)定

采用DEAE-纖維素離子交換柱對(duì)EPS組分進(jìn)行分析：用濃度梯度為0.2、0.5、1.0 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度控制在1 mL/min；每個(gè)洗脫梯度收集25支試管，每支試管收集2 mL，采用苯酚-硫酸法[3]測(cè)定收集溶液的多糖濃度，繪制洗脫曲線。采用葡聚糖G-100凝膠柱對(duì)多糖組分進(jìn)行純度鑒定[4]：用0.1 mol/L NaCl溶液充分平衡層析柱，用蒸餾水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫速度控制在0.1 mL/min；每支試管收集 2 mL，采用硫酸-苯酚法測(cè)定收集溶液的多糖濃度，繪制洗脫曲線。

1.4EPS 2種組分分子量的測(cè)定

用0.2 mol/L NaCl水溶液將葡聚糖（標(biāo)準(zhǔn)品）及EPS樣品均配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，采用高效凝膠滲透色譜法[5]測(cè)定多糖分子量，高效液相色譜儀測(cè)定條件為：Shodex SB-806 HQ 8.0 mm×300 mm色譜柱，柱溫為5 ℃，0.2 mol/L NaCl溶液為流動(dòng)相，進(jìn)樣量為100 μL，流速為 0.5 mL/min；以1 g分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（Mw）為縱坐標(biāo)、保留時(shí)間（ET）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Mw=1-0.342 9ET+11.975（r2= 0.999 1）；根據(jù)樣品上柱測(cè)定保留時(shí)間，計(jì)算樣品的分子量。

1.5EPS 2種組分的單糖構(gòu)成

糖樣品經(jīng)過0.25 mol/L H2SO4 100 ℃加熱16 h完全水解，或者不經(jīng)過水解處理，按照Blakeney等的方法[6]將各單糖制備成全乙?；谴佳苌?；采用氣相色譜分析糖的構(gòu)成，分離柱為島津公司生產(chǎn)的0.25 mm×30 m毛細(xì)管柱DB-1，柱溫為210 ℃，N2流速為30 mL/min。

1.6EPS 2種組分化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

試驗(yàn)樣品采用KBr壓片，采用Perkin Elmer公司的Spectrun GXFT-IR紅外光譜分析系統(tǒng)對(duì)EPS 2種組分進(jìn)行化學(xué)成分結(jié)構(gòu)分析。

1.7EPS 2種組分體外抗氧化活性測(cè)定

EPS 2種組分清除DPPH自由基的測(cè)定方法為：2 mL 95%乙醇或0.1 μmol/L DPPH與2 mL濃度在100～1 000 mg/L 之間的EPS溶液進(jìn)行混合，25 ℃水浴15 min，517 nm 處測(cè)定吸光度[7]。EPS清除羥基自由基的測(cè)定采用Smironff等的方法[8]，多糖還原力的測(cè)定采用Oyaizu的方法[9]。

2結(jié)果與分析

2.1香菇胞外多糖的組成

采用DEAE-纖維素柱分析EPS發(fā)現(xiàn)，EPS含有EPS-1、EPS-2這2個(gè)組分（圖1-A）。對(duì)EPS的2個(gè)組分采用葡聚糖G-100凝膠進(jìn)行分離，結(jié)果表明，EPS-1、EPS-2均分離得到1個(gè)單一的洗脫峰（圖1-B、C），這表明EPS-1、EPS-2 均為純的多糖。

[TPYXD1.tif]

2.2EPS 2種組分的分子量

由表1、圖2可知，EPS-1、EPS-2的數(shù)均分子量分別為532、714，重均分子量分別為3.58×104、1.20×105，多分散系數(shù)分別為67.26、168.19。

[FK（W7][HT6H][JZ][WTHZ]表1EPS-1、EPS-2的分子量測(cè)定結(jié)果[HTSS]

[HJ*5][BG（！][BHDFG1*2，WK4*2，WK5*2。3，WK4。2W]組分MwMnMzMw/MnMz/Mw

[BHDG1*2，WK4*2，WK5*2。3，WK4。2DWW]EPS-13.58×1045325.21×10567.2614.56

[BHDW]EPS-21.20×1057147.56×105168.196.30[BG）F]

注：Mw為重均分子量；Mn為數(shù)均分子量；Mz為Z平均分子量；Mw/Mn為多分散系數(shù)；Mz/Mw為多分散指數(shù)。

2.3EPS 2種組分的單糖構(gòu)成

由表2可知，EPS-1單糖組成有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖，占比分別為28.8%、15.5%、55.7%，其摩爾比為 1.7 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]3.0；EPS-2單糖組成有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖，占比分別為36.7%、10.7%、5.6%、47.0%，其摩爾比為7.2 ∶[KG-*3]2.3 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]8.4。

2.4EPS 2種組分化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

由圖3可見，EPS-1在3 431.24 cm-1附近有明顯的由 —OH 伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，在2 935.87 cm-1附近有C—H伸縮振動(dòng)引起的吸收峰[10]；1 643.86 cm-1處有酰胺羰基存在的吸收峰；1 433.41 cm-1處為C—H變角振動(dòng)；1 060.88 cm-1處有糖環(huán)上C—O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，這表明多糖中存在D—吡喃環(huán)[11]；812.01 cm-1處有α糖苷鍵存在的吸收峰，568.58 cm-1 處有吡喃環(huán)伸縮振動(dòng)引起的吸收峰。

由圖4可見，EPS-2在3 415.82 cm-1附近有較強(qiáng)的由—OH伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，2 925.17 cm-1附近有C—H

[FK（W23][TPYXD2.tif；S+3mm]

伸縮振動(dòng)引起的吸收峰[10]；1 638.03 cm-1處有酰胺羰基存在的吸收峰；1 416.65、1 618.54 cm-1處為C—H變角振動(dòng)；1 153.83、1 079.34、1 023.96 cm-1處的吸收峰由C—O、O—H伸縮振動(dòng)引起，這表明多糖中存在D-吡喃環(huán)[11-12]。

2.5EPS 2種組分的體外抗氧化活性

由圖5可見，隨EPS-1、EPS-2濃度的升高，EPS-1、EPS-2的抗氧化活性上升；EPS-1、EPS-2濃度為 1 200 mg/L 時(shí)，對(duì)DPPH的清除率分別為（57.85±0.69）%、（78.96±1.65）%，對(duì)羥基自由基的清除率分別為（11.50±0.43）%、（47.20±2.06）%，還原力分別為0.61±0.01、1.26±0.03，EPS-2的抗氧化能力明顯優(yōu)于EPS-1。

3結(jié)論與討論

香菇發(fā)酵液經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱和葡聚糖G-100凝膠柱分離，可得到多糖組分EPS-1、EPS-2。氣相色譜[CM（25]法測(cè)定EPS-1、EPS-2單糖組成發(fā)現(xiàn)，EPS-1中主要含[CM）]

[FK（W12][TPYXD5.tif]

[JP3]有鼠李糖、甘露糖，而EPS-2中主要含有鼠李糖、葡萄糖，對(duì)[JP2]EPS-1、EPS-2化學(xué)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，2種多糖均為D-吡喃型。

有研究表明，當(dāng)多糖濃度為1 000 mg/L時(shí)，蟲草對(duì)DPPH的清除率為20%[13]，樺褐孔菌對(duì)DPPH的清除率為10%[14]；多糖濃度為1 200 mg/L時(shí)，桑黃的還原力為0.10[15]，樹舌靈芝的還原力為0.40[16]。本研究結(jié)果表明，EPS-1、EPS-2濃度為1 200 mg/L時(shí)，EPS-1、EPS-2對(duì)DPPH的清除率分別為57.85%±0.69%、78.96%±1.65%，對(duì)羥基自由基的清除率分別為11.50%±0.43%、47.20%±2.06%，還原力分別為0.61±0.01、1.26±0.03，與蟲草等相比，EPS-1、EPS-2 對(duì)DPPH、羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力及較強(qiáng)的還原力，且EPS-2的抗氧化活性相對(duì)更強(qiáng)。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

[1]呂國英，范雷法，張作法，等. 香菇多糖研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（2）：183-188.

[2]張昕，張強(qiáng)，梁彥龍. 香菇多糖的抗腫瘤和降糖作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國藥事，2008，22（2）：149-154.

[3]Gilles D M，Hamilton K A，Rebers J K，et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry，2002，28（3）：350-356.

[4]王博，徐莎，黃琳娟，等. 白芨多糖BSPI-A的分離純化及結(jié)構(gòu)研究[J]. 食品科學(xué)，2010，31（17）：120-123.

[5]Lin H J，Qin X M，Aizawa K，et al. Chemical properties of water-soluble pectins in hot-and cold-break tomato pastes[J]. Food Chemistry，2005，93（3）：409-415.

[6]Blakeney A B，Harris P J，Henry R J，et al. A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis[J]. Carbohydrate Research，1983，113（2）：291-299.

[7]Liu X H，F(xiàn)eng P Y，Shi Y L. Study of isolation and purification of polysaccharides from fresh mycelia of Agaricus blazei Mussill and its anti-fatigue effect[J]. Journal of Southwest Agricultural University，2006，28（2）：190-194.

[HT8.]

[8]Smirnoff N，Cumbes Q J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemistry，1989，28（4）：1057-1060.

[9]Oyaizu M. Antioxidative activity of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin layer chromatography[J]. J Soc Food Sci，1986，35（11）：771-775.

[10]Zou X. Quick isolation and purification of extracellular polysaccharides from Agaricus blazei Murill and elementary property analysis[J]. Food Science，2005，17（4）：14.

[11]Liu X，Zhao M. Antioxidant activities and functional composition content of selected Phyllanthus emblica fruits juice[J]. Food and Fermentation Industries，2006，32（5）：151-154.

[12]Melo M S，F(xiàn)eitosa J A，F(xiàn)reitas A P，et al. Isolation and characterization of soluble sulfated polysaccharide from the red seaweed [JP3]Gracilaria cornea[J]. Carbohydrate Polymers，2002，49（4）：491-498.

[13]李曉磊，趙珺，李丹，等. 冬蟲夏草深層發(fā)酵胞外和蛹蟲草子實(shí)體抗氧化活性的對(duì)比研究[J]. 食品科技，2009，34（9）：75-79.

[14]Shen J W，Yu H Y，Huo Y F，et al. Purification of polysaccharide of Phaeoporus obliquus and the bioactivity of purified fractions[J]. Mycosystema，2009，28（3）：564-570.

[15]Xie L Y，Zhang Y，Peng W H. Immune function and antioxidant activity of intracellular polysaccharides from Phellinus baumii[J]. Food Science，2011，32（9）：276-281.

[16]Li Z P，Wu P，Wu S Q. Study on antioxidant activity of Ganoderma applanatum intracellular polysaccharides[J]. Science and Technology of Food Industry，2010，31（6）：108-110.