含水量、儲存條件對儲存期小麥中DON、NIV毒素含量變化的影響

姚振宇++殷憲超++俞明正++董飛++祭芳++徐劍宏++史建榮

摘要：研究含水量分別為11.5%、12.8%、15.7%的小麥在4 ℃冷庫、25 ℃恒溫室、常溫庫、地下倉庫4種環(huán)境下儲藏0～90 d鐮刀菌毒素DON、NIV含量的變化情況，并對不同儲存環(huán)境下小麥含水量變化情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明：90 d內(nèi)，3種含水量的小麥在4 ℃冷庫和25 ℃恒溫室條件下，DON、NIV毒素均未發(fā)生顯著變化。儲存在常溫庫和地下倉庫2種不可控環(huán)境下的3種含水量小麥在60 d后DON毒素含量降低，NIV毒素含量未發(fā)生顯著變化。

關(guān)鍵詞：小麥；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；雪腐鐮刀菌烯醇；儲藏；鐮刀菌毒素

中圖分類號： S339.3+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0300-03

收稿日期：2016-10-11

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31601594）；國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目（編號：GJFP2016001003）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20130714）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（16）1059]。

作者簡介：姚振宇（1991—），男，江蘇鹽城人，碩士研究生，主要從事真菌毒素檢測和治理方法研究。

通信作者：殷憲超，博士，助理研究員，主要從事真菌毒素檢測和治理方法研究。Tel：（025）84392001；E-mail：yinxianchao@126.com。

鐮刀菌毒素是由鐮刀菌屬（Fusarium spp.）中多種真菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，在自然界中分布十分廣泛，不僅對食品產(chǎn)生嚴(yán)重污染，還會對人畜健康造成危害[1-3]。鐮刀菌毒素會引起人和牲畜的急性、慢性中毒，具有致癌、致畸、致突變等潛在危害，還與某些地方性疾病的發(fā)生有緊密聯(lián)系。鐮刀菌在代謝過程中會產(chǎn)生多種代謝物，包括雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、伏馬毒素（fumonisin，F(xiàn)B1）等[4-6]。近年來，隨著人們生活水平和健康意識的不斷提高，食品質(zhì)量安全越來越受到關(guān)注，有關(guān)鐮刀菌毒素污染問題逐漸受到重視[7]。研究表明，在小麥赤霉病常發(fā)地區(qū)，小麥及小麥加工制品中含有多種鐮刀菌毒素[8-9]，這些毒素主要是由鐮刀菌侵染小麥后產(chǎn)生的[10-11]。以江蘇省為例，2010、2012年為赤霉病重發(fā)生年份，2013—2015年均為赤霉病中度發(fā)生年份。筆者實驗室長期監(jiān)測江蘇省各市縣小麥中的鐮刀菌毒素，監(jiān)測結(jié)果顯示，2010—2012年小麥中DON毒素檢出率分別為100%、33%、96%[12]。赤霉病的連續(xù)暴發(fā)和鐮刀菌毒素的污染現(xiàn)狀引起了相關(guān)部門的高度重視，相關(guān)質(zhì)檢機構(gòu)每年采集大量的小麥樣品進(jìn)行DON等鐮刀菌毒素的檢測。質(zhì)檢機構(gòu)采集小麥樣品進(jìn)行真菌毒素檢測時需要臨時保存大量樣品，并留有備樣及副樣。而小麥樣品的含水量和保存條件將直接影響儲存期小麥中真菌毒素含量的穩(wěn)定性。因此，明確不同含水量小麥樣品在常見儲存環(huán)境下的毒素含量變化規(guī)律，對于質(zhì)檢機構(gòu)小麥樣品收樣、處理、保存具有重要的指導(dǎo)意義。本研究分析感染赤霉病的不同含水量小麥在不同儲存條件下鐮刀菌毒素隨時間變化的規(guī)律，旨在為質(zhì)檢機構(gòu)收樣、處理和保存小麥樣品提出建議。

1材料與方法

1.1樣品的處理

從田間選擇已經(jīng)感染赤霉病的小麥，收獲、脫粒并充分混勻。通過鼓風(fēng)干燥箱45 ℃干燥，其間不斷混勻，檢測含水量，在達(dá)到預(yù)設(shè)含水量要求后取樣，將3份小麥分別調(diào)整含水量至低（12%以下）、中（13%左右）、高（16%左右）3個梯度。利用谷物分樣器將每個含水量的小麥分成12份，每份約 4 kg，裝入聚乙烯袋子。樣品平均分成4組，每組隨機選取3份，分別放置于25 ℃恒溫室、4 ℃冷庫、常溫庫、地下倉庫保存。每個含水量小麥樣品隨機取樣3份，作為對照。

1.2儀器與試劑

Triple Quad 3500 LC-MS/MS（美國AB Sciex公司）；YP30002電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；LD-Y440A高速萬能粉碎機（上海頂帥電器有限公司）；WGLL-230BE電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）；N-EVAP-112氮吹儀（Organomation公司）；HYL-C組合式搖床（太倉市強樂試驗設(shè)備有限公司）；HOBO記錄儀（美國ProV2U23-004 OonsetHOBO公司）；谷物水分測量儀（日本KETT PM-8188-A公司）。DON、NIV標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%，美國Sigma公司）；甲醇和乙腈（色譜純，德國Merck公司）。

1.3儲藏期溫度、濕度測定

使用HOBO記錄儀連續(xù)記錄儲藏期溫度、濕度。

1.4小麥含水量的測定與樣品觀察

使用谷物水分測量儀每隔3～5 d測量儲藏期小麥的含水量。測量時，充分混勻待測小麥，多點取樣。每袋每次測量3次。觀察儲存樣品外觀變化，有無霉變、蟲蛀情況發(fā)生。

1.5毒素含量的測定

鼓風(fēng)干燥小麥樣品至含水量11.5%，經(jīng)粉碎機磨碎，每個樣品稱取5 g（精確至0.01 g），倒入100 mL三角瓶中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙腈溶液，三角瓶封口后放置于搖床中200 r/min振蕩提取30 min。振蕩后將上清液倒入5 mL離心管并2 500 r/min離心5 min，離心后收集上清液待凈化。

將固相萃取柱[Amino（NH2）Agilent，美國]用3 mL 80%分析純乙腈活化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附表面時，立即移入 2 mL 上述凈化液體，加入3 mL 80%乙腈洗脫2次，合并洗脫液于15 mL離心管中，隨后放置于氮吹儀上，控制水浴溫度50 ℃，氮吹至近干，加入色譜甲醇定容至1 mL，過0.22 μm有機濾膜，裝入2 mL進(jìn)樣瓶中供LC-MS/MS分析，使用 LC-MS/MS對毒素進(jìn)行分析，色譜柱：Thermo Syncronis 1.7 μm，C18 100 mm ×2.1 mm，流動相5 mmol/L醋酸銨水和色譜甲醇，進(jìn)樣量2 μL，柱溫40 ℃，氮氣流速0.7 mL/min。

1.6統(tǒng)計分析

使用SPSS 19.0軟件、Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同含水量小麥的設(shè)定

獲得的不同含水量小麥樣品分別為低含水量11.5%、中含水量12.8%、高含水量15.7%。

2.2儲藏環(huán)境溫度、濕度變化

如圖1所示，90 d儲存期內(nèi)，恒溫室、冷庫都表現(xiàn)了較好的環(huán)境穩(wěn)定性，恒溫室溫度（24.7±0.6）℃，濕度較低，為（47.0±0.6）%。冷庫溫度（4.7±0.3）℃，濕度（77.0±0.6）%。常溫庫和地下室表現(xiàn)出一定的溫度和濕度波動，常溫庫溫度（29.6±4.7）℃，濕度（57.7±4.2）%。地下室溫度（25.0±2.8）℃，濕度較大，為（92.6±2.4）%。

[TPYZY1.tif]

2.3小麥含水量的測定

如圖2所示，0～90 d儲藏期間，4 ℃冷庫和25 ℃恒溫室儲存條件下的小麥含水量未發(fā)生顯著變化，地下室和常溫庫環(huán)境中3種含水量小麥的含水量都呈現(xiàn)先升高、后下降、最后趨于平穩(wěn)的趨勢。儲存于地下室和常溫庫的15.7%含水量小麥均于5 d時天出現(xiàn)了蟲蛀情況，11.5%、12.8%含水量小麥均在55 d開始出現(xiàn)蟲蛀現(xiàn)象。

[FK（W19][TPYZY2.tif]

2.4儲存期小麥鐮刀菌毒素濃度的變化

儲存前小麥樣品DON毒素濃度為（2 800±340）μg/kg，定期取樣檢測小麥樣品中DON毒素濃度，結(jié)果表明，11.5%、12.8%、15.7% 3種含水量的小麥在4 ℃冷庫儲存90 d后，DON毒素濃度分別為（2 769±259）、（2 672±275）、（2 877±244）μg/kg。在25 ℃恒溫室儲存90 d后，11.5%、12.8%、15.7%3種含水量的小麥中DON毒素濃度分別為（2 497±296）、（2 656±256）、（2 498±192）μg/kg。2種條件下保存90 d后小麥樣品DON毒素濃度與儲存前比較差異均不顯著。儲存于地下室條件下的11.5%含水量的小麥樣品60 d時DON濃度為（2 313±248）μg/kg，與儲存前樣品比較，DON毒素含量顯著降低，70 d時DON濃度為（2 054±276）μg/kg。12.8%含水量的小麥樣品在地下室和常溫庫儲存條件下70 d時DON濃度分別為（2 288±276）、（2 127±276）μg/kg，與儲存前比均顯著降低。15.7%含水量小麥樣品在地下室和常溫庫儲存條件下，60 d時DON毒素濃度明顯降低（圖3）。

儲存前檢測小麥樣品NIV毒素濃度為（464±33）μg/kg。11.5%含水量小麥儲存于4 ℃冷庫、25 ℃恒溫室、地下室、常溫庫90 d后，NIV濃度分別為（465±29）、（466±52）、（433±48）、（401±38）μg/kg。12.8%含水量小麥在4種環(huán)境下NIV濃度分別為（454±45）、（470±53）、（427±45）、（400±53）μg/kg。15.7%含水量小麥在4種儲存條件下NIV濃度分別為（460±29）、（461±52）、（426±42）、（384±31）μg/kg。儲存于4種條件下的11.5%、12.8%、15.7% 3種含水量小麥儲存90 d后NIV毒素濃度均未發(fā)生顯著變化（圖4）。

3結(jié)論與討論

禾谷鐮刀菌侵染小麥后，會在小麥穗部發(fā)生赤霉病病害，并產(chǎn)生鐮刀菌毒素如DON、NIV等，導(dǎo)致收獲后的小麥攜帶病原菌。儲存期的小麥，鐮刀菌是否會繼續(xù)生長并產(chǎn)生毒素導(dǎo)致毒素濃度增加，成為待檢測鐮刀菌毒素小麥樣品保存的主要難點之一。本研究將3種含水量小麥儲存于4種環(huán)境中，均未發(fā)現(xiàn)DON、NIV毒素濃度增加現(xiàn)象。抽樣觀測發(fā)現(xiàn)，部分小麥在后期出現(xiàn)了蟲蛀現(xiàn)象，但未出現(xiàn)發(fā)霉情況，因此未有可見霉菌生長情況。前人研究發(fā)現(xiàn)，在小麥儲存期當(dāng)小麥含水量超過17%～19%時，禾谷鐮刀菌能生長并產(chǎn)生毒素[11，13-14]。本研究中小麥樣品含水量最高為15.7%，低于17%，[JP2]因此未發(fā)生鐮刀菌繼續(xù)生長并產(chǎn)毒的情況。儲存于地下室和常溫庫的小麥樣品從60 d開始，DON毒素濃度降低，這與樣品發(fā)生蟲蛀的時間基本一致。儲存于25 ℃恒溫環(huán)境中的小麥未出現(xiàn)蟲蛀現(xiàn)象，也未出現(xiàn)DON毒素濃度降低的情況，這也說明蟲蛀與DON濃度減少存在一定關(guān)系。正常的收獲小麥完全曬干后水分通常在12.5%以內(nèi)，常溫下儲存時含水量一般[JP3]在14%以內(nèi)[15-17]。本研究選擇的小麥含水量區(qū)間在11.5%～157%，基本涵蓋了正常收獲成熟小麥的含水量范圍。

小麥質(zhì)檢機構(gòu)追訴期通常不超過3個月，因此本研究設(shè)計的90 d存儲期符合樣品小麥保存期限的要求。本研究的4種儲存條件中，4 ℃是較為理想的樣品儲存環(huán)境，11.5%、12.8%、15.7% 3個含水量的小麥在90 d儲存期內(nèi)，DON、NIV毒素含量均未發(fā)生顯著變化。地下室和常溫庫環(huán)境相對不受控制，溫度、濕度變化較大，容易導(dǎo)致小麥含水量變化，并可能發(fā)生霉變或蟲蛀等情況。25 ℃恒溫間如果短期存放不會對樣品中鐮刀菌毒素的濃度發(fā)生影響，但是存放時間較長，或樣品含水量達(dá)到17%以上時，也存在樣品發(fā)霉或蟲蛀導(dǎo)致毒素含量變化的可能。將含水量低于15.7%的小麥樣品保存于4 ℃以下的環(huán)境中，在90 d內(nèi)小麥DON、NVI毒素濃度不會發(fā)生顯著變化。

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