激活素A對大鼠肌細胞增殖分化的作用

趙為民++涂楓++任守文++方曉敏++李碧俠++趙芳++付言峰++王學敏

摘要：激活素A（Activin A）是轉化生長因子β（transforming/mL growth factor-β，TGF-β）超家族中的一員，具有重要的生物學功能。為研究Activin A在肌肉發(fā)育中的作用，以大鼠肌細胞L6為研究模型，通過時空表達譜、CCK-8以及流式細胞周期分析等方法來進行研究。結果表明Activin A隨著肌細胞由增殖轉向分化狀態(tài)，其表達量呈下降趨勢。添加不同濃度的Activin A（5～25 ng/mL）均能顯著促進L6細胞的增殖速度，且這種促進細胞增殖的效應隨著Activin A濃度的增大而逐漸增強。Activin A能顯著增加S期在細胞周期中的比例，同時縮短G1和G2期在細胞周期中所占的比例。此外，通過添加Activin A顯著抑制了肌肉分化標記基因Myog的表達。以上結果為進一步研究 Activin A在肌肉發(fā)育中的作用機制奠定了基礎。

關鍵詞：大鼠；激活素A（Activin A）；肌細胞；增殖；細胞周期

中圖分類號： S828.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0287-03

收稿日期：2016-09-12

基金項目：國家轉基因生物新品種培育重大專項（編號：2014ZX08006-003）；國家生豬現(xiàn)代產業(yè)技術體系建設專項（編號：CARS-36）。

作者簡介：趙為民（1983—），男，湖北鐘祥人，博士，助理研究員，主要從事轉基因與育種研究。Tel：（025）84391941；E-mail：zhao_weimin1983@aliyun.com。

通信作者：王學敏，碩士，助理研究員，主要從事轉基因與豬生產研究。Tel：（025）84391941；E-mail：wxm116@sina.com。

Activin A最初是從豬的卵泡液中分離的一種糖蛋白，通過二硫鍵連接2個β A亞基構成二聚體形式[1]。Activin A作為TGF-β 超家族的一員，通過與其受體ActRⅡ/ⅡB結合，激活下游的Smad2/ Smad3通路，從而發(fā)揮重要的生物學功能。Activin A最初的功能是刺激卵泡刺激素（follicle-stimulating/mL hormone，F(xiàn)SH）的分泌，促進卵泡發(fā)育[1]，后來發(fā)現(xiàn)Activin A在其他的生理過程中也發(fā)揮著重要作用。研究表明Activin A在炎癥反應中發(fā)揮著關鍵作用[2]，例如它在由脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）介導的炎癥反應中能調節(jié)關鍵炎癥因子的表達[3]，此外在呼吸道過表達Activin A可誘導嚴重的肺部炎癥反應[4]。Activin A還能促進包括睪丸支持細胞、卵巢顆粒細胞以及肝星狀細胞等多種細胞的增殖[5-7]。近年來報道顯示Activin A在肌肉的生長發(fā)育中也起到重要作用。Activin A在IL-1α和TNF-α炎癥因子處理后的肌細胞分化中起到抑制作用[8]。過量的Activin A可導致肌肉的萎縮和惡病質，且這種效應比MSTN還要強[9]。MSTN是肌肉發(fā)育的一個負調控因子，通過基因編輯技術敲除MSTN可使生物個體如豬表現(xiàn)出典型的雙肌性狀[10-11]，這說明 Activin A可作為一個新的肌肉靶標基因，通過對其敲除可為適度提高我國地方豬品種的瘦肉率提供一種新途徑。然而 Activin A在肌肉發(fā)育中的作用機制仍不清楚，這阻礙了對其進行有效挖掘和利用。本研究利用大鼠肌細胞L6為模型，探討Activin A在肌細胞增殖分化中的作用，這將有助于更好地揭示Activin A基因在肌肉發(fā)育中的調控機制，同時也為進一步在豬上進行基因編輯Activin A的研究提供了理論基礎。

1材料和方法

1.1材料

Trans1-T1菌株購于北京全式金生物技術有限公司；大鼠L6肌細胞購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學細胞中心；Activin A重組蛋白購于R&D Systems；RNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司；CCK-8購于日本同仁；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus）、Taq酶、PrimeScriptTM RT Master Mix反轉錄試劑盒購于 TaKaRa公司；Activin A ELISA試劑盒購于武漢博士德生物；DEME、胎牛血清、雙抗購于Thermo Fisher公司；引物合成、基因測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2RNA的提取及cDNA的合成

RNA提取主要步驟：細胞加入Trizol裂解液室溫裂解 5 min，然后加入200 μL氯仿混勻15 s，靜置3 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心10 min，取上清約400 μL，轉移到新的 1.5 mL EP管中，加入等體積的70%乙醇，顛倒混勻，10 000 r/min 過柱離心45 s，棄掉廢液。加 500 μL去蛋白液 RE，12 000 r/min 離心 45 s，棄掉廢液。加入 700 μL 漂洗液 RW 12 000 r/min離心 60 s，棄掉廢液。加入 500 μL 漂洗液 RW，12 000 r/min 離心 60 s，棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回空收集管中，12 000 r/min 離心 2 min，在吸附膜的中間部位加適量 RNase free 水，室溫放置 2 min，12 000 r/min 離心 1 min，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA的合成主要步驟為：500 ng/mL RNA，2 μL 5×primescript RT Master Mix，補水至10 μL。37 ℃ 反應15 min，85 ℃ 處理1 min，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3熒光定量PCR

熒光定量PCR按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書操作，體系如下：cDNA 2 μL，2 ×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，Rox reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，補水到20 μL。反應程序為95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.4L6肌細胞培養(yǎng)及分化

L6細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基（90%DEME+10%胎牛血清+1%雙抗）中，然后置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其密度達到80%時，按照1 ∶[KG-*3]3傳代。待分化時，換成含2%馬血清的DMEM進行分化，每2 d換1次培養(yǎng)液。

1.5Activin A ELISA測定

參照試劑盒說明，主要步驟：加樣品和標準品，37 ℃反應 90 min。[JP3]不洗。加生物素標記抗體，37 ℃反應 60 min，1×洗滌緩沖液洗滌 3 次。加 ABC，37 ℃反應 30 min，1×洗滌緩沖液洗滌 5 次。TMB 37 ℃反應 20～25 min，加入 TMB 終止液，讀數(shù)。

1.6細胞增殖分析

在96孔板中接種L6細胞，然后將96孔板放在培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）12 h后，每組加入終濃度為5、10、25 ng/mL 的Activin A，每個處理組重復4次，分別培養(yǎng)24、48、72 h。然后向每孔加入10 μL CCK-8，在培養(yǎng)箱內孵育 1～4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.7細胞周期分析

細胞用胰酶消化后，以1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基，用4 ℃預冷的PBS洗細胞2次，離心去PBS，加入 4 ℃預冷的70%乙醇-20 ℃固定過夜，次日離心棄去固定液，用 4 ℃預冷PBS 5 mL 洗細胞2次，加入0.5 mL PBS[含 50 μg /mL 碘化乙錠（PI），100 μg /mL RNase A]重懸細胞，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.8數(shù)據(jù)處理

運用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，統(tǒng)計方法采用t檢驗（α=0.05）。

2結果與分析

2.1Activin A在肌細胞增殖分化中的表達

如圖1-A所示，隨著L6細胞由增殖期（growth medium，GM）轉向分化期（differentiation medium，DM）的第1天（DM1）和第3天（DM3），Activin A蛋白在L6細胞增殖期的表達量要極顯著高于其在L6細胞分化期的表達量（P<001）。Myog作為一個肌肉分化標記基因用來指示肌細胞的分化狀態(tài)，從圖1-B可以看出，隨著L6細胞的分化，Myog表達量從GM到DM1及DM3也極顯著上升（P<0.01），說明L6細胞分化成功。

2.2Activin A 對肌細胞增值的作用

由圖2可見，當添加不同濃度的Activin A 培養(yǎng)24 h后，L6細胞的增殖速度在各濃度之間并無顯著差異。當繼續(xù)培養(yǎng)至48 h和72 h后，Activin A的效應逐漸顯現(xiàn)出來。在48 h中，添加5 ng/mL的細胞增殖速度要顯著高于對照組（P<005），而添加10 ng/mL和25 ng/mL的細胞增殖速度要極顯著高于對照組（P<0.01），Activin A對細胞增殖的效應隨著濃度的增大而逐漸增強。Activin A對L6細胞在72 h的增殖情況與48 h的增殖情況類似，但都達到差異極顯著（P<001）。進一步分析發(fā)現(xiàn)在72 h時，不同濃度的Activin A對細胞增殖的幅度都要高于其在48 h時對細胞增殖的幅度。

2.3Activin A 對肌細胞周期的作用

為了探討Activin A是否通過影響細胞周期來影響細胞增殖，添加Activin A培養(yǎng)48 h后，通過流式細胞周期分析發(fā)現(xiàn)Activin A能影響L6細胞各個周期的比例大?。▓D3-A）。與對照組相比，Activin A能極顯著提高S期在細胞周期中的比例（P<0.01），同時極顯著降低G1和G2期在細胞周期中的比例（P<0.01）（圖3-B）。

2.4Activin A 對肌細胞分化的影響

由圖4可見，在L6細胞分化液中添加Activin A培養(yǎng) 48 h 后，通過定量PCR結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Activin A極顯著抑制了肌肉分化標記基因Myog的表達（P<0.01）。

3討論

骨骼肌發(fā)育是一個極其復雜的生物學過程，在一系列轉錄因子例如PAX3/PAX7、生肌調節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）以及其他基因的相互作用下，由生肌前體細胞分化為成肌細胞，后者再經過增殖、分化、融合形成多核肌管，最終發(fā)育形成肌纖維和肌肉組織[12-13]，因而肌細胞如何增殖和分化成為研究肌肉發(fā)育機制的重點。

研究表明基因的表達水平往往與其細胞所處的狀態(tài)緊密相關[14-15]。當肌細胞L6由增殖狀態(tài)轉向分化狀態(tài)時，可以看到Activin A的表達量顯著下降，說明其可能與L6細胞的增殖密切相關。進一步的試驗表明當外源添加Activin A后，細胞增殖的速度明顯高于對照組，說明其確實促進了細胞增殖，且這種促進效應顯現(xiàn)出濃度依賴性，這與Activin A對其他細胞的增殖效應[7]相似。細胞周期分為G1、S、G2/M等3個時期，G1是細胞的合成前期，而S期是細胞DNA的復制期[CM（25]，當細胞不可逆地退出細胞周期后開始分化[16]，因而調節(jié)這2個時期的比例大小可影響細胞的增殖與分化。研究表明一些miRNA基因可通過促進G1期的停滯來促進肌細胞的分化[17-18]，相反一些miRNA可通過促進細胞增殖以及提高細胞周期中S期比例來抑制肌細胞的分化[19]。本研究表明 Activin A可降低L6細胞周期中G1和G2期的比例而增加S期的比例，同時結合添加Activin A可抑制肌肉分化標記基因Myog的表達，說明Activin A很可能是通過上述機制來抑制肌細胞的分化，其具體機制仍需進一步研究。

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