檸檬醛及其衍生物對油茶炭疽病菌的抑菌活性

國穎+周玉慧 王鵬 +陳尚钘 +范國榮 王宗德

摘要：采用菌絲生長速率法研究天然檸檬醛及其衍生物共10種化合物對油茶炭疽病菌生長的影響，并與廣譜抗菌農(nóng)藥抑菌作用進行對比。結(jié)果表明，天然檸檬醛及其衍生物對油茶炭疽病菌均有一定的抑制作用，且抑制效果隨濃度升高而增強。橙花素、檸檬腈和檸檬醛1，2-丙二醇縮醛的抑制中濃度EC50分別為12.28、14.09、42.78 mg/L。所選的4種廣譜農(nóng)藥多菌靈、百菌清、甲基硫菌靈、代森錳鋅的抑制中濃度EC50分別為4.37、29.86、37.98、14.62 mg/L。通過比較分析，檸檬腈、橙花素和檸檬醛1，2-丙二醇縮醛對油茶炭疽病菌的抑制效果優(yōu)于或類似于廣譜抗菌農(nóng)藥，具有較高的開發(fā)價值。

關(guān)鍵詞：天然檸檬醛；衍生物；油茶炭疽病菌；抑菌活性

中圖分類號： S435.659文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0167-04

收稿日期：2015-10-22

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360163）；中央財政林業(yè)科技推廣示范資金[編號：JXTG（2014）-10]；江西省林業(yè)科技創(chuàng)新專項（編號：201502）；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：DC201309）。

作者簡介：國穎（1991—），女，黑龍江鶴崗人，碩士研究生，主要從事植物資源利用研究。E-mail：497147883@qq.com。

通信作者：陳尚钘，副教授，碩士生導師，主要從事植物資源利用與活性研究。Tel：（0791）83813243；E-mail：csxing@126.com。

油茶是我國特有的木本油料植物，其種子能夠壓榨出上等食用油，茶油素有“東方橄欖油”“液體黃金”的美譽，具有較高的經(jīng)濟價值。近年來，油茶炭疽病發(fā)病頻率高、危害嚴重，各地常年因炭疽病減產(chǎn)10%～30%，重病減產(chǎn)50%以上。目前油茶炭疽病害以化學藥劑防治為主[1]，但病菌易對化學殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，從而逐漸降低抑菌效果，長期使用會對環(huán)境造成嚴重危害。同時，化學藥劑的使用會導致綠色食品——茶油農(nóng)藥殘留超標。從高效環(huán)保角度出發(fā)，天然源抗菌劑已成為新農(nóng)藥的研發(fā)趨勢[2-3]。

山雞椒[Litsea cubeba （Lour.） Pers.]別稱山蒼子，是樟科木姜子屬的落葉小喬木或灌木，從其果實、葉子等組織中提取分離出的化學成分就是山蒼子油，廣泛用于香精香料的生產(chǎn)。大量研究表明，山蒼子油及其主要成分檸檬醛具有較強的抑菌作用[4]。方德秋等綜述中提到，早在1945年國外科學家就對檸檬醛抗菌功能進行了報道，研究發(fā)現(xiàn)，檸檬醛對細菌也有抑制作用[5]。同時，山蒼子油及檸檬醛可直接用于消除黃曲霉，并對一些成蟲有一定的熏蒸作用[6]。因此，山蒼子油及檸檬醛在抑菌方面具有很高的開發(fā)價值[7-8]。

山蒼子油主成分及其衍生物對真菌、細菌等病原菌的研究較多[9-10]，而對其在油茶等經(jīng)濟樹種病害防治方面的研究較少。本研究開展了山蒼子油主成分檸檬醛及其9種衍生化合物對油茶炭疽病原菌抑制作用的研究，并與廣譜抗菌農(nóng)藥抑菌作用進行對比分析，為篩選出高效的植物源殺菌劑提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供試菌種及來源油茶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides），由江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理學實驗室提供。把保存在試管中的菌種接入含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，以備接種使用。

1.1.2供試樣品及來源天然檸檬醛、檸檬醛1，2-丙二醇縮醛、檸檬醛乙二醇縮醛、紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、甲基紫羅蘭酮、異甲基紫羅蘭酮、鳶尾酮、橙花素、檸檬腈由江西農(nóng)業(yè)大學植物天然產(chǎn)物與林產(chǎn)化工研究所利用天然檸檬醛為原料，經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾改造得到，以上樣品GC純度均為95%以上。其他化學藥品從市場上購買，均為分析純。

1.1.3儀器與設(shè)備LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-ID型無菌超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；GHP-250型智能培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1化合物抑菌活性測定對植物病原菌菌絲生長的抑制作用采用生長速率法[11]測定。培養(yǎng)基的制備：在無菌條件下，將配制好濃度的化合物（用不超過總體積2%的吐溫將化合物充分溶于無菌水中）與滅菌好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）混合均勻，倒入已滅菌處理的培養(yǎng)皿中，配制成終濃度為800.00、160.00、32.00、6.40、1.28 mg/L的化合物，農(nóng)藥的濃度根據(jù)使用劑量說明配制。取已經(jīng)活化與培養(yǎng)好的病原菌菌餅（直徑5 mm），接種到上述培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿接種1個菌餅，每個濃度重復3次。以未添加化合物的PDA平板作為試驗對照。當試驗對照的平板菌落直徑長到培養(yǎng)皿的70%以上時，用直尺以十字交叉法測量直徑，取平均值。采用下列公式計算抑制率：

菌落直徑=菌落平均直徑-菌餅直徑（5 mm）。

菌絲生長抑菌率=[（對照菌落生長量-處理菌落生長量）/對照生長量]×100%。

1.2.2數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)為3組重復試驗的平均值，采用Microsoft Excel 2007軟件和DSP 7.05專業(yè)版進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.2.3抑制中濃度計算根據(jù)天然檸檬醛及其衍生物作藥劑處理對油茶炭疽病菌菌落的生長抑制結(jié)果，分別進行一元回歸統(tǒng)計分析，以濃度的對數(shù)值為x，以抑菌率為y，分別得出各自的毒力回歸方程，并求出EC50和各自的相關(guān)系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1檸檬醛及其衍生物對油茶炭疽病原菌的抑制作用

2.1.1抑菌效果分析從表1可知，天然檸檬醛及其衍生物對油茶炭疽病原菌均有一定的抑制效果，當濃度在800 mg/L時，橙花素、檸檬腈和檸檬醛1，2-丙二醇縮醛的抑菌率均達到100.00%，天然檸檬醛的抑菌率為88.19%，而檸檬醛乙二醇縮醛和鳶尾酮的抑菌率最低，分別只有37.09%和4259%。隨著化合物濃度的降低，對油茶炭疽病的抑制作用也隨之逐漸降低，但不同的化合物其抑菌率隨濃度降低的速率各不相同。濃度對檸檬醛1，2-丙二醇縮醛、β-紫羅蘭酮的抑菌率影響較為明顯，當濃度為 800.00 mg/L 時，檸檬醛1，2-丙二醇縮醛的抑菌率為10000%，β-紫羅蘭酮的抑菌率為74.81%；而當濃度為160.00 mg/L時，檸檬醛1，2-丙二醇縮醛的抑菌率只有1750%，β-紫羅蘭酮的抑菌率為24.44%。濃度在800.00 mg/L 與160.00 mg/L之間，抑菌率分別相差82.50百分點和 50.37百分點。但對鳶尾酮和紫羅蘭酮的抑菌率影響不是很顯著，濃度800.00 mg/L和 160.00 mg/L 之間，鳶尾酮的抑菌率相差9.26百分點，紫羅蘭酮的抑菌率相差只有13.73百分點。

從圖1可以看出，這10種化合物對油茶炭疽病菌都有一定的抑制作用，隨著濃度的增高，抑制作用逐漸增強，而不同的化合物抑制作用并不相同。

2.1.2毒力回歸方程建立從表2可以看出，天然檸檬醛及其9種衍生物對油茶炭疽病菌的毒力大小依次是：檸檬腈、橙花素、檸檬醛1，2-丙二醇縮醛、異甲基紫羅蘭酮、天然檸檬醛、甲基紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、鳶尾酮、檸檬醛乙二醇縮醛、紫羅蘭酮。其中橙花素和檸檬腈的毒力最接近，EC50分別是14.09、12.28 mg/L，檸檬醛1，2-丙二醇縮醛的EC50值是42.78 mg/L。異甲基紫羅蘭酮和天然檸檬醛最接近，分別是132.27、149.91 mg/L。檸檬腈、橙花素和檸檬醛1，2-丙二醇[CM（25]縮醛對油茶炭疽病菌的毒力較強，抑菌效果較好，而鳶尾[CM）]

[FK（W37][TPGY11.tif]

酮、檸檬醛乙二醇縮醛、紫羅蘭酮對油茶炭疽病菌的抑制中濃度較大，說明它們對油茶炭疽病菌的抑制效果不明顯。

2.24種農(nóng)藥對油茶炭疽病菌的抑菌作用

2.2.1抑菌效果分析由表3可知，這4種農(nóng)藥對油茶炭疽病菌均有一定的抑制效果。農(nóng)藥濃度的選擇以每種農(nóng)藥使用時[CM（25]的有效濃度為依據(jù)。當所選4種農(nóng)藥的有效濃度最高時，抑菌效果是多菌靈（100.00%）>百菌清（93.50%）>甲基硫菌靈（78.05%）>代森錳鋅（65.87%），當有效濃度次高時，多菌靈的抑菌效果最好（95.94%），代森錳鋅的抑菌效果最差（52.38%）。隨著農(nóng)藥有效濃度的降低，它們的抑菌效果也在不斷降低，代森錳鋅和多菌靈隨著有效濃度的降低呈逐漸降低的趨勢，降低幅度不是很大，百菌清的抑菌率隨有效濃度變化比較明顯，當有效濃度最高時為93.50%，當有效濃度減半時抑菌率為65.04%，而甲基硫菌靈當有效濃度為 [JP2]50.00 mg/L 時，抑菌率為71.54%，當有效濃度為25.00 mg/L時抑菌率為27.64%，抑菌率下降了4390百分點。

從圖2至圖5可以看出，隨著濃度的增加，這4種化合物對油茶炭疽病菌抑制作用逐漸增強，且不同的化合物抑制作用不相同。當濃度較低時，代森錳鋅和多菌靈對油茶炭疽病菌抑制作用也較強。

[TPGY22.tif]

2.2.2毒力回歸方程建立由表4可知，4種農(nóng)藥對油茶炭疽病菌的毒力大小依次是多菌靈、代森錳鋅、百菌清、甲基硫菌靈，其中多菌靈的抑制中濃度EC50為4.37 mg/L，而甲基硫菌靈的抑制中濃度EC50為37.98 mg/L。這4種農(nóng)藥對油茶炭疽病菌均有一定的抑制效果，且抑制效果都較好。

通過比較天然檸檬醛及其9種衍生物與農(nóng)藥對油茶炭疽病菌活性的抑制效果分析可以看出，橙花素、檸檬腈和檸檬醛1，2-丙二醇縮醛的抑制中濃度與4種農(nóng)藥相當，說明它們與所選擇的4種農(nóng)藥具有相近的抑菌效果。

3結(jié)論

研究結(jié)果表明，天然檸檬醛及其9種衍生物與4種廣譜農(nóng)藥一樣對油茶炭疽病菌均有一定的抑制效果。供試化合物作[CM（25]為藥劑濃度越高時，抑菌效果越好。天然檸檬醛及其9種[CM）]

衍生物中橙花素、檸檬腈和檸檬醛1，2-丙二醇縮醛的抑菌率最好， 在濃度800.00 mg/L時均達到100.00%， 它們的抑菌效果依次為檸檬腈>橙花素>檸檬醛1，2-丙二醇縮醛，抑菌中濃度分別為12.28、14.09、42.78 mg/L。

4種農(nóng)藥的抑菌效果也有所不同，農(nóng)藥有效濃度最高時，抑菌效果順序是多菌靈>百菌清>甲基硫菌靈>代森錳鋅，當有效濃度稍降低時，多菌靈的抑菌效果最好，代森錳鋅的抑菌效果最差。多菌靈、代森錳鋅、百菌清、甲基硫菌靈4種農(nóng)藥的抑菌中濃度分別為4.37、14.62、2986、37.98 mg/L。

天然檸檬醛及其9種衍生物與4種廣譜農(nóng)藥相比，檸檬腈、橙花素和檸檬醛1，2-丙二醇縮醛的抑菌效果與4種廣譜農(nóng)藥相近，是值得開發(fā)用于抑制油茶炭疽病菌的化合物。

[HS2*5][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

[1]胡林峰，韓會娟，侯建虎. 六種植物的提取物抑菌活性研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（14）：2880-2881.

[2]Randrianarivelo R，Sarter S，Odoux E，et al. Composition and antimicrobial activity of essential oils of Cinnamosma fragrans[J]. Food Chemistry，2009，114（2）：680-684.

[3]陳兆森. 山蒼子資源的綜合利用[J]. 林化科技通訊，1987（1）：16-20.[HJ1.65mm]

[4]周玉慧，甘仙女，陳尚钘，等. 山蒼子油及檸檬醛提取分離與生物活性研究進展[J]. 生物災(zāi)害科學，2013，36（2）：148-153.

[5]方德秋，肖順元. 檸檬醛及香精油的抗菌性研究概述[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1994，6（2）：75-78.

[6]余伯良. 山蒼子油對霉菌抗菌性及其與黃曲霉產(chǎn)毒關(guān)系的研究[J]. 微生物學通報，1988，25（3）：144-147.

[7]江建國，陳京元，蔡三三，等. 10種殺菌劑對大葉黃楊壞損尾胞菌的毒力測定及應(yīng)用分析[J]. 湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學院學報，2008，6（4）：1-3.

[8]Saddiq A A，Khayyat S A. Chemical and antimicrobial studies of monoterpene：citral[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2010，98（1）：89-93.

[9]周勇，陶君娣，張家俊. 山蒼子揮發(fā)油及其主要成分檸檬醛的抗真菌作用的研究[J]. 中西醫(yī)結(jié)合雜志，1984，4（9）：558-559.

[10]周玉慧，陳尚钘，范國榮，等. 檸檬醛衍生物對植物病原菌的抑制活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（3）：81-83.

[11]慕立義. 植物化學保護研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1944.