利用染色體片段代換系定位水稻抽穗開花期耐熱性QTL

張昌泉++陳飛++洪燃++李錢峰++顧銘洪++劉巧泉

摘要：利用以粳稻日本晴為受體、秈稻9311為供體的經(jīng)全基因組重測(cè)序的染色體片段代換系為材料，以水稻耐熱指數(shù)[（常溫結(jié)實(shí)率-高溫結(jié)實(shí)率）/常溫結(jié)實(shí)率]為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過比較江蘇揚(yáng)州2013年大田極端高溫和2012年常溫條件下水稻耐熱性的差異來定位水稻耐熱性QTL （數(shù)量性狀基因座位）。共檢測(cè)到3個(gè)耐熱性QTL，分別位于第2、第4和第12號(hào)染色體上，LOD（logarithm of odds）值分別為2.56、4.02和2.79，貢獻(xiàn)率分別為4.95%、7.99%和544%。其中qHT12.1表現(xiàn)為正向效應(yīng)，而qHT2.1和qHT4.1表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。相關(guān)研究為后續(xù)耐熱QTL的精細(xì)定位、克隆和高溫鈍感型優(yōu)異品種的培育提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水稻；染色體片段代換系；QTL；耐熱性

中圖分類號(hào)： S511.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0120-04

收稿日期：2016-09-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31561143008、31401354）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20140484）；教育部博士點(diǎn)基金（編號(hào)：20133250120001）。

作者簡(jiǎn)介：張昌泉（1981—），男，山東即墨人，博士，講師，研究方向?yàn)樗酒焚|(zhì)遺傳改良。Tel：（0514）87937537；E-mail：cqzhang@yzu.edu.cn。

通信作者：劉巧泉，博士，教授，研究方向?yàn)樗酒焚|(zhì)遺傳改良。Tel：（0514）87979242；E-mail：qqliu@yzu.edu.cn。

隨著全球氣候變暖，溫室效應(yīng)加劇，近幾年全球范圍內(nèi)極端高溫事件發(fā)生頻繁[1]，農(nóng)作物尤其是水稻產(chǎn)量和品質(zhì)受到了嚴(yán)重影響[2-3]。研究表明超過水稻最適生長(zhǎng)溫度后，溫度平均每上升1 ℃可造成10%的減產(chǎn)[4]。與此同時(shí)，溫度的升高也會(huì)間接影響氣候變化，從而造成高溫與干旱同時(shí)發(fā)生的頻率增加，加重了高溫以及干旱對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)造成的危害。高溫所造成的水稻減產(chǎn)效應(yīng)主要是通過影響開花期花粉的發(fā)育和授粉行為障礙而造成結(jié)實(shí)率顯著下降引起的水稻大幅減產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，水稻穎殼溫度在超過35 ℃的溫度下持續(xù)1 h就能造成花粉活力喪失而不育[5]。因此，鑒定和篩選耐熱性水稻品種資源，定位和克隆耐熱相關(guān)基因或QTL （quantitative trait loci），深入了解水稻耐熱性的分子遺傳調(diào)控機(jī)制是解決水稻高溫?zé)岷?、?yīng)對(duì)全球氣候變暖的根本途徑[6]。

近年來在水稻耐熱性方面已有較多的報(bào)道，研究表明水稻耐熱性的遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，是由多基因控制的數(shù)量性狀。在基因克隆方面，目前只有2個(gè)耐熱基因被克隆，如OgTT1所編碼的蛋白酶體α2亞基能夠保護(hù)細(xì)胞免受熱害[7]。此外，Wang等最近克隆的熱耐生長(zhǎng)調(diào)控因子TOGR1能通過調(diào)控rRNA的穩(wěn)定性來忍受熱損傷[8]。水稻抽穗開花期育性相關(guān)的耐熱基因目前尚未有克隆，但已經(jīng)鑒定出一批與抽穗開花期耐熱性相關(guān)的重要QTL位點(diǎn)，盡管理論上通過聚合這些QTL可以提高水稻的耐熱性，但由于定位QTL所用群體的差異以及QTL重現(xiàn)性的原因，這些QTL很難被有效利用。染色體片段代換系是通過多次回交和自交并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)建立起來的一套染色體片段導(dǎo)入系，由于遺傳背景單一，在復(fù)雜QTL精細(xì)定位和克隆方面具有非常強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。本研究以1套由粳稻品種日本晴為受體、秈稻品種9311為供體構(gòu)建的經(jīng)過全基因組重測(cè)序鑒定基因型的染色體片段代換系（chromosome segment substitution lines，CSSLs）為材料[9]，通過比較該CSSLs群體在2013年揚(yáng)州大田極端高溫和2012年常溫條件下結(jié)實(shí)率的差異來定位水稻耐熱性QTL。相關(guān)研究結(jié)果對(duì)于后續(xù)耐熱QTL的精細(xì)定位和克隆以及高溫鈍感水稻新品種的培育提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與種植環(huán)境

用于本試驗(yàn)的材料包括粳稻品種日本晴和秈稻品種9311和以日本晴為受體、9311為供體構(gòu)建的1套包括138個(gè)系的染色體片段代換系。該套材料是在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)進(jìn)行全基因組重測(cè)序基礎(chǔ)上繼續(xù)擴(kuò)建并再次進(jìn)行全基因組重測(cè)序基因分型而得到的遺傳背景清晰的染色體片段代換系，其中，導(dǎo)入片段覆蓋率為95.58%。上述材料分別于2012年和2013年種植于揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)同一試驗(yàn)田，通過隨機(jī)區(qū)組法，每個(gè)系種植3個(gè)重復(fù)，每系40苗。其中9311分2批播種，后續(xù)分析所用9311數(shù)據(jù)為提前批次播種材料（開花期在8月中旬）。

2012年種植的上述試驗(yàn)材料在水稻抽穗開花期大田氣候相對(duì)2013年較為正常。由圖1-A可見，從8月初到8月底，2013年的日最高溫度明顯高于2012年，且都超過30 ℃。與之對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)材料的抽穗開花期大部分位于這一階段（圖1-B、圖1-C）。因此，可以通過2年間大田氣溫的差異來比較分析CSSLs群體對(duì)高溫的響應(yīng)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1水稻田間農(nóng)藝性狀調(diào)查與耐熱指數(shù)

CSSLs群體以及雙親的農(nóng)藝性狀調(diào)查包括5項(xiàng)。生育期：通過隨機(jī)調(diào)查每個(gè)系5株水稻始穗期到播種期的天數(shù)來定義該系的抽穗期；總粒數(shù)：通過隨機(jī)選取每個(gè)系的6個(gè)主穗，計(jì)算每穗總粒數(shù)并取平均數(shù)；實(shí)粒數(shù)：在調(diào)查總粒數(shù)的同時(shí)，統(tǒng)計(jì)單個(gè)穗上所有充實(shí)籽粒之和，取其平均數(shù)；結(jié)實(shí)率：?jiǎn)蝹€(gè)水稻穗上實(shí)粒數(shù)與總粒數(shù)之比，每個(gè)系隨機(jī)取6個(gè)穗，取其平均值。水稻耐熱指數(shù)定義為每個(gè)系2012年（常溫）結(jié)實(shí)率與2013年（高溫）結(jié)實(shí)率的差值除以2012年結(jié)實(shí)率，該指數(shù)越小，說明該系耐熱性越好，指數(shù)越大，說明該系耐熱性越差。

1.2.2Bin-map繪制

基于全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，參照 Paran 等[10]的方法，根據(jù)每個(gè)系中包含代換片段的差異和在群體中代換片段的區(qū)域重疊，將供體片段人工切割成為一個(gè)獨(dú)立的重組斷點(diǎn)（Bin），共構(gòu)建了138個(gè)代換系的重組斷點(diǎn)圖譜（Bin-Map）圖。通過分析，共得到了367個(gè)Bin，Bin的大小范圍在0.01～8.92 Mb之間。

1.2.3數(shù)據(jù)處理和QTL定位

農(nóng)藝性狀的輸入采用Excel軟件完成，基本統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件完成。利用Windows QTL IciMapping 3.3軟件，采用逐步回歸似然比的方法來檢測(cè)秈粳稻染色體片段代換系的遺傳效應(yīng)。將每個(gè)Bin計(jì)作1個(gè)分子標(biāo)記用于軟件分析。LOD值設(shè)為2.5，Permutation test為1 000，P<0.05，當(dāng)LOD值>Permutation test值時(shí)，即說明該Bin存在1個(gè)QTL位點(diǎn)，并可以得到相應(yīng)的LOD值、貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值。QTL命名遵循McCouch制定的原則[11]。

2結(jié)果與分析

2.1親本及CSSLs群體耐熱性的表現(xiàn)

首先分析了CSSLs群體的親本秈稻9311和粳稻日本晴的耐熱指數(shù)。由表1可見，9311的耐熱指數(shù)為0.048，日本晴的耐熱指數(shù)為0.350，即在高溫條件下，9311的平均結(jié)實(shí)率與正常年份相比下降了4.8%，而日本晴下降了35.0%。這說明2親本間耐熱指數(shù)具有極顯著差異，并且日本晴易受環(huán)境高溫影響從而導(dǎo)致結(jié)實(shí)率變化過大，耐熱指數(shù)較大，耐熱性不好。與之相反，9311受高溫影響較小，適應(yīng)性較強(qiáng)，其基因組中可能攜帶有耐熱相關(guān)的QTL或基因。隨后分析了CSSLs群體中不同系的耐熱指數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)群體耐熱性變異幅度非常大，變異系數(shù)為0.550。耐熱指數(shù)從0.026到0.750都有分布，耐熱指數(shù)均值為0.224。從次數(shù)分布（圖2）上來看，耐熱指數(shù)呈現(xiàn)連續(xù)性分布特點(diǎn)，其中雙親位于分布柱狀圖主峰的兩側(cè)，說明耐熱指數(shù)性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，并且CSSLs群體的不同系間差異較大。

2.2耐熱性QTL定位

Map圖譜，并將每一個(gè)Bin計(jì)作1個(gè)分子標(biāo)記，利用QTL Icimapping V 3.3軟件對(duì)耐熱性進(jìn)行了QTL分析。由表2可見，共檢測(cè)到耐熱性QTL 3個(gè)，分別位于第2、第4和第12號(hào)染色體上。其中qHT2.1被定位在水稻2號(hào)染色體上物理位置為470～6.58 Mb之間1.88 Mb的區(qū)間內(nèi)，其表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，即耐熱性較差，但該位點(diǎn)LOD值偏低。而qHT4.1被定位在水稻第4染色體上1段0.57 Mb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)段較小且效應(yīng)值相對(duì)最大，但同樣為負(fù)效應(yīng)，表現(xiàn)為不耐熱。此外，qHT12.1被定位在第12號(hào)染色體上1段1.47 Mb的區(qū)間內(nèi)，其表現(xiàn)為正效應(yīng)，LOD值為2.79，貢獻(xiàn)率為5.44%，該位點(diǎn)具有較好的耐熱性。

2.3耐熱性QTL穩(wěn)定性分析

盡管基于生育期分析，CSSLs群體抽穗開花期大部分都位于高溫天氣范圍內(nèi)，但也有個(gè)別系高溫年份抽穗開花期對(duì)應(yīng)的日最高溫度并不高，因此，重點(diǎn)分析了包含有上述Bin株系的抽穗期和耐熱指數(shù)，發(fā)現(xiàn)這些系的抽穗期都在高溫天氣范圍內(nèi)且耐熱指數(shù)也表現(xiàn)出很好的趨勢(shì)，并無(wú)矛盾之處。此外，由圖3可見，通過重疊作圖法，qHT2.1在4個(gè)系中都有攜帶，且表現(xiàn)出與親本日本晴極顯著的差異。CSSLs群體中有2個(gè)系攜帶qHT4.1，與不含有該位點(diǎn)的系N92以及親本日本晴的耐熱指數(shù)同樣存在極顯著差異。耐熱性較強(qiáng)的qHT12.1存在于3個(gè)系中，其耐熱指數(shù)與親本日本晴相比也存在極顯著差異。上述結(jié)果表明，這3個(gè)檢出的QTL比較可靠且在不同的系中能夠重復(fù)檢出。

[FK（W22][TPZCQ3.tif]

3討論與結(jié)論

本研究利用1套經(jīng)全基因組重測(cè)序方式獲得的遺傳背景清晰的CSSLs群體為研究材料，利用不同年份間水稻抽穗開花期溫度的差異作為處理，以相對(duì)結(jié)實(shí)率為耐熱性指標(biāo)，對(duì)CSSLs群體的耐熱性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，水稻抽穗開花期的耐熱性表現(xiàn)為連續(xù)分布，屬于典型的數(shù)量遺傳性狀。本研究所用的CSSLs群體是在分子標(biāo)記檢測(cè)基礎(chǔ)上構(gòu)建并經(jīng)全基因組重測(cè)序方式進(jìn)行了基因型的鑒定，由于每個(gè)株系的遺傳背景和供體染色體片段的長(zhǎng)度及位置均已準(zhǔn)確獲知，因此，在QTL定位的精確性方面有了很大的提高[9]。利用該套材料，一共鑒定了3個(gè)QTL，其中只有qHT12.1具有較好的耐熱性，因此，可以在該區(qū)段內(nèi)開發(fā)分子標(biāo)記以用于高溫鈍感水稻新品種的培育。另外2個(gè)QTL盡管來源于高溫鈍感的秈稻9311，但其表現(xiàn)為不耐熱。因此，在育種利用方面，可以選擇日本晴中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的QTL作為耐熱QTL加以利用。

近年來關(guān)于水稻耐熱性QTL定位的報(bào)道已有很多，一般采用秈粳交構(gòu)建的重組自交系進(jìn)行分析，少數(shù)利用秈秈交群體進(jìn)行了研究。在耐熱性鑒定方面都是采用在人工氣候室高溫處理的策略，盡管有效控制了溫度和濕度，但只能模擬自然高溫氣候條件，而大田高溫氣候涉及各種因素，其對(duì)水稻的熱脅迫尚未有QTL定位研究。本研究利用2013年水稻抽穗開花期的自然極端高溫天氣作為高溫處理，與正常溫度年份作比較，所鑒定的QTL更能真實(shí)反映這些位點(diǎn)的耐熱效應(yīng)。從鑒定結(jié)果來看，檢出的QTL較少，說明了大田環(huán)境的復(fù)雜性。從已有的耐熱QTL研究來看，趙志剛等利用低世代回交群體鑒定了3個(gè)QTL[12]；陳慶全等利用秈秈交構(gòu)建的重組自交系群體僅檢測(cè)到了1個(gè)穩(wěn)定耐熱QTL[13]；盤毅等利用重組自交系群體鑒定了2個(gè)QTL[14]；劉周等利用秈秈交群體構(gòu)建的BC2F3導(dǎo)入系群體定位到12個(gè)耐熱性QTL，其中在第12號(hào)染色體上檢測(cè)到的qHSI12.1[15]，與本研究中定位到的qHT12.1位置十分接近，且效應(yīng)也類似，可能是同一個(gè)位點(diǎn)；Ye等利用多個(gè)群體檢測(cè)到3個(gè)能重復(fù)出現(xiàn)的QTL，并利用近等基因系精細(xì)定位了其中的qHTSF4.1[16]，經(jīng)比較，該QTL盡管位于4號(hào)染色體，但并不與本研究中的qHT4.1重合。本研究中另外鑒定到的2個(gè)位點(diǎn)都與已知的不重合，可能是新的位點(diǎn)。綜上所述，盡管目前幾乎在每一條染色體上都有QTL被檢測(cè)到，但多數(shù)耐熱性QTL的遺傳效應(yīng)較小且在不同的品種中差異很大，暗示了抽穗期耐熱性的遺傳機(jī)制非常復(fù)雜，為相關(guān)基因的精細(xì)定位和克隆造成了很大困難。

隨著水稻耐熱性研究的不斷深入，耐熱水稻資源的挖掘和有利耐熱QTL的鑒定和利用是當(dāng)下水稻耐熱性改良的重要研究方向[6]。盡管已有很多QTL被鑒定出來，但QTL定位的精度和穩(wěn)定性多數(shù)需要進(jìn)一步驗(yàn)證，只有少數(shù)QTL如qHTSF4.1可能比較有利用價(jià)值。當(dāng)然，已經(jīng)克隆的耐熱基因如OgTT1和TOGR1更是后續(xù)育種利用的重要基因資源。本研究中定位到的3個(gè)QTL由于所在株系遺傳背景清晰，效應(yīng)也比較明確，尤其是qHT4.1的定位區(qū)間非常小，為后續(xù)QTL精細(xì)定位和克隆奠定了很好的基礎(chǔ)。對(duì)于qHT12.1，由于其表現(xiàn)為耐熱性，因此可以以此為供體，用于耐熱粳稻新品種的改良。

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