成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21對(duì)胰島素抵抗肝細(xì)胞葡萄糖攝取的影響及機(jī)制

白潔，王金鑫，宋紫暄，吳志敏，高雁，朱澤，李光明(天津醫(yī)科大學(xué)，天津00070；武警廣西總隊(duì)醫(yī)院；天津市美聯(lián)博科技有限公司)

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成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21對(duì)胰島素抵抗肝細(xì)胞葡萄糖攝取的影響及機(jī)制

白潔1，王金鑫1，宋紫暄1，吳志敏2，高雁3，朱澤1，李光明1
(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2武警廣西總隊(duì)醫(yī)院；3天津市美聯(lián)博科技有限公司)

目的 觀察體外合成成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)對(duì)胰島素抵抗(IR)肝細(xì)胞葡萄糖攝取的影響，并探討其機(jī)制。方法 體外合成具有一定穩(wěn)定性的熒光標(biāo)記的FGF21 mRNA。將肝細(xì)胞置于含34.4 μg/mL重組胰島素和1 μg/mL地塞米松及10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，誘導(dǎo)建立IR肝細(xì)胞模型，將其分為模型對(duì)照組，胰島素組和FGF21組。模型對(duì)照組不添加任何藥物，胰島素組加入1 μg/mL重組胰島素，F(xiàn)GF21組電轉(zhuǎn)入FGF21 mRNA。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定3組細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖吸收量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)3組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1) mRNA表達(dá)，Western blotting法檢測(cè)3組GLUT1蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型對(duì)照組相比，F(xiàn)GF21組葡萄糖吸收量升高，細(xì)胞GLUT1 mRNA及蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)。與模型對(duì)照組相比，胰島素組葡萄糖吸收量不明顯，細(xì)胞GLUT1 mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P均>0.05)。結(jié)論 體外合成的FGF21 mRNA可以改善IR肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，其機(jī)制與增加GLUT1表達(dá)有關(guān)。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；體外轉(zhuǎn)錄mRNA;葡萄糖攝??；胰島素抵抗；肝細(xì)胞

胰島素抵抗(IR)是胰島素的外周靶組織對(duì)內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低，導(dǎo)致生理劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常的生理效應(yīng)。IR是多種代謝性疾病包括高血壓、血脂異常、冠心病、腦血管疾病伴2型糖尿病(T2DM)等發(fā)生的危險(xiǎn)因素。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)是FGF家族成員，主要在肝臟中表達(dá)，以內(nèi)分泌方式在體內(nèi)發(fā)揮作用[1]。FGF21具有調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)葡萄糖代謝平衡的作用。Berglund等[2]報(bào)道，F(xiàn)GF21可以緩解肥胖糖尿病模型小鼠的IR，持續(xù)調(diào)節(jié)體內(nèi)糖脂代謝，刺激機(jī)體糖吸收，且不依賴胰島素的參與，可用于IR相關(guān)的T2DM治療。體外轉(zhuǎn)錄mRNA是新型的基因分子藥物類型，對(duì)比質(zhì)粒DNA與病毒載體，無(wú)基因插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)免疫原性問(wèn)題。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)是機(jī)體分布最廣的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，是人體轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的主要載體，與代謝緊密相關(guān)，主要功能是調(diào)節(jié)葡萄糖攝取[3]。2016年5～10月，我們對(duì)IR細(xì)胞模型電轉(zhuǎn)入體外合成的FGF21 mRNA，觀察其能否改善IR細(xì)胞模型的葡萄糖攝取，為其用于T2DM的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒PT7TS-FGF21、T7-GFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。正常人肝細(xì)胞L02由天津醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，F(xiàn)BS購(gòu)自Invitrogen公司，T7 RNA快速高效合成試劑盒購(gòu)自Ambion公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、FastQuant RT Kit和SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技有限公司，葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，重組人胰島素、地塞米松、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ECL發(fā)光液購(gòu)自北京索萊寶公司。兔抗人、山羊抗兔IgG二抗和β-actin購(gòu)自Abcam公司，限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、SalⅠ和EcoRⅤ購(gòu)自TransGen Biotech公司。引物合成于GENEWIZ公司。

1.2 IR模型細(xì)胞的建立 參照文獻(xiàn)[4, 5]方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝細(xì)胞接種于96孔板，加入含20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞加入含34.4 μg/mL重組胰島素和1 μg/mL地塞米松及10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，誘導(dǎo)建立IR肝細(xì)胞模型。

1.3 FGF21 mRNA的體外合成 構(gòu)建質(zhì)粒PT7TS-FGF21-GFP，從T7-GFP質(zhì)粒中擴(kuò)增GFP基因，其上游引物為5′-CTGTCGAC (SalⅠ) ACTCACTATAGGGCC-3′、下游引物為5′-CGGATATC (EcoRⅤ) CTTTACTTGTACAGCTC-3′。 PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次;72 ℃ 10 min。連接PT7TS-FGF21載體雙酶切載體片段與GFP回收片段，轉(zhuǎn)化后擴(kuò)增重組質(zhì)粒;經(jīng)雙酶切鑒定后，按照T7 RNA快速高效合成試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

1.4 IR肝細(xì)胞的分組與處理 將IR肝細(xì)胞分為模型對(duì)照組、胰島素組和FGF21組。模型對(duì)照組不給予任何藥物，胰島素組加入1 μg/mL重組胰島素，F(xiàn)GF21組電轉(zhuǎn)入FGF21 mRNA。FGF21 mRNA向IR肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法：取IR肝細(xì)胞加入胰酶消化，加入5 mL PBS制成單細(xì)胞懸液，室溫離心，去上清，加入1 mL OPTI-MEM重懸細(xì)胞為2.5×107/mL。加入30 μg待轉(zhuǎn)染FGF21 mRNA至重懸細(xì)胞液，轉(zhuǎn)移細(xì)胞液至相應(yīng)規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯，電轉(zhuǎn)細(xì)胞分為3組，電轉(zhuǎn)參數(shù)分別為500 V 500 μs、400 V 500 μs、300 V 500 μs。電擊后，電轉(zhuǎn)杯置于恒溫培養(yǎng)箱中5～10 min，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，熒光倒置顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)(即轉(zhuǎn)染效率)，結(jié)果顯示電轉(zhuǎn)參數(shù)為500 V 500 μs條件下細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為85%，細(xì)胞存活率為75%，顯著高于400 V 500 μs與300 V 500 μs兩組。因此選取500 V 500 μs進(jìn)行電轉(zhuǎn)。3組均在20%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。

1.5 肝細(xì)胞葡萄糖吸收量檢測(cè) 取3組細(xì)胞培養(yǎng)液，采用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法(GOD-POD)檢測(cè)培養(yǎng)基中的葡萄糖含量。樣本孔內(nèi)加入10 μL樣本和1 000 μL工作液，校準(zhǔn)孔內(nèi)加入10 μL校準(zhǔn)液和1 000 μL工作液，空白孔內(nèi)加入10 μL蒸餾水和1 000 μL工作液。將各孔混合液混勻后，置于37 ℃水浴鍋反應(yīng)10 min。酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度，利用空白孔調(diào)零。葡萄糖含量(mmol/L)=樣本吸光度(A)/校準(zhǔn)吸光度(A)×校準(zhǔn)液濃度。以未接種細(xì)胞的20%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基中的葡萄糖含量做對(duì)照，計(jì)算各組葡萄糖吸收量。葡萄糖吸收量=(20%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)含量-樣本培養(yǎng)液葡萄糖含量)/20%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)含量×100%。

1.6 肝細(xì)胞GLUT1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 用TRIzol試劑盒提取3組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞GLUT1 mRNA，以β-actin作為內(nèi)參，按照SYBR Green PCR Master Mix試劑說(shuō)明書(shū)操作。GLUT1上游引物5′-CGTGCTTATGGGTTTCTCCAAA-3′，下游引物5′-GACACCTCCCCCACATACATG-3′，擴(kuò)增片段123 bp。β-actin上游引物5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′，擴(kuò)增片段500 bp。反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，94℃ 30 s，64 ℃ 30 s，共30次循環(huán)。讀取Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算GLUT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 肝細(xì)胞GLUT1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集3組細(xì)胞提取總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品經(jīng)上樣，SDS-PAGE電泳分離，300 mA 2 h電轉(zhuǎn)PVDF膜上。5%脫脂牛奶TBST中室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)兔抗人GLUT1，4 ℃放置過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室溫孵育1 h。HRP-ECL發(fā)光法，曝光，浸入顯影液中1～2 min，清水漂洗后用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)掃描條帶，用Image J分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 3組葡萄糖吸收量比較 模型對(duì)照組葡萄糖吸收量為0.38±0.07，胰島素組為0.39±0.03，F(xiàn)GF21組為0.47±0.06。胰島素組葡萄糖吸收量與模型對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，F(xiàn)GF21組較模型對(duì)照組升高(P<0.05)。

2.2 3組GLUT1 mRNA表達(dá)比較 模型對(duì)照組、胰島素組、FGF21組GLUT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1、1.36±0.37、3.88±0.60。胰島素組GLUT1 mRNA表達(dá)量與模型對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),FGF21組較模型對(duì)照組升高(P<0.05)。

2.3 3組GLUT1蛋白表達(dá)比較 模型對(duì)照組、胰島素組、FGF21組GLUT1蛋白表達(dá)量分別為0.44±0.01、0.55±0.01、0.75±0.01。胰島素組GLUT1蛋白表達(dá)量與模型對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，F(xiàn)GF21組較模型對(duì)照組升高(P<0.05)。

3 討論

T2DM作為一種多基因遺傳性疾病，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，其基本特征為胰島β細(xì)胞功能缺陷和IR[6]。IR不僅是T2DM的發(fā)病機(jī)制之一，更貫穿于T2DM的發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程。IR主要涉及到胰島素的三個(gè)重要靶器官，即肝、骨骼肌和脂肪組織[7]。肝臟是胰島素作用敏感位點(diǎn)，維持血糖穩(wěn)定的重要器官。鑒于人正常肝細(xì)胞L02保留了人類肝細(xì)胞基本生物特性[8]，因此本研究選取L02來(lái)建立細(xì)胞模型，模擬了T2DM情況下細(xì)胞糖代謝狀態(tài)，同時(shí)觀察干預(yù)因素對(duì)模型細(xì)胞IR狀態(tài)下的糖代謝的影響，篩選提高胰島素敏感性的藥物。有研究表明[9]，腫瘤本身也存在IR，與肝腫瘤細(xì)胞相比，本研究中采用L02正常肝細(xì)胞建立IR肝細(xì)胞模型，能夠減少干擾因素，獲得更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；且與動(dòng)物模型相比，具有價(jià)格低、周期短、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

FGF21與機(jī)體糖脂代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)[10, 11]證明，F(xiàn)GF21敲除小鼠體內(nèi)糖異生減少，出現(xiàn)高血糖，小鼠體質(zhì)量輕度增加，葡萄糖耐量降低；而FGF21過(guò)表達(dá)小鼠體質(zhì)量減輕，葡萄糖耐量增加。近年來(lái)，F(xiàn)GF21作為糖尿病的治療靶標(biāo)，其降低糖尿病小鼠血糖、降低胰島素使用濃度、顯著改善糖尿病小鼠的肝臟胰島素敏感度等相關(guān)特性逐漸為研究人員所關(guān)注。本研究的創(chuàng)新之處在于利用電轉(zhuǎn)的方式使mRNA進(jìn)入細(xì)胞來(lái)發(fā)揮其作用。電穿孔技術(shù)是目前體外轉(zhuǎn)錄mRNA進(jìn)入細(xì)胞的普遍方法，與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染相比，mRNA電轉(zhuǎn)對(duì)電子設(shè)置要求相對(duì)較低，對(duì)細(xì)胞的毒性較小。Van Tendeloo等[12]研究表明，mRNA電轉(zhuǎn)細(xì)胞的存活率較高。本研究觀察了不同條件下FGF21 mRNA的電轉(zhuǎn)效率。結(jié)果顯示，電轉(zhuǎn)條件300、400、500 V時(shí)轉(zhuǎn)染率均超過(guò)50%，其中500 V時(shí)細(xì)胞具有較高的存活率，以此作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選取的最佳條件。鑒于引起機(jī)體產(chǎn)生IR的因素包括高濃度胰島素、糖皮質(zhì)激素、游離脂肪酸及炎癥因子等[13]，本研究模擬體內(nèi)高濃度胰島素狀態(tài)，同時(shí)配合糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)作用，建立IR體外細(xì)胞模型，選用34.4 μg/mL重組胰島素和1 μg/mL地塞米松。本實(shí)驗(yàn)采用GOD-POD檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量，對(duì)比經(jīng)典的需要放射性同位素3H或14C標(biāo)記參與的葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)，污染小、經(jīng)濟(jì)，不需要特殊儀器，且細(xì)胞可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)[14]。為了研究FGF21促進(jìn)IR模型肝細(xì)胞的葡萄糖攝取機(jī)制，我們檢測(cè)了IR模型肝細(xì)胞L02中的GLUT1 mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示FGF21 mRNA使模型細(xì)胞的GLUT1 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著提高，而GLUT1作為體內(nèi)分布最多的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，協(xié)助葡萄糖通過(guò)細(xì)胞膜。因此認(rèn)為，F(xiàn)GF21 mRNA提高IR模型肝細(xì)胞葡萄糖攝取的作用可能與其增加GLUT1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，我們首次將FGF21 mRNA電轉(zhuǎn)入IR肝細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)可以改善IR狀態(tài)下肝細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的攝取，說(shuō)明FGF21對(duì)于血糖的維持有重要作用。這為T(mén)2DM患者帶來(lái)了新的希望，將成為治療T2DM的新型靶向基因分子藥物類型。

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Effect of FGF-21 on glucose uptake of insulin-resistant liver cells

BAIJie1,WANGJinxin,SONGZixuan,WUZhimin,GAOYan,ZHUZe,LIGuangming

(1TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To observe the effect of fibroblast growth factors-21 (FGF21) on glucose uptake of insulin-resistant (IR) liver cells. Methods The fluorescently labeled FGF21 mRNA with certain stability was synthesized in vitro. The liver cells were cultured for 72 h in RPMI-1640 medium supplemented with 34.4 μmol/L recombinant insulin and 1 μmol/L dexamethasone to establish IR cell models, and then IR cell models were divided into the model control group, insulin group, and FGF21 group. We did not add any drugs into the model control group. The insulin group was treated with 1 μmol/L recombinant insulin and FGF21 group was transfected with FGF21 mRNA. The cell glucose uptake in the three groups was measured by glucose oxidase (GOD-POD) assay. The mRNA and protein expression of glucose transporter 1 (GLUT1) was detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting. Results Compared with the model control group, the glucose uptake of the FGF21 group increased and the expression of GLUT1 mRNA and protein increased (allP<0.05).Compared with the model control group, the glucose uptake of the FGF21 group did not change significantly in the insulin group, and no significant difference was found in the GLUT1 mRNA and protein expression as compared with that of the model control group (allP>0.05). Conclusion FGF21 mRNA synthesized in vitro can improve the glucose uptake of IR liver cells, and its mechanism is related to the increase of GLUT1 expression.

fibroblast growth factors-21; glucose transporter 1; in vitro transcription of RNA; glucose uptake; insulin resistance; hepatic cells

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目(14ZCZDCX00054)。

白潔(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榛蜣D(zhuǎn)錄的機(jī)制及疾病的生物治療。E-mail: baijiexyz@163.com

李光明(1978-)，男，講師，主要研究方向?yàn)閙RNA的合成與表達(dá)。E-mail: li-guangming@hotmail.com

朱澤(1967-)，男，教授，主要研究方向?yàn)榛虻霓D(zhuǎn)錄機(jī)制及疾病的生物治療。E-mail: zhuze@tijmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.002

Q81

A

1002-266X(2017)26-0005-04

2016-12-27)