SiRNA在肝纖維化基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展

羅媛元，王麗娜，殷子斐

(1第二軍醫(yī)大學(xué)，上海200433；2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海中醫(yī)醫(yī)院)

SiRNA在肝纖維化基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展

羅媛元1，王麗娜2，殷子斐2

(1第二軍醫(yī)大學(xué)，上海200433；2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海中醫(yī)醫(yī)院)

肝纖維化是各種慢性致病因素作用于肝臟，引起組織損傷修復(fù)的病理反應(yīng)，是多種肝臟疾病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段。小干擾RNA(siRNA)能夠高效、特異地破壞mRNA的完整性，抑制疾病相關(guān)基因的表達(dá)，在基因治療領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景。目前研究表明，siRNA能有效地從基因水平進(jìn)行調(diào)控，抑制肝星狀細(xì)胞的活化與增殖，增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解，可成為肝纖維化治療的有效手段。

肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；小干擾RNA；基因治療

肝纖維化是肝臟對各種病因造成肝臟慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)。目前，肝纖維化的治療方法主要包括去除致病因素、緩解肝纖維化本身。肝纖維化是一種可逆性損傷，如不能得到及時有效控制，則會進(jìn)展為肝硬化[1]。近年來，隨著人們對肝纖維化發(fā)生機(jī)制的不斷深入，肝纖維化基因治療亦逐漸成為抗肝纖維化的研究熱點(diǎn)。基因治療能將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病。RNAi干擾(RNAi)是指生物進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的、細(xì)胞內(nèi)同源信使RNA(mRNA)的降解現(xiàn)象[2]。作為RNAi技術(shù)的一種，小干擾RNA(siRNA)容易制備，且能高效、特異地沉默靶基因，在基因治療領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景，并逐漸成為未來藥物研發(fā)的新方向?，F(xiàn)就近年來siRNA在肝纖維化治療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述如下。

1 siRNA的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

siRNA由Dicer(RNAase Ⅲ家族中對dsRNA有特異性的酶)加工而成，其長度為20～25個核苷酸。作為非編碼RNA家族中的一員，siRNA具有兩條鏈，分別為正義鏈、反義鏈。其中，反義鏈能與多種核酸酶結(jié)合形成基因沉默復(fù)合物(RISC)。在依賴ATP的解螺旋酶作用下，siRNA的雙鏈被打開，mRNA的特定片段取代siRNA正義鏈的位置，與siRNA的反義鏈互補(bǔ)，隨后核酸酶將mRNA切割成21～23個堿基的小基因片段，從而起到沉默目的基因的作用[3]。

siRNA作為RNAi進(jìn)行基因沉默的最常用的手段，有以下特點(diǎn)：①特異性：siRNA中的反義鏈能與mRNA中的同源區(qū)特異性地結(jié)合；②高效性：siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用放大[3]。正因?yàn)槿绱?，siRNA逐漸被認(rèn)為是一種基因沉默的強(qiáng)大工具，亦是目前新藥研發(fā)的熱門方向之一。siRNA是降解mRNA的強(qiáng)效工具，能針對肝纖維化形成過程中多個靶點(diǎn)的基因進(jìn)行調(diào)控，達(dá)到抗纖維化的作用。

2 肝纖維化的機(jī)制

肝纖維化是在持續(xù)損傷影響下，肝臟愈合過程中的代償反應(yīng)，其病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝內(nèi)過多沉積。肝纖維化發(fā)生的常見致病因素：病毒感染、免疫功能紊亂、膽汁淤積、藥物毒性作用、中毒和代謝性疾病等。肝纖維化進(jìn)一步加重，ECM通過形成致密纖維包裹再生肝細(xì)胞結(jié)節(jié)，破壞肝臟結(jié)構(gòu)，最終形成肝硬化。肝纖維化的形成過程復(fù)雜，但可簡要概括為以下兩個環(huán)節(jié)：①肝星狀細(xì)胞(HSC)細(xì)胞的活化增殖；②活化后的HSC分泌ECM，造成ECM在肝臟過度堆積。具體而言，當(dāng)肝臟受到病理因素的刺激，發(fā)生炎性損傷后，肝臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞、Kuffer等炎癥細(xì)胞被活化，釋放轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β、血小板源性生長因子(PDGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、腫瘤壞死因子(TNF)等炎癥因子，從而使HSC從靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入活化增殖狀態(tài)。與此同時，激活的HSC增加細(xì)胞α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的含量，使得未轉(zhuǎn)化的HSC向肌成纖維細(xì)胞(MFB)轉(zhuǎn)化，加重肝纖維化的進(jìn)展。當(dāng)HSC被激活后，其分泌的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白和層黏連蛋白等ECM增多，且HSC進(jìn)一步分泌基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、TIMP-2，引起基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)/TIMP調(diào)節(jié)失衡，從而導(dǎo)致ECM降解相對不足，過多沉積在肝內(nèi)，形成肝纖維化[4]。

3 siRNA治療肝纖維化的機(jī)制

3.1 抑制HSC的活化增殖，從根本上減少ECM的合成 ①抑制TGF-β/Smad表達(dá)：TGF-β廣泛存在于動物正常組織細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞，屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的細(xì)胞因子家族，具有5種亞型，含量最多的為TGF-β1。TGF-β是目前公認(rèn)最能有效促進(jìn)活化HSC的刺激因子，亦是基因治療肝纖維化的經(jīng)典靶點(diǎn)之一[5]。早在2009年，我國學(xué)者Xu等[6]使用伴刀豆球蛋白A對昆明小鼠進(jìn)行免疫型肝纖維化造模，并在此過程中，采用快沖方法尾靜脈注射含有靶向TGF-β1siRNA的質(zhì)粒pGenesil-TGF-β1(0.8 mL/10 g體質(zhì)量)，結(jié)果顯示治療組中TGF-β1、Smad3表達(dá)明顯下降，肝纖維化程度較模型組明顯減輕。隨后，2011年，我國研究者Lang等[7]使用高脂、高膽固醇飼料飼養(yǎng)SD大鼠，并同時皮下注射四氯化碳(CCl4)，在此基礎(chǔ)上尾靜脈注射TGF-β1siRNA，發(fā)現(xiàn)TGF-β1siRNA能明顯降低大鼠肝臟的TGF-β1、Ⅰ和Ⅲ型膠原，減輕肝纖維化程度，且高劑量(0.25 mg/kg)較低劑量(0.125 mg/kg)更加有效。

Smad蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)新的分子家族，其是將TGF-β1信號直接由細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)的重要胞內(nèi)效應(yīng)因子，在肝纖維化發(fā)生中起重要作用。我國學(xué)者羅海峰等[8]構(gòu)建了Smad2 siRNA，發(fā)現(xiàn)其能使HSC細(xì)胞內(nèi)的Smad2表達(dá)明顯下降，并使細(xì)胞上清中的Ⅲ型膠原含量明顯降低。在此基礎(chǔ)上，該課題組采用CCl4SD大鼠肝纖維化模型，結(jié)果顯示尾靜脈注射含有Smad2 siRNA的質(zhì)粒能顯著肝臟組織中的Smad2含量，減低肝纖維化的病理評分[9]。隨后，趙加斌等[10]體外研究證實(shí)：Smad2 siRNA能有效抑制TGF-β對HSC的激活，阻斷TGF-β/Smad傳導(dǎo)通路，使Ⅰ型膠原分泌下調(diào)，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。除了使用Smad2的siRNA之外，諸多研究顯示針對Smad3的siRNA亦能起到緩解肝纖維化的作用。如劉曉兵等[11]研究發(fā)現(xiàn)，siRNA-Smad3可顯著上調(diào)p53表達(dá)、下調(diào)Bcl-2，抑制HSC增殖，并誘導(dǎo)HSC凋亡；Wang等[12]對CCl4干預(yù)后的大鼠皮下注射脂質(zhì)體包裹的Smad3 siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大鼠肝臟內(nèi)的膠原沉積明顯減少，血清中的透明質(zhì)酸、層黏連蛋白及Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白含量均明顯下降。

② 抑制CTGF表達(dá)：CTGF是一種新發(fā)現(xiàn)的促成纖維細(xì)胞分裂和膠原沉積的生長因子，不僅可直接介導(dǎo)原代HSC活化、增殖及遷移，且能促進(jìn)活化HSC，并使其合成與分泌ECM，被比作為肝纖維化形成的“總開關(guān)”，逐漸成為抗肝纖維化治療的新靶點(diǎn)[5]。早在2006 年，Li等[13]通過門靜脈給大鼠注射CTGF siRNA(0.1 mg/kg)，能顯著降低CCl4作用后的SD大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原、層黏連蛋白，緩解肝纖維化的進(jìn)展程度。2008年，George 等[14]報道CTGF siRNA能使腹腔注射N-二甲基亞硝胺(DMN)大鼠體內(nèi)的CTGF、TGF-β1表達(dá)明顯下降。隨后不久，Chen 等[15]對人脂肪肝患者的肝臟組織標(biāo)本進(jìn)行分析，證實(shí)活化的HSC細(xì)胞是產(chǎn)生CTGF的場所，并且他們對人、鼠的正常HSC進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)乙醇能導(dǎo)致顯著上調(diào)CTGF、α-SMA、TGF-β1表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，該課題組證實(shí)：使用CTGF siRNA可明顯降低HSC內(nèi)的α-SMA含量，抑制Ⅰ型膠原表達(dá)，從而說明CTGF siRNA在酒精型肝纖維化的防治中有重要意義。2014年，Hao等[16]將攜帶有CTGF siRNA基因的慢病毒載體(LV)注射到注射經(jīng)CCl4作用后大鼠的門靜脈后，發(fā)現(xiàn)：大鼠肝臟內(nèi)的CTGF表達(dá)明顯下降，血清中的透明質(zhì)酸以及ALT顯著降低，肝臟的膠原減少，纖維化程度降低。③抑制PDGF/PDGFR表達(dá)：PDGF主要存在于血小板中，但在肝臟受損的情況下，巨噬細(xì)胞、血小板、浸潤的炎細(xì)胞、受損的內(nèi)皮細(xì)胞及激活的肝星形細(xì)胞均可合成PDGF。PDGF具有三種形式的二聚體亞型，分別為PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC。PDGF生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮需要與靶細(xì)胞表面的血小板源性生長因子受體(PDGFR)結(jié)合[5]。研究表明，肝纖維化發(fā)生過程中，在HSC細(xì)胞膜表面，PDGF-BB與PDGFR-β的作用尤為突出。針對HSC細(xì)胞表面受體PDGFR-β進(jìn)行RNAi，可有效發(fā)揮抗肝纖維化效應(yīng)。Chen 等[17]構(gòu)建了含有PDGFR-β siRNA的質(zhì)粒，首先體外轉(zhuǎn)染了HSC，證實(shí)了該質(zhì)粒能有效沉默PDGFR-β的表達(dá)，接著通過快沖方法將該質(zhì)粒尾靜脈注射DMN或膽總管結(jié)扎的肝纖維化SD大鼠，在兩種動物模型上證實(shí)：含有PDGFR-β siRNA的質(zhì)粒能明顯下調(diào)大鼠肝臟的PDGFR-β、α-SMA表達(dá)，降低血清ALT、膽紅素含量及肝纖維化病理程度等級。為進(jìn)一步增加RNAi的靶向性，該課題組使用了具有細(xì)胞特異性的膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子，發(fā)現(xiàn)該啟動子能在體內(nèi)體外實(shí)現(xiàn)PDGFR-β siRNA在HSC中的特異性高效表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)靶向抗肝纖維化的作用[18]。④抑制高遷移率族蛋白B1(HMGB1)/RAGE表達(dá)： HMGB1屬于慢性炎癥因子的一種，參與肝纖維化的進(jìn)程?，F(xiàn)已證實(shí)：HMGB1能與HSC細(xì)胞表面的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，其結(jié)合力為晚期糖基化終末產(chǎn)物與RAGE結(jié)合力的7倍，隨后進(jìn)一步活化HSC細(xì)胞[19]。隨著這一作用機(jī)制的揭示，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)針對HMGB1/RAGE通路進(jìn)行基因沉默，可達(dá)到抗肝纖維化進(jìn)展的目的。Ge 等[20]將HMGB1基因特異性siRNA以脂質(zhì)體包裹，轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的HMGB1的表達(dá)明顯下降，α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量下降，HSC細(xì)胞增殖受到明顯的抑制。Xia等[21]對CCl4造模的肝纖維化SD大鼠，尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹的RAGE siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠血清ALT、總膽紅素減少，肝臟細(xì)胞內(nèi)的RAGE、α-SMA、NF-κB、Ⅰ型膠原含量降低，且大鼠肝臟的炎癥程度、纖維化程度明顯減輕。此外，Wang等[22]研究證實(shí)：RAGE siRNA緩解CCl4作用后SD大鼠的肝臟纖維化程度與RAGE siRNA在蛋白、基因?qū)用嫦抡{(diào)炎癥因子TNF-α、IL-6有關(guān)。

3.2 直接調(diào)節(jié)ECM的合成與降解，減少ECM的堆積 ①調(diào)節(jié)PAI-1/尿激酶(uPA)平衡：ECM在肝臟內(nèi)的累積，是肝纖維化產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)。uPA能直接降解ECM，并能激活MMP，發(fā)揮間接降解ECM的作用。纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)是纖溶系統(tǒng)重要的調(diào)控因子，其能與uPA的絲氨酸活性中心結(jié)合，使其活化作用喪失。在肝纖維化發(fā)生過程中，PAI-1的含量明顯增加，uPA的活性受到明顯抑制，不能及時有效地降解ECM[23]。因此，考慮到PAI-1/uPA在肝纖維化進(jìn)程中的失衡作用，可通過降低PAI-1活性，提高uPA相對含量的方法，達(dá)到增加降解ECM的效果。Hu等[24]證實(shí)了經(jīng)CCl4作用后的大鼠，肝臟中的PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原明顯增加，隨后他們構(gòu)建了PAI-1 siRNA，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PAI-1 siRNA轉(zhuǎn)染到HSC細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)α-SMA、TGF-β、TIMP-1、Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達(dá)顯著下降，細(xì)胞增殖率降低。隨后，他們進(jìn)一步將攜帶有PAI-1siRNA基因的腺病毒(Ad)尾靜脈注射SD大鼠，通過對DMN和膽總管結(jié)扎兩種動物模型進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟內(nèi)的PAI-1含量下降，TIMP-1表達(dá)增加，MMP-9、MMP-13表達(dá)上升，I型膠原減少，肝細(xì)胞的凋亡比例下降[25]。② 調(diào)節(jié)MMP/TIMP平衡：MMP是機(jī)體降解細(xì)胞外纖維性膠原的主要酶家族，受到TIMP的直接調(diào)控。肝臟中含有TIMP-1和TIMP-2，由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌。TIMP能按1∶1比例與MMP的活性位點(diǎn)以可逆的非共價形式結(jié)合，抑制基質(zhì)降解酶的活性。在肝臟受損情況下，肝臟內(nèi)MMP/TIMP平衡體系被打破，導(dǎo)致MMP相對不足，進(jìn)一步引起ECM在肝臟過多沉積，從而造成肝纖維化[26]。近年來，不少學(xué)者嘗試用siRNA技術(shù)對MMP/TIMP進(jìn)行調(diào)節(jié)，起到了良好的抗肝纖維化效果。

綜上所述，肝纖維化是肝損傷導(dǎo)致肝臟修復(fù)的病理反應(yīng)，亦是各種肝病進(jìn)展成肝硬化的必經(jīng)階段。siRNA能高效特異沉默體內(nèi)目的基因，一方面可通過抑制TGF-β、Smad、CTGF、PDGFR、HMGB1、RAGE表達(dá)，減少HSC的活化，從而減少ECM的產(chǎn)生，另一方面可調(diào)節(jié)PAI-1/uPA、TIMP/MMP平衡，增加ECM的降解，顯示出較好的抗肝纖維化效果。siRNA還可通過沉默細(xì)胞外信號調(diào)控激酶2、大麻類受體CB1、瘦素、前膠原等基因表達(dá)，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

[1] 馬振增,陸倫根.肝纖維化藥物治療的新進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志,2016,32(6):1183-1187.

[2] Borna H, Imani S, Iman M, et al. Therapeutic face of RNAi: in vivo challenges[J]. Expert Opin Biol Ther, 2015,15(2):269-285.

[3] Gavrilov K, Saltzman WM. Therapeutic siRNA: principles, challenges, and strategies[J]. Yale J Biol Med, 2012,85(2):187-200.

[4] Tacke F, Trautwein C. Mechanisms of liver fibrosis resolution[J]. J Hepatol, 2015,63(4):1038-1039.

[5] 田甜,馬國珍,廖志峰,等.Tgf-β1、Pdgf、Ctgf與肝纖維化發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].甘肅醫(yī)藥,2014,33(10):740-742.

[6] Xu W, Wang LW, Shi JZ, et al. Effects of RNA interference targeting transforming growth factor-beta 1 on immune hepatic fibrosis induced by Concanavalin A in mice[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2009,8(3):300-308.

[7] Lang Q, Liu Q, Xu N, et al. The antifibrotic effects of TGF-beta1 siRNA on hepatic fibrosis in rats[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,409(3):448-453.

[8] 羅海峰,吳志勇,邱江鋒,等.特異性siRNA抑制肝星狀細(xì)胞Smad2表達(dá)[J].外科理論與實(shí)踐,2004,9(4):295-297.

[9] 羅海峰,吳志勇,陳煒,等.Smad2特異性siRNA對大鼠抗肝纖維化的作用[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2005,25(3):256-259.

[10] 趙加斌,趙彬佳惠,唐樹堯,等.siRNA對肝纖維化的抑制作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,11(22):4328-4330.

[11] 劉曉兵,郭曉紅,劉立新,等.siRNA沉默Smad3對肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制研究[J].中國病理生理雜志,2011,27(7):1376-1381.

[12] Wang ZR, Wang JH, Hu CL, et al. The effect of down-regulation of Smad3 by RNAi on hepatic stellate cells and a carbon tetrachloride-induced rat model of hepatic fibrosis[J]. Braz J Med Biol Res, 2011,44(2):91-99.

[13] Li G, Xie Q, Shi Y, et al. Inhibition of connective tissue growth factor by siRNA prevents liver fibrosis in rats[J]. J Gene Med, 2006,8(7):889-900.

[14] George J, Tsutsumi M. siRNA-mediated knockdown of connective tissue growth factor prevents N-nitrosodimethylamine-induced hepatic fibrosis in rats[J]. Gene Ther, 2007,14(10):790-803.

[15] Chen L, Charrier AL, Leask A, et al. Ethanol-stimulated differentiated functions of human or mouse hepatic stellate cells are mediated by connective tissue growth factor[J]. J Hepatol, 2011,55(2):399-406.

[16] Hao C, Xie Y, Peng M, et al. Inhibition of connective tissue growth factor suppresses hepatic stellate cell activation in vitro and prevents liver fibrosis in vivo[J]. Clin Exp Med, 2014,14(2):141-150.

[17] Chen SW, Zhang XR, Wang CZ, et al. RNA interference targeting the platelet-derived growth factor receptor beta subunit ameliorates experimental hepatic fibrosis in rats[J]. Liver Int, 2008,28(10):1446-1457.

[18] Chen SW, Chen YX, Zhang XR, et al. Targeted inhibition of platelet-derived growth factor receptor-beta subunit in hepatic stellate cells ameliorates hepatic fibrosis in rats[J]. Gene Ther, 2008,15(21):1424-1435.

[19] Kokkola R, Andersson A, Mullins G, et al. RAGE is the major receptor for the proinflammatory activity of HMGB1 in rodent macrophages[J]. Scand J Immunol, 2005,61(1):1-9.

[20] Ge WS, Wu JX, Fan JG, et al. Inhibition of high-mobility group box 1 expression by siRNA in rat hepatic stellate cells[J]. World J Gastroenterol, 2011,17(36):4090-4098.

[21] Xia JR, Liu NF, Zhu NX. Specific siRNA targeting the receptor for advanced glycation end products inhibits experimental hepatic fibrosis in rats[J]. Int J Mol Sci, 2008,9(4):638-661.

[22] Wang XW, Li WD, Xia JR, et al. Small interfering RNA targeting receptor for advanced glycation end products suppresses the generation of proinflammatory cytokines[J]. Exp Ther Med, 2015,10(2):584-590.

[23] 陳輝,馬紅.纖溶酶原激活物抑制劑-1與肝纖維化[J].世界華人消化雜志,2011,19(11):1156-1159.

[24] Hu PF, Zhu YW, Zhong W, et al. Inhibition of plasminogen activator inhibitor-1 expression by siRNA in rat hepatic stellate cells[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2008,23(12):1917-1925.

[25] Hu PF, Chen H, Zhong W, et al. Adenovirus-mediated transfer of siRNA against PAI-1 mRNA ameliorates hepatic fibrosis in rats[J]. J Hepatol, 2009,51(1):102-113.

[26] 郭艷祥,楊迎春,李冬梅.MMPs及TIMPs在肝纖維化的作用機(jī)制及研究進(jìn)展[J].貴州醫(yī)藥,2015,39(7):663-665.

國家自然科學(xué)基金資助項目(81303112)。

殷子斐(E-mail:yinzifei870730smmu@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.036

R575.2

A

1002-266X(2017)09-0103-04

2016-09-08)