結直腸癌患者癌組織中SPY1蛋白表達變化及意義

劉賢稱,張青,馮佳,靳欽,張曙

(南通大學附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

結直腸癌患者癌組織中SPY1蛋白表達變化及意義

劉賢稱,張青,馮佳,靳欽,張曙

(南通大學附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

目的 觀察SPY1蛋白在結直腸癌患者癌組織中的表達變化并探討其意義。方法 收集169例結直腸癌石蠟包埋標本，運用Western blotting及免疫組化Envision法檢測SPY1蛋白表達情況，結合臨床病理特征和隨訪資料進行統(tǒng)計學分析。結果 SPY1蛋白陽性表達于結直腸癌組織的細胞核，呈棕黃色或棕褐色點狀，低或無表達84例(49.70%)，高表達85例(50.30%)。SPY1蛋白在結直腸癌組織中的表達與TNM分期、腫瘤浸潤深度及術前血清癌胚抗原(CEA)值有關(P均<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤組織學類型、腫瘤分化程度、淋巴結轉移無關(P均>0.05)。Kaplan-Meier生存曲線顯示SPY1高表達者比低表達者5年生存率低。Log-Rank檢驗行單因素生存分析顯示SPY1表達程度、腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及術前血CEA值與術后生存時間有關(P均<0.05)，而患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤組織學類型與術后生存無關(P均>0.05)。COX比例風險回歸模型多因素分析顯示SPY1表達程度、腫瘤分化程度、TNM分期及術前血CEA值為預后的獨立危險因素(P均<0.05)。結論 SPY1蛋白在結直腸癌組織中呈高表達，其與患者TNM分期、腫瘤浸潤深度及術前血CEA值密切相關，檢測其水平有助于患者預后判斷。

結直腸癌；SPY1蛋白；免疫組織化學

結直腸癌(CRC)是全球常見的惡性腫瘤之一，約有近25%的CRC患者會出現(xiàn)遠處轉移[1]。近年來，隨著精準醫(yī)療概念的提出，尤其是新的靶向藥物引進，CRC患者5年生存率有所上升，但總存活率仍不樂觀[2，3]。因此，有必要探索更多CRC特定的預后靶點來對患者進行評估，為進一步的靶向治療提供理論依據(jù)。人類Speedy A1(SPY1)是Speedy/RINGO家族中的一員，是細胞周期蛋白依賴性激酶 (CDKs)的活化分子，可活化CDK2促進細胞增殖[4]。目前，國內尚無關于SPY1表達與CRC預后關系的研究。2009年1月～2010年12月，我們通過檢測SPY1蛋白在CRC組織和癌旁正常組織中的表達情況，分析其表達與CRC各臨床病理特征及預后間的關系。現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集南通大學附屬醫(yī)院病理科2009～2010年169例CRC患者癌組織石蠟標本及其相對應的癌旁組織(距離癌組織5 cm)標本。其中男108例、女61例，年齡45～75歲，平均60歲。結腸癌124例，直腸癌45例；組織學類型包括管狀腺癌和乳頭狀腺癌151例，混合型(管狀和黏液)腺癌6例，黏液腺癌8例，印戒細胞癌2例，腺鱗癌2例；組織分化程度：低分化15例，高、中分化154例；根據(jù)AJCC第7版結腸直腸癌TNM分期標準進行分期：0～Ⅰ期31例，Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期72例。所有標本患者術前未經(jīng)任何放化療或免疫治療。所有病例有相應的臨床資料及隨訪記錄，隨訪率100%，隨訪截至2015年6月，最長生存時間為62個月，最短為3個月。

1.2 SPY1蛋白表達測定 CRC腫瘤組織標本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)脫蠟水化，微波處理及EDTA抗原修復，免疫組化Envision法行SPY1標記。鼠抗人SPY1單克隆抗體購自上海圣克魯斯生物技術有限公司。用自身對照作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。兩位高年資病理醫(yī)師對免疫組化切片染色結果進行雙盲法分析。SPY1免疫組化染色陽性結果為腫瘤細胞核呈棕黃色或棕褐色點狀。結果判讀參照文獻[5]：高倍鏡下(×400)分別對每個位點計數(shù)100個細胞，每例共計400個，按要求分別記錄染色強度及陽性細胞百分比。陽性細胞染色強度分值如下：0分為無著色，1分為黃色弱陽性，2分為淺棕色中陽性，3分為棕褐色強陽性；陽性細胞百分比根據(jù)四類計分：0分(陰性)，1分(1%～33%)，2分(34%～66%)，3分(≥67%)；兩者之和的結果作為SPY1染色的最終評分：0～3分為無或低表達，4～6分為高表達。Western blotting法:取-80 ℃冰箱保存的30例新鮮組織，蛋白質裂解后由10%～15%的SDS-PAGE凝膠分離，濕轉法將膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h，室溫1 h，4 ℃過夜的條件下用5%脫脂奶粉的TBST稀釋一抗孵育轉印膜(SPY1 1∶500；GAPDH 1∶1 000)溫育，洗膜后加二抗溫育。同體積混合Luminol Ecl Reagent A和B液，加入膜上，并于室溫1 min孵育；在暗室內顯影和定影。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。CRC腫瘤組織與癌旁正常組織中SPY1蛋白表達差異分析及SPY1蛋白表達與各臨床病理特征間的關系分析采用Pearson卡方檢驗；SPY1蛋白表達與CRC患者生存期關系分析采用Kaplan-Meier生存分析；單個臨床病理特征與CRC患者生存期的分析采用Log-Rank單因素生存分析；有統(tǒng)計學意義的各臨床病理特征間的多因素分析采用COX比例風險回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SPY1蛋白在CRC組織中的表達及其與CRC患者臨床病理特征的關系 SPY1蛋白陽性表達于CRC腫瘤組織的細胞核，呈棕黃色或棕褐色點狀，低或無表達84(49.70%)例，高表達85(50.30%)例，而150例癌旁組織不表達。SPY1蛋白在CRC組織中的表達與TNM分期(χ2=9.111，P=0.011)、腫瘤浸潤深度(χ2=7.482，P=0.006)及術前血CEA值(χ2=13.988，P<0.001)有關，而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤組織學類型、腫瘤分化程度、淋巴結轉移無關(P均>0.05)，見表1。Western blotting結果顯示，27例(90%)CRC組織中SPY1蛋白表達高于相應癌旁組織。

表1 SPY1蛋白表達與CRC患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.2 預后分析 Kaplan-Meier生存曲線顯示SPY1高表達組比低表達組5年生存率低(P<0.05)。Log-Rank檢驗行單因素生存分析顯示SPY1表達程度(P<0.001)、腫瘤分化程度(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、腫瘤浸潤深度(P=0.001)、淋巴結轉移(P<0.001)及術前血CEA值(P<0.001)與術后生存時間有關，而患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤組織學類型與術后生存無關(P均>0.05)。COX比例風險回歸模型多因素分析進一步顯示SPY1表達程度(P=0.034)、腫瘤分化程度(P=0.002)、TNM分期(P=0.003)及術前血CEA值(P=0.003)為預后的獨立危險因素。

3 討論

CRC的發(fā)生發(fā)展及轉移是多因素作用的結果，而清楚認識其某些重要的分子生物學機制對于CRC的早期檢測、早期診斷及靶向治療有重要意義[6～8]。SPY1是一種細胞周期調節(jié)蛋白，可參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，包括卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤、膠質瘤等[9～11]。SPY1可參與乳腺浸潤性導管癌的發(fā)生及發(fā)展[12]；在非霍奇金淋巴瘤中SPY1亦被認為可通過調節(jié)p27的磷酸化水平介導淋巴瘤細胞的增殖[13]；在肝癌中SPY1可作為細胞周期調節(jié)基因促進肝癌細胞的增殖和存活[14,15]；而在大腦膠質瘤中SPY1可與CLIPR-59相互作用，抑制CLIPR-59與CLYD的結合，阻礙RIP1的去泛素化，從而介導膠質瘤細胞對TNF-α誘導凋亡的抗性[16,17]。以上研究成果證實SPY1是一種重要的癌基因。

本研究結果表明，SPY1蛋白表達與TNM分期、腫瘤浸潤深度及術前血CEA值有關。提示SPY1蛋白過表達對CRC腫瘤細胞的浸潤和侵襲能力起到一定程度的促進作用，其可能參與CRC的惡性進展過程。本研究還對169例CRC患者的隨訪資料進行分析，發(fā)現(xiàn)SPY1高表達者5年生存時間明顯低于低表達者，表明SPY1高表達可增加CRC患者的死亡風險。

總之，SPY1可作為一種促癌因子參與CRC的發(fā)生發(fā)展及預后，可能成為CRC新的分子治療靶點，通過靶向藥物阻斷CRC中SPY1蛋白的表達，有可能抑制CRC的發(fā)生發(fā)展。同時，SPY1蛋白高表達提示CRC預后不良，可作為判斷CRC預后的獨立因子。

[1] Bartlettt DL, Chu E. Can metastatic colorectal cancer be cured[J]. Oncology, 2012,26(3):266-275.

[2] Huang CW, Tsai HL, Chen YT, et al. The prognostic values of EGFR expression and KRAS mutation in patients with synchronous or metachronous metastatic colorectal cancer[J]. BMC Cancer, 2013,13(1):599.

[3] Chen C, Wang L, Liao Q, et al. Hypermethylation of EDNRB promoter contributes to the risk of colorectal cancer[J]. Diagnostic pathology, 2013,8(1):199.

[4]Cheng A, Xiong W, Ferrell JE Jr, et al. Identification and comparative analysis of multiple mammalian Speedy/Ringo proteins[J]. Cell Cycle, 2005,4(1):155-165.

[5] Huang J, Zhang X, Tang Q, et al. Prognostic significance and potential therapeutic target of VEGFR2 in hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Pathol, 2011,64(4):343-348.

[6] Grady WM, Pritchard CC. Molecular alterations and biomarkers in colorectal cancer[J]. Toxicol Pathol, 2014,42(1):124-139.

[7] Wiedenbein L, Kristiansen M, Adamsen L， et al. Assessment of rehabilitation needs in colorectal cancer treatment: Results from a mixed audit and qualitative study in Denmark[J]. Acta Oncol， 2016,55(6):705-711.

[8] Abdelsattar ZM, Wong SL, Regenbogen SE, et al. Colorectal cancer outcomes and treatment patterns in patients too young for average-risk screening[J]. Cancer, 2016,122(6):929-934.

[9] Lu S, Liu R, Su M, et al. Spy1 participates in the proliferation and apoptosis of epithelial ovarian cancer[J]. J Mol Histol, 2016,47(1):47-57.

[10] Parry PV, Engh JA. The cyclin-like protein Spy1 regulates growth and division characteristics of the CD133+population in human glioma[J]. Neurosurgery, 2014,74(6):N18-19.

[11] Podkowa M, Irwin MS. Spy'ing on differentiation in neuroblastoma[J]. Oncotarget, 2014,5(15):5848-5849.

[12] Zucchi I, Mento E, Kuznetsov VA, et al. Gene expression profiles of epithelial cells microscopically isolated from a breast-invasive ductal carcinoma and a nodal metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(52):18147-18152.

[13] Hang Q, Fei M, Hou S, et al. Expression of Spy1 protein in human non-Hodgkin's lymphomas is correlated with phosphorylation of p27 Kip1 on Thr187 and cell proliferation[J]. Med Oncol, 2012,29(5):3504-3514.

[14] Ke Q, Ji J, Cheng C, et al. Expression and prognostic role of Spy1 as a novel cell cycle protein in hepatocellular carcinoma[J]. Exp Mol Pathol, 2009,87(3):167-172.

[15] 柯靖，柯青，陸牡丹，等.肝細胞肝癌中SPY1蛋白的表達及其臨床意義[J].江蘇醫(yī)藥，2009，35(5)：516-518.

[16] Ding Z, Liu Y, Yao L, et al. Spy1 induces de-ubiquitinating of RIP1 arrest and confers glioblastoma's resistance to tumor necrosis factor (TNF-alpha)-induced apoptosis through suppressing the association of CLIPR-59 and CYLD[J]. Cell Cycle, 2015,14(13):2149-2159.

[17] Tewari R, Choudhury SR, Ghosh S, et al. Involvement of TNFalpha-induced TLR4-NF-kappaB and TLR4-HIF-1alpha feed-forward loops in the regulation of inflammatory responses in glioma[J]. J Mol Med (Berl), 2012,90(1):67-80.

張曙(E-mail:tdfyzs@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.022

R735.3

B

1002-266X(2017)09-0066-03

2016-11-14)