Hg脅迫下水楊酸對(duì)金針菇液體培養(yǎng)生理生化的影響

佘婷婷 吳映明 生書(shū)晶 駱 敏 嚴(yán)雪群

（廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州510303）

金針菇（Flammulina velutipes）是一種著名的食藥用真菌，具有“一高二低三豐富”的特點(diǎn)，所特有的真菌多糖具有良好的防癌和抗癌功效，能夠顯著的改善人體免疫機(jī)能和提高人體免疫力[1-3]，非常符合現(xiàn)代人的保健需求，備受消費(fèi)者的親睞，因而消費(fèi)量也不斷提高[4]。隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅猛發(fā)展，Hg污染問(wèn)題已日益嚴(yán)重，食用菌通過(guò)栽培料對(duì)重金屬離子具有一定的富集或生物轉(zhuǎn)化作用，經(jīng)常食用可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，從而影響食用者的健康[5]。水楊酸（SA）是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的小分子酚類物質(zhì)，對(duì)植物生長(zhǎng)代謝具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，是一種高效的、廉價(jià)的、無(wú)毒的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。前人研究表明SA能誘導(dǎo)植物重金屬抗性、緩解重金屬元素對(duì)于許多作物生長(zhǎng)的脅迫作用[6]，但關(guān)于SA能否提高金針菇菌絲抗逆性卻未見(jiàn)報(bào)道。研究在于為中度汞污染下金針菇培養(yǎng)的原位修復(fù)及尋找既能滿足人類對(duì)食用菌的需求又能消除重金屬對(duì)人類健康的危害的問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株白金針菇，編號(hào)GIM5.50，由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 試劑與儀器設(shè)備①試劑：氯化汞（分析純，泰興市化學(xué)試劑廠），水楊酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠），愈創(chuàng)木酚（分析純，阿拉?。燃谆w維素酶（分析純，阿拉?。?，葡萄糖（分析純，阿拉?。?，牛血清蛋白質(zhì)（分析純，阿拉?。?；②儀器設(shè)備：CHA-S恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司），TDL-60B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），DNM-9602A酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），756MC型分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），DDS-11A電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

1.3.1.1 制備培養(yǎng)基[7]PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，瓊脂1.5%，葡萄糖2%；液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，維生素B10.002%，葡萄糖2%。

1.3.1.2 菌種活化 挑取菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d。

1.3.1.3 SA調(diào)控處理方法 在液體培養(yǎng)基中加入HgCl 1 mg/L，SA試驗(yàn)設(shè)計(jì)1、10、20、50、100 mg/L和200 mg/L 6個(gè)水平，以不添加SA的液體培養(yǎng)基CK為對(duì)照。使用250 mL的錐形瓶裝液50 mL，取1 cm2的菌種接到各培養(yǎng)液中，25℃，150 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 樣品制備 接種后3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d各取3個(gè)重復(fù)樣品培養(yǎng)液，過(guò)濾經(jīng)4000 r/min離心機(jī)離心15 min上清液即為粗酶液。取少量粗酶液沸水煮10 min，冷卻為空白對(duì)照。

1.4 胞外酶活力測(cè)定方法測(cè)定方法包括：淀粉酶活力測(cè)定[8]；愈創(chuàng)木酚氧化酶活性測(cè)定[9，10]；羧甲基纖維素酶（CMC酶）活性的測(cè)定[9]；漆酶活性的測(cè)定[12]采用ABTS法；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[13]采用考馬斯亮藍(lán)染色法；還原糖的測(cè)定[13]。

1.5 pH與相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定分別用pH計(jì)和電導(dǎo)率儀對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇液體培養(yǎng)液中胞外淀粉酶活性的影響圖1顯示，SA能促進(jìn)Hg脅迫下金針菇胞外淀粉酶活性，而且SA質(zhì)量濃度越高與空白對(duì)照的差異越顯著，SA質(zhì)量濃度200 mg/L的酶活是所有處理中最高，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，淀粉酶活性先增后減，基本在接種后12 d時(shí)活性達(dá)到最高；SA低質(zhì)量濃度（10 mg/L、20 mg/L）處理組均出現(xiàn)小高峰，這與楊暉[8]研究的低質(zhì)量濃度的水楊酸能促進(jìn)鎘脅迫下香菇菌絲液體胞外酶活性影響是一致的。

圖1 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇胞外淀粉酶活性的影響

圖2 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇胞外愈創(chuàng)木酚酶活性的影響

2.2 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇液體培養(yǎng)液中胞外愈創(chuàng)木酚酶活性的影響圖2可見(jiàn)，金針菇胞外愈創(chuàng)木酚酶活性各處理組峰值分別出現(xiàn)在12～15 d。高質(zhì)量濃度SA（≥50 mg/L）對(duì)酶活的促進(jìn)作用最為顯著，50 mg/L處理組酶活性最強(qiáng)，在接種后第12天時(shí)出現(xiàn)活力數(shù)值8.5 U/mL，低質(zhì)量濃度SA處理組，酶活力基本都低于空白組；胞外愈創(chuàng)木酚酶活性，各組在第12天出現(xiàn)了峰值。王宜磊等[14]研究表明彩絨革蓋菌在PDY液體培養(yǎng)基中的愈創(chuàng)木酚氧化酶活性第16天高峰有所差異，這也說(shuō)明不同菌種生長(zhǎng)特性各不相同、不同的菌種的愈創(chuàng)木酚氧化酶活時(shí)間存在著一定的差異。

2.3 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇液體培養(yǎng)液中胞外羧甲基纖維素酶（CMC酶）活性的影響CMC酶與金針菇菌絲體對(duì)纖維素物質(zhì)的利用有關(guān)，圖3顯示在各處理組CMC酶活分別于接種9～12 d出現(xiàn)了峰值。以SA為20 mg/L在接種12 d時(shí)的酶活最高（4.61 U/L）；SA為10、50、100 mg/L處理組也表現(xiàn)了較高的酶活性；而1、200 mg/L SA處理組顯著低于對(duì)照組。低質(zhì)量濃度SA（≤50 mg/L）處理組的酶活性均高于對(duì)照組，能提高Hg脅迫下金針菇胞外CMC的酶活，其中以20 mg/L SA處理組促進(jìn)金針菇胞外CMC的誘導(dǎo)最為顯著。

圖3 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇胞外羧甲基纖維素酶活性的影響

圖4 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇胞外漆酶活性的影響

2.4 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇液體培養(yǎng)液中胞外漆酶活性的影響漆酶屬于多銅氧化酶家族中的一大類，在木質(zhì)素代謝過(guò)程中起著重要的作用，酶活性變化和金針菇利用木質(zhì)素類物質(zhì)密切相關(guān)。圖4可見(jiàn)，各組漆酶的酶活力均在12 d出現(xiàn)了峰值，其中以1 mg/L SA處理組的漆酶的酶活性最高（2.56 U/L），顯著高于對(duì)照組和其他處理組，低質(zhì)量濃度（≤20 mg/L）的SA顯著提高Hg脅迫下金針菇胞外漆酶的活性，這與孫淑靜[15]研究的酶活力峰值相近。

2.5 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇液體培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量的變化粗酶液中的蛋白質(zhì)主要為酶蛋白。蛋白質(zhì)濃度的變化可以從總體上反映金針菇胞外酶系的變化過(guò)程，各種酶隨著菌絲體適應(yīng)環(huán)境而生長(zhǎng)后在其調(diào)節(jié)機(jī)制下迅速生成，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度也會(huì)相應(yīng)增加。各處理組蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在接種后第6～12天出現(xiàn)峰值（圖5），低濃度處理能顯著提高汞脅迫下金針菇胞外蛋白含量，且以SA質(zhì)量濃度為20 mg/L作用最為顯著；SA質(zhì)量濃度≥50 mg/L處理組的蛋白含量峰值出現(xiàn)在第6天，而對(duì)照組和低質(zhì)量濃度的SA處理組（≤20 mg/L）的蛋白含量峰值出現(xiàn)在第9～12天，低質(zhì)量濃度處理組要顯著高于空白對(duì)照組，其中以20 mg/L，在接種第12天時(shí)胞外蛋白質(zhì)含量最高（0.057 mg/L）。各處理組胞外蛋白的含量峰值與胞外酶活性最強(qiáng)時(shí)間基本同步。

2.6 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇液體培養(yǎng)液中還原糖濃度的變化各個(gè)處理組還原糖質(zhì)量濃度最低值出現(xiàn)在第6～9天，峰值出現(xiàn)在第15天，中高質(zhì)量濃度SA（≥20 mg/L）處理組，還原糖均顯著高于空白組；SA對(duì)Hg脅迫下金針菇各處理組的還原糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)。其原因可能與淀粉酶、CMC酶等在SA的作用下的活性增大有關(guān)，第18天隨著各種酶活力的下降培養(yǎng)液中還原糖含量逐漸下降。這與曹春蕾等[16]研究的桑木層孔菌在第9天含量基本為零是一致的。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移和生長(zhǎng)速度的加快還原糖迅速降低。

2.7 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇培養(yǎng)液相對(duì)電導(dǎo)率和pH變化情況培養(yǎng)過(guò)程中酶液的導(dǎo)電性越強(qiáng)，測(cè)定的電導(dǎo)率數(shù)值就越大，即表示菌液里溶解物就越多[17]。各處理組酶液的相對(duì)電導(dǎo)率波動(dòng)在6980～14 600 s/m，其中以SA質(zhì)量濃度為20 mg/L接種第12天時(shí)測(cè)得電導(dǎo)率數(shù)值最大；各處理組pH波動(dòng)在4.8～5.9，高質(zhì)量濃度SA處理組pH都比空白對(duì)照要低，20 mg/L處理組pH始終要比其他的處理組高，這與該濃度下各種酶活的強(qiáng)弱程度成正相關(guān)，與培養(yǎng)液里還原糖、蛋白質(zhì)含量有直接關(guān)系，特別是蛋白質(zhì)含量保持一致趨勢(shì)。

圖5 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量變化的影響

圖6 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇培養(yǎng)過(guò)程中還原糖濃度的變化

圖7 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化情況

圖8 SA對(duì)Hg脅迫下金針菇培養(yǎng)過(guò)程中pH的變化

3 小結(jié)與展望

在Hg脅迫下SA對(duì)金針菇液體培養(yǎng)的胞外酶活性以及還原糖、蛋白質(zhì)含量等影響起到重要作用，對(duì)胞外酶活性有促進(jìn)作用并且峰值出現(xiàn)在第12～15天。外施SA能緩解Hg對(duì)植物的毒害，常云霞等[18]研究表明外施SA能緩解Hg脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用；楊暉等[8]研究表明，低質(zhì)量濃度的SA能促進(jìn)鎘脅迫下香菇菌絲液體培養(yǎng)胞外酶活性。試驗(yàn)結(jié)果表明：中高質(zhì)量濃度SA（≥50 mg/L）能顯著地提高金針菇在Hg脅迫下胞外淀粉酶、愈創(chuàng)木酚酶，還原糖含量隨著胞外酶的變化而變化；中低質(zhì)量濃度SA（≤20 mg/L）能顯著地提高胞外羧甲基纖維酶、漆酶的活性，相對(duì)電導(dǎo)率、pH和蛋白質(zhì)含量均保持著較高的水平；中低質(zhì)量濃度SA可以緩解重金屬汞對(duì)金針菇菌絲的生長(zhǎng)抑制作用，且以20 mg/L SA為最理想的緩解中度重金屬對(duì)金針菇毒害的濃度。試驗(yàn)所采用電導(dǎo)法具有分析快速，操作簡(jiǎn)便，不消耗樣品與試劑的優(yōu)勢(shì)，在植物研究方面電導(dǎo)法的運(yùn)用已非常普遍且卓有成就，如植物抗寒性和耐熱性比較等[17]，但在食用菌液體培養(yǎng)方面研究較少。水楊酸對(duì)鋅、鉻、鎘等重金屬污染下金針菇的生長(zhǎng)影響也是有待研究；電導(dǎo)法和pH變化的進(jìn)一步研究可以為食用菌液體培養(yǎng)研究注入新的方法。