不同濃度TGF-β1對(duì)人髓核細(xì)胞外基質(zhì)成分基因表達(dá)的調(diào)控作用比較＊

張榮峰，孫新君，張超，阮狄克

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

不同濃度TGF-β1對(duì)人髓核細(xì)胞外基質(zhì)成分基因表達(dá)的調(diào)控作用比較＊

張榮峰，孫新君，張超，阮狄克

目的研究在體外培養(yǎng)條件下，不同濃度轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）對(duì)人髓核細(xì)胞聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型膠原及SOX-9基因表達(dá)的調(diào)控作用。方法以傳2代人髓核細(xì)胞為研究對(duì)象，分別以0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四種濃度的TGF-β1為培養(yǎng)液，設(shè)不含生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液為對(duì)照組，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果0.1μg/L TGF-β1組與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異。1μg/L、10μg/L和100μg/L TGF-β1組在促進(jìn)Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9基因表達(dá)方面作用顯著，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，10μg/L組促進(jìn)細(xì)胞mRNA表達(dá)作用最明顯。結(jié)論TGF-β1能夠促進(jìn)髓核細(xì)胞Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9基因的表達(dá)，提示TGF-β1有可能在椎間盤退行性疾患的預(yù)防和治療中發(fā)揮重要作用。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；髓核細(xì)胞；基因表達(dá)；聚集蛋白聚糖；Ⅱ型膠原；SOX-9基因

椎間盤退變引起的頸肩痛、腰腿痛十分常見(jiàn)，當(dāng)前的治療方法雖然能夠解除疼痛，但不能修復(fù)退變的椎間盤。只有通過(guò)細(xì)胞學(xué)的方法維持細(xì)胞外的正?；|(zhì)成分，從而重建椎間盤的高度和生物學(xué)性能，才能從根本上阻止或延緩椎間盤退變；髓核細(xì)胞作為分泌髓核內(nèi)基質(zhì)的主要載體，其在正常髓核組織內(nèi)數(shù)目較少，在體外培養(yǎng)條件下容易發(fā)生去分化，喪失正常的細(xì)胞表型，這就限制了髓核細(xì)胞生物學(xué)治療的應(yīng)用［1］。通過(guò)生長(zhǎng)因子的方法，刺激髓核細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，為逆轉(zhuǎn)椎間盤退變帶來(lái)了新思維［2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同濃度TGF-β1對(duì)人正常髓核細(xì)胞Aggrecan和Ⅱ型膠原基因、SOX-9基因表達(dá)的調(diào)控作用，來(lái)探索早期阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和髓核組織來(lái)源HAM’S/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（HyClone公司，美國(guó)），Ⅱ型膠原酶（Gibco公司，美國(guó)），MTT、DMSO（Sigma公司，美國(guó)），培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（Corning公司，美國(guó)），rh-TGF（Peprotech公司，美國(guó)），引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，Trizol reagent試劑（Gibco公司，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）。人髓核組織取自青少年脊柱側(cè)彎矯形手術(shù)患者。

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng)取得髓核組織后，立即在超凈工作臺(tái)內(nèi)篩選實(shí)驗(yàn)用的髓核組織，去除纖維環(huán)及交界區(qū)組織，用PBS沖洗后剪成碎組織塊，用0.25%的胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min搖動(dòng)一次，800～1000 rpm離心5min，去上清液，用0.2%的膠原酶于37℃下消化4 h，120目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，細(xì)胞懸液1000 rpm離心5min，棄去上清液，D-Hanks液懸浮細(xì)胞，1000 rpm，離心5min，進(jìn)行酶液清洗，共三次。清洗后的細(xì)胞，用F12-10%FBS（胎牛血清）2m l稀釋，臺(tái)盼蘭染色，計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以2×104細(xì)胞/cm2接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔2～3 d換液、細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 總RNA提取和RT-PCR取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的傳2代人髓核細(xì)胞，達(dá)80%融合后，1000 rpm離心后，去上清，用含10%FBS的F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/m l，按1∶5接種于5個(gè)75 cm2培養(yǎng)瓶，24 h后，吸出培養(yǎng)基，分別加入由10%FBS/ F12配制成的0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四種濃度的TGF-β1，對(duì)照組不加生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h，按照Gibco公司Trizol一步法說(shuō)明，提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度儀測(cè)純度與濃度。取2μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA通過(guò)Real-Time PCR對(duì)蛋白多糖、Ⅱ型膠原、SOX-9進(jìn)行擴(kuò)增。以管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道合成［3］：GAPDH上游：5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3'，下游5'-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3'；PCR的反應(yīng)條件均為：94℃30 s，52℃45 s，72℃45 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳圖片用IBAS2.5圖像處理系統(tǒng)分析，以Aggrecan和Ⅱ型膠原吸光度與GAPDH吸光度的比值作為其相對(duì)表達(dá)量。

以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 15.0軟件中的One-Way ANOVA法，對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的吸光度值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測(cè)結(jié)果以x±s表示，比較試驗(yàn)組和對(duì)照組間的吸光度值差異，結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

10%血清條件下，在Aggrecan表達(dá)方面，對(duì)照組的吸光度比值為0.775±0.024，TGF-β1 0.1μg/L組的吸光度比值為0.828±0.008，與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異，1μg/L、10μg/L、100μg/L組的吸光度比值分別為1.361±0.016、1.814±0.029、1.163±0.027，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在促進(jìn)Ⅱ型膠原基因表達(dá)方面，與對(duì)照組的吸光度比值1.312± 0.036相比，TGF-β1 0.1μg/L組無(wú)顯著性差異（P> 0.05），1μg/L、10μg/L、100μg/L組差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，10μg/L組促進(jìn)細(xì)胞表型基因mRNA表達(dá)作用最明顯。在促進(jìn)SOX-9基因表達(dá)方面，與對(duì)照組相比，0.1μg/L組無(wú)顯著性差異（P>0.05），1μg/ L差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）、10μg/L、100μg/L組差異非常顯著（P<0.01）。

3 討論

椎間盤退變是一種發(fā)病率及致殘率極高的疾病，常引起以頸腰腿痛，其中髓核組織在椎間盤退變過(guò)程中起首要的作用［4］。正常髓核組織呈膠凍狀，主要是軟骨特異性基質(zhì)成分蛋白聚糖和Ⅱ型膠原組成，與軟骨組織相比，髓核組織中蛋白多糖的含量相對(duì)較高，比較髓核內(nèi)和軟骨內(nèi)蛋白多糖與Ⅱ型膠原的比例，髓核組織約為27∶1，而軟骨組織只有2∶1［5］。蛋白多糖被包埋在由Ⅱ型膠原組成的網(wǎng)格中，其中Aggrecan是蛋白多糖的主要成分，吸附水分的能力特別強(qiáng)大，因此，正常髓核組織含水量非常豐富，可達(dá)80%，具有屈曲性和黏彈特性，能夠承受壓力、吸收震蕩［6］。髓核組織為無(wú)血管組織，營(yíng)養(yǎng)的供給主要通過(guò)組織間的彌散和滲透，長(zhǎng)期承受壓應(yīng)力、剪切力，極易發(fā)生退變。退變后Aggrecan和Ⅱ型膠原逐漸減少，Ⅰ型膠原增多，促使髓核結(jié)構(gòu)逐漸纖維化，喪失承受壓力的能力，并導(dǎo)致纖維環(huán)、軟骨終板的退變。

目前治療椎間盤退變性疾病的方法包括保守治療和手術(shù)治療，這些措施雖能緩解癥狀，并不能解決椎間盤本身的退變問(wèn)題，其遠(yuǎn)期療效并不理想［7］。隨著組織工程及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，以細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物學(xué)治療修復(fù)退變的椎間盤逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的方向［8，9］，而利用細(xì)胞因子的作用，提高髓核細(xì)胞的活性，促進(jìn)正常細(xì)胞外基質(zhì)的合成，為延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的進(jìn)程提供了可能。TGF-β1是一種分子量為25 kd的雙鏈多肽，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成功能［10］。本課題組之前的研究提示，在10%血清條件下，TGF-β1能提高細(xì)胞的增殖活性，并且在1~10μg/L的濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系［11］。

由于髓核細(xì)胞缺乏特異性細(xì)胞標(biāo)志，國(guó)內(nèi)外研究中通常選用蛋白多糖、Ⅱ型膠原和SOX-9作為髓核細(xì)胞的特異性標(biāo)記。SOX-9基因是促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化和維持軟骨細(xì)胞表型的調(diào)控基因，與椎間盤退變密切相關(guān)，它能增加椎間盤基質(zhì)中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，延緩椎間盤退變的發(fā)展［12］。本研究結(jié)果提示，TGF-β1在1～100μg/L濃度時(shí)對(duì)可以顯著促進(jìn)Aggrecan和Ⅱ型膠原基因、SOX-9基因的表達(dá)，說(shuō)明在體外培養(yǎng)條件下，TGF-β1對(duì)人髓核細(xì)胞的表型表達(dá)具有重要的促進(jìn)和維持作用，特別是在濃度10μg/L時(shí)調(diào)控作用最顯著。這就使體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞作為組織工程椎間盤的種子細(xì)胞成為可能。

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［2016－07－13收稿，2016－08－11修回］［本文編輯：宋敏］

Com parative study on the regulation effects of TGF-β1 at d ifferent concentration in vitro on cellular aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of hum an nucleus pulposus

ZHANG Rong-feng①，SUN Xin-jun，ZHANG Chao，et al.①Department of Orthopedics，the 89th Hospital of People's Liberation Army，Weifang，Shandong 261000，China

Objective To investigate the regulation effects of TGF-β1 on aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of human nucleus pulposus at different concentration in vitro.Methods Passage 2 nucleus pulposus cells were cultured in the medium with 10%FBS and at different concentrations（TGF-β1 as 0.1μg/L，1.0μg/L，10μg/L，100μg/L）.The medium without TGF-β1 was taken as control group.The mRNA expression of aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene was assayed by RT-PCR.Results The 0.1μg/L TGF-β1 group hadn't significant difference compared with the control group.The 1μg/L，10μg/L and 100μg/L groups，promoted mRNA expression of aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene compared with the control group，the difference had statistical significance.Conclusion TGF-β1 is efficient to promote aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of human nucleus pulposus which might be a future therapeutic potential in the treatment of intervertebral disc degeneration.

Transforming growth factor-β1；Nucleus pulposus cells；Gene expression；Aggrecan；CollagenⅡ；SOX-9 gene

R681.5+3

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.017

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30370389）

261000山東濰坊，解放軍89醫(yī)院骨科（張榮峰，孫新君）；100037北京，海軍總醫(yī)院骨科（張超，阮狄克）