園藝植物小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

石江鵬，張春芬，李芙蓉，肖蓉，鄧舒，侯麗媛，曹秋芬

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

園藝植物小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

石江鵬1，張春芬2，李芙蓉1，肖蓉2，鄧舒2，侯麗媛3，曹秋芬3

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

游離小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成為園藝植物現(xiàn)代育種的一項(xiàng)重要內(nèi)容。綜述了園藝植物小孢子培養(yǎng)的研究進(jìn)展，詳細(xì)討論了小孢子胚胎發(fā)生的影響因素，包括材料的基因型、小孢子發(fā)育時(shí)期、供體植株生理狀況、預(yù)處理、活性炭、激素，以及胚狀體分化成苗的影響因素，并提出了相關(guān)的問(wèn)題與展望，以期為園藝植物的培養(yǎng)提供借鑒。

園藝植物；游離小孢子；胚狀體；植株再生

園藝植物是指提供人類食用或觀賞的植物，包括果樹(shù)、蔬菜、花卉、茶樹(shù)、芳香植物、藥用植物和食用菌等，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。園藝植物產(chǎn)品已成為現(xiàn)代生活中不可缺少的部分，市場(chǎng)需求在逐年增加。采用傳統(tǒng)的方法培育生產(chǎn)園藝植物，由于育種周期長(zhǎng)、選擇范圍有限、經(jīng)濟(jì)性狀劣變等，已經(jīng)不能滿足日益增長(zhǎng)變化的市場(chǎng)需求[2]。單倍體育種是現(xiàn)代育種的一項(xiàng)重要內(nèi)容，即利用組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株，再經(jīng)過(guò)染色體自然或人工加倍（如用秋水仙素處理）得到純合的雙單倍體（DH）。這種技術(shù)可以縮短育種周期、加快育種進(jìn)程，提高誘變育種效率，以及加快種質(zhì)資源創(chuàng)新。

單倍體材料可以通過(guò)自然發(fā)生和人工誘導(dǎo)獲得，但是一般情況下自然發(fā)生概率很小，不能滿足育種工作的需要，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是人工誘導(dǎo)獲得單倍體植物的主要途徑。在蔬菜方面，1982年LICHTER[3]利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜進(jìn)行培養(yǎng)，成功獲得了小孢子胚狀體及其再生植株。自此以后，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)入了快速發(fā)展階段。1989年，SATO等[4]首次報(bào)道成功誘導(dǎo)出大白菜游離小孢子胚和再生植株。在果樹(shù)方面，蘋(píng)果花藥培養(yǎng)開(kāi)始于20世紀(jì)70年代末，以德國(guó)、日本和中國(guó)研究較多。1981年，費(fèi)開(kāi)韋等[5]獲得元帥花藥培養(yǎng)的單倍體植株；吳絳云[6]經(jīng)愈傷途徑獲得黃太平花藥培養(yǎng)植株。張春芬等[7]獲得丹霞、富士、嘎拉、紅星、千秋、祝光等品種的再生植株60株，其中，41株系進(jìn)行了倍性分析，紅星和千秋的植株經(jīng)SSR檢測(cè)均由花粉發(fā)育而來(lái)。JORDAN[8]在西洋梨花藥培養(yǎng)上獲得小原胚；薛光榮等[9]在錦豐梨的花藥培養(yǎng)上誘導(dǎo)出胚狀體，但誘導(dǎo)率不穩(wěn)定。在農(nóng)作物方面，中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所[10]首次利用花藥離體培養(yǎng)方法獲得玉米純系。杭玲等[11]選育出玉米花培雜交種桂三1號(hào)，是國(guó)內(nèi)外用花培方法育成的第1個(gè)玉米雜交種；同年我國(guó)首次育成粳稻品種單豐1號(hào)[12]。目前，在蔬菜、作物、果樹(shù)上有關(guān)小孢子培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道較多，而在花卉、藥用植物方面的報(bào)道相對(duì)較少。

筆者綜述了近年來(lái)小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種上的應(yīng)用，著重闡述了小孢子胚胎發(fā)生的影響因素，以及胚狀體分化成苗的影響因素，并提出了相關(guān)的問(wèn)題與展望，以期為園藝植物的培養(yǎng)提供借鑒。

1 小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種中的應(yīng)用

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代新興細(xì)胞工程技術(shù)。與傳統(tǒng)雜交育種法相比，小孢子培養(yǎng)技術(shù)不需要通過(guò)長(zhǎng)期、繁雜的雜交、回交、自交，就能夠快速得到大量完全純合的個(gè)體，便于遺傳分析，而且目標(biāo)性狀穩(wěn)定，提高了選擇效率[13]。小孢子培養(yǎng)所獲得的雙單倍體（DH）純合群體可直接用于園藝植物育種，由于配子體基因型豐富，花粉來(lái)源的株系在株高、抗性、育性等方面表現(xiàn)多樣化，構(gòu)成了形態(tài)各樣的花培株系[14]。DH系能從親本獲得隨機(jī)排列的配子，因此，受隱性基因控制的優(yōu)良性狀在DH群體中出現(xiàn)較高的頻率。

利用小孢子培養(yǎng)突變方法獲得純合基因型材料用于育種是作物改良的較理想途徑，具有速度快、低或無(wú)污染特點(diǎn)。小孢子具有單倍性、單細(xì)胞性，因而易于進(jìn)行物理或化學(xué)誘變。誘變后經(jīng)過(guò)一定的處理使得染色體加倍，突變性狀可以直接在當(dāng)代植株性狀上表現(xiàn)出來(lái)，利于提高突變體篩選率[15]。在蕓薹屬植物中，小孢子剛分離后的單核期是應(yīng)用突變劑的最佳時(shí)期，這個(gè)時(shí)候產(chǎn)生的突變體易于選擇和識(shí)別分析[16]。

小孢子是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理想材料，從一個(gè)小孢子到一個(gè)幼齡的單倍體植株都可以作為外源基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體。與常用的轉(zhuǎn)基因受體相比，小孢子具有極強(qiáng)的再生能力，能有效獲得轉(zhuǎn)基因植株[17]。并且單倍體培養(yǎng)體系可以保證轉(zhuǎn)化后的雙單倍體系的2條染色體均含有目的基因，能最大限度地減少植株出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象，降低后代分離[18]。目前，應(yīng)用于小孢子培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、顯微注射法、粒子轟擊法等。

2 園藝植物胚胎發(fā)生的影響因素

在小孢子培養(yǎng)再生體系建立過(guò)程中，胚狀體誘導(dǎo)成功與否是關(guān)鍵性的一步。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于小孢子培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展，對(duì)小孢子胚胎誘導(dǎo)因子的研究不斷深入，使園藝植物小孢子胚胎誘導(dǎo)率有了明顯的提高。

2.1 供體植株

2.1.1 基因型基因型對(duì)小孢子的產(chǎn)胚率有很大影響，小孢子胚狀體發(fā)生能力隨試驗(yàn)材料基因型不同而有差異。王利英等[19]在茄子小孢子培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，4℃低溫預(yù)處理天數(shù)并不影響愈傷組織誘導(dǎo)率，愈傷組織誘導(dǎo)率只與基因型有關(guān)。曹秋芬等[20]對(duì)蘋(píng)果9個(gè)品種進(jìn)行了胚狀體誘導(dǎo)，有8個(gè)品種獲得了胚狀體，且各品種間誘導(dǎo)率差異顯著，其中，祝光蘋(píng)果的花藥胚狀體誘導(dǎo)率最高，可達(dá)24.7%，而富士蘋(píng)果僅有0.1%。方淑桂等[21]對(duì)花椰菜80個(gè)品種進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)供試品種獲得了胚狀體，且胚胎發(fā)生率存在顯著差異，最高基因型產(chǎn)胚率是最低基因型產(chǎn)胚率的182.5倍。方輝等[22]對(duì)15份不同基因型的青梗菜進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，只有10個(gè)供試品種獲得胚狀體，其中，GP-2，GP-4，GP-15出胚率相對(duì)較高，分別達(dá)1.04，0.87，0.89胚/蕾，其余7個(gè)品種的出胚率較低，在0.5胚/蕾左右。吳藝飛等[23]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將出胚率低的品種與出胚率高的品種雜交后，F(xiàn)1出胚率會(huì)大大提高，這說(shuō)明影響出胚的基因是由多對(duì)基因控制的，且這種基因是可遺傳的。能否通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件來(lái)克服基因型對(duì)小孢子培養(yǎng)的限制，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.1.2 小孢子發(fā)育時(shí)期小孢子發(fā)育時(shí)期會(huì)影響胚狀體的誘導(dǎo)率，多數(shù)研究表明，處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子細(xì)胞更有利于胚狀體的誘導(dǎo)。張德雙等[24]對(duì)綠花菜進(jìn)行花藥培養(yǎng)比較發(fā)現(xiàn)，雙核期影響較大。果樹(shù)中的杏樹(shù)花藥培養(yǎng)以小孢子發(fā)育到四分體或單核期為宜[25]。甜橙和荔枝在單核期培養(yǎng)效果最佳[26-27]。ZHANG等[28]對(duì)蘋(píng)果花藥培養(yǎng)中花粉發(fā)育時(shí)期對(duì)蘋(píng)果胚狀體誘導(dǎo)率的影響進(jìn)行了詳細(xì)的研究，結(jié)果表明，低溫處理后單核靠邊期至雙核早期的小孢子最為適宜。

在小孢子培養(yǎng)中，花蕾的外部形態(tài)特征（如花蕾長(zhǎng)度，花藥顏色、大小，花瓣長(zhǎng)/花藥長(zhǎng)等）與小孢子發(fā)育時(shí)期相關(guān)，因此，可作為小孢子發(fā)育時(shí)期的指標(biāo)[29]。吳藝飛等[23]研究表明，同一紅菜薹品種小孢子發(fā)育不同時(shí)期和不同品種處于同一小孢子發(fā)育時(shí)期的花蕾縱徑、橫徑、花萼長(zhǎng)度、花瓣長(zhǎng)度以及瓣萼比存在顯著差異。在羽衣甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)中，適宜于培養(yǎng)的花蕾形態(tài)指標(biāo)為：花瓣長(zhǎng)/花藥長(zhǎng)的值為（0.85～1.10）∶1，蕾長(zhǎng)3.5～4.5 mm[25]。

2.1.3 供體植株生理狀況研究表明，供體植株的生長(zhǎng)條件對(duì)小孢子發(fā)育同步化程度和胚狀體誘導(dǎo)產(chǎn)生重要影響，不同的生長(zhǎng)條件下，供體植株小孢子發(fā)育同步化程度和胚狀體誘導(dǎo)存在顯著差異[30]。在玉米小孢子培養(yǎng)研究中，生長(zhǎng)期間的最低溫度影響小孢子的胚狀體誘導(dǎo)[31]。在油菜的研究中發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜小孢子在單株開(kāi)1朵花后的14 d時(shí)間培養(yǎng)效果最好，白菜型油菜在培養(yǎng)前將花蕾置于4℃胚胎誘導(dǎo)率高，大田氣候條件下小孢子培養(yǎng)最佳取樣時(shí)間為上午7：00，此時(shí)濕度大，溫度低，小孢子發(fā)育同步化程度高[32]。在小麥小孢子培養(yǎng)研究中，病蟲(chóng)害情況是影響小孢子培養(yǎng)的重要因素，健壯無(wú)病蟲(chóng)害供體植株的小孢子活力強(qiáng)、污染率低，是小麥小孢子培養(yǎng)的最佳材料選擇[33]。

2.2 小孢子培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分

2.2.1 預(yù)處理預(yù)處理在小孢子發(fā)育中應(yīng)用較廣泛，包括熱激預(yù)處理、低溫預(yù)處理及秋水仙素預(yù)處理等。預(yù)處理能夠改變小孢子的發(fā)育途徑。

熱激預(yù)處理能夠使小孢子的發(fā)育途徑由配子體轉(zhuǎn)向孢子體，從而增加小孢子培養(yǎng)中的產(chǎn)胚率。高溫?zé)峒ゎA(yù)處理的溫度、時(shí)間因供體植株的差異而不同。在甘藍(lán)研究中發(fā)現(xiàn)，不同溫度小孢子發(fā)育的途徑不同，小孢子在32.5℃條件下培養(yǎng)趨向于孢子體發(fā)育，而在17.5℃條件下培養(yǎng)趨向于配子體發(fā)育[34]。

低溫預(yù)處理方法在游離小孢子培養(yǎng)中被普遍采用，在甘藍(lán)型油菜、青花菜的應(yīng)用中較多。曾愛(ài)松等[35]對(duì)甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)初期進(jìn)行4℃預(yù)培養(yǎng)，胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)作用不大。孫繼峰[36]在青花菜研究中發(fā)現(xiàn)，高溫比低溫對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)效率要高，而組合處理的誘導(dǎo)率比單獨(dú)的誘導(dǎo)效率高很多。張春芬等[37]在蘋(píng)果花藥培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，低溫預(yù)處理能夠提高蘋(píng)果花藥培養(yǎng)形成胚狀體的能力，特別是低溫預(yù)處理25 d后，花粉有較高的胚狀體形成能力。

2.2.2 活性炭不少試驗(yàn)研究表明，小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，沒(méi)有胚胎發(fā)生能力的小孢子能釋放出一些有毒物質(zhì)，會(huì)降低胚狀體發(fā)生頻率，改變胚的形態(tài)。在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭后，可加快離體培養(yǎng)進(jìn)程，提高小孢子產(chǎn)胚率，對(duì)小孢子培養(yǎng)有十分重要的作用[38]。

活性炭并非對(duì)所有培養(yǎng)材料的小孢子培養(yǎng)都能起作用。田保明等[39]對(duì)油菜TR9和TR4這2種材料進(jìn)行研究，結(jié)果表明，添加活性炭0.5 mg/L分別是未添加的對(duì)照小孢子胚產(chǎn)量的1.82倍、1.21倍。而劉雪平等[40]研究表明，濃度為0.05%的活性炭對(duì)甘藍(lán)型油菜小孢子再生胚促進(jìn)作用不明顯。研究發(fā)現(xiàn)，活性炭處理獲得的胚狀體在萌發(fā)、成苗等方面都差于未經(jīng)活性炭處理的小孢子胚，原因可能是活性炭不僅吸收游離小孢子培養(yǎng)中的有害物質(zhì)，還吸收一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、鐵鹽、維生素等與胚發(fā)生密切相關(guān)的物質(zhì)[38]。因此，對(duì)于不同試驗(yàn)材料的活性炭最適濃度還需進(jìn)一步探究，否則會(huì)起負(fù)作用。

2.2.3 激素在游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)中，添加不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)園藝植物胚狀體誘導(dǎo)的影響存在差異。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)6-BA和NAA對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響研究較多。在小白菜游離小孢子的研究中，李巖等[41]研究表明，在培養(yǎng)基中添加少量6-BA和NAA激素與不加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的對(duì)照相比，其產(chǎn)胚率明顯提高；徐艷輝等[42]研究發(fā)現(xiàn)，添加6-BA可以提高大白菜胚狀體的誘導(dǎo)率，但是它對(duì)難出胚狀體的品種仍沒(méi)有效果，而高濃度的6-BA會(huì)對(duì)易出胚狀體的品種起抑制作用；付文婷等[43]研究表明，有些易出胚狀體的大白菜不加任何激素也能出胚，添加激素反而出胚少或不出，而且添加激素會(huì)產(chǎn)生畸形胚。可見(jiàn)，有關(guān)外源激素對(duì)植物游離小孢子培養(yǎng)作用的研究還未達(dá)成一致的結(jié)論，關(guān)于難出胚材料的激素配比、激素選擇還需進(jìn)一步研究。ZHANG等[44]研究表明，在蘋(píng)果花藥培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基激素的濃度影響胚胎形成率。

3 園藝植物小孢子胚分化成苗的影響因素

在游離小孢子培養(yǎng)中，小孢子胚分化成植株是重要的環(huán)節(jié)之一。研究發(fā)現(xiàn)，影響胚發(fā)育成植株的外部因素有植株再生所需的培養(yǎng)基組成、溫度、光照條件、通氣狀況等，內(nèi)部因素有胚狀體的生理狀況、胚齡的長(zhǎng)短等。

胚狀體的形態(tài)特征影響胚狀體發(fā)育成植株，健康的子葉型胚轉(zhuǎn)到成苗培養(yǎng)基上后成苗能力最強(qiáng)，魚(yú)雷型胚狀體的再生能力很差，球型胚幾乎不能發(fā)育成正常的植株。胚齡的長(zhǎng)短對(duì)胚狀體成苗影響很大，胚齡過(guò)長(zhǎng)和過(guò)短均不利于成苗。胚齡過(guò)短，胚狀體容易出現(xiàn)玻璃化或黃化，生長(zhǎng)不良而死；胚齡過(guò)長(zhǎng)，胚狀體分化能力減弱，易褐化導(dǎo)致成苗率下降[23]。

低溫處理對(duì)胚狀體的成苗率也有一定的影響。HANG等[45]研究表明，低溫處理甘藍(lán)型油菜能迅速直接成苗；在對(duì)油菜小孢子胚狀體出苗率影響的研究中發(fā)現(xiàn)，把胚狀體轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上先低溫（2℃）培養(yǎng)，然后常溫培養(yǎng)，可提高直接成苗率[46]；余鳳群等[47]將甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體轉(zhuǎn)至固體培養(yǎng)基后，置于10℃低溫誘導(dǎo)10 d，直接成苗率達(dá)到51.2%，明顯優(yōu)于未經(jīng)過(guò)低溫處理的對(duì)照。

培養(yǎng)基成分是小孢子胚芽分化的重要影響因素。劉凡等[48]研究發(fā)現(xiàn)，胚狀體在NLN13液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～25d后，轉(zhuǎn)接到固體分化培養(yǎng)基中成苗效果最好。付文婷等[43]研究表明，在B5培養(yǎng)基上對(duì)大白菜的小孢子胚進(jìn)行培養(yǎng)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)叢生芽的產(chǎn)生有重要影響，各處理叢生芽誘導(dǎo)率有很大差異。張亞麗等[2]在不含任何激素的B5培養(yǎng)基上，白菜胚狀體均發(fā)生愈傷化，最終褐化死亡。

4 展望

隨著單倍體育種體系的不斷發(fā)展，游離小孢子培養(yǎng)體系進(jìn)一步得到完善。小孢子培養(yǎng)技術(shù)作為一種高效、安全、快速的育種手段受到了越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。園藝植物和人類密切接觸，栽培量逐年上升，已成為提高生活質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。通過(guò)分析小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展，小孢子胚胎發(fā)生、胚狀體分化成苗的影響因素，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)方向的研究還存在不足，今后的研究應(yīng)集中在以下幾個(gè)方面進(jìn)行。

（1）有關(guān)小孢子培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道較少，且這些研究所用的材料多為作物和蔬菜，而有關(guān)果樹(shù)和花卉的游離小孢子培養(yǎng)的報(bào)道更少。在前人已有的研究基礎(chǔ)上，需要進(jìn)一步完善花卉、果樹(shù)游離小孢子培養(yǎng)體系。

（2）根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果，影響小孢子胚胎發(fā)生的因素主要有基因型、小孢子發(fā)育所處的時(shí)期、小孢子的生理狀況、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等，制約胚分化成植株的因素主要有培養(yǎng)基組成、溫度、通氣狀況、生理狀況等。如何打破小孢子胚胎發(fā)生以及胚分化成苗的制約因素，還需研究人員繼續(xù)探索。

（3）探明小孢子胚胎發(fā)生過(guò)程中的遺傳表現(xiàn)以及染色體加倍的時(shí)間、原因等，對(duì)小孢子培養(yǎng)進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳改良，提高育種的選擇效率，加速育種進(jìn)程，為園藝植物小孢子培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用提供更為廣闊的前景。

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Research Advances on Microspore Culture Technology of Horticultural Plants

SHI Jiangpeng1，ZHANGChunfen2，LI Furong1，XIAORong2，DENGShu2，HOULiyuan3，CAOQiufen3
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofPomology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Research CenterofBiotechnology，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan 030031，China）

Microspore culture became an important content of modern breeding of horticultural plants.This paper reviewed the research progress in microspore culture of horticultural plants,factors affecting microspore embryogenesis were discussed in detail, including genotype,microspore development,donor plant physiological status,pretreatment,activated carbon,hormone,and factors affecting the differentiation ofembryoid bodies into seedlings.And the paper put forward the problems and prospects to provide reference for the cultivation ofhorticultural plants.

horticultural plants;isolated microspore;embryoid;plant regeneration

S601

A

1002-2481（2017）04-0669-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.43

2016-12-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372033）；山西省國(guó)際合作項(xiàng)目（2014081040）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士基金研究項(xiàng)目（YBSJJ1515）

石江鵬（1992-），女，山西忻州人，在讀碩士，研究方向：種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用。曹秋芬為通信作者。