骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療缺血性腦血管病的研究進展

邢海會，謝菊華，張素君，羅崟洲，陳豐洋，丁曉慧*

骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療缺血性腦血管病的研究進展

邢海會1，謝菊華2，張素君3，羅崟洲4，陳豐洋4，丁曉慧2*

（1.沈陽醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學專業(yè)2015級碩士研究生，遼寧沈陽110034；2.組織與胚胎學教研室；3.麻醉學專業(yè)2012級3班；4.臨床醫(yī)學專業(yè)2015級2班）

缺血性腦血管病為腦血管疾病的多發(fā)病，臨床治療效果并不理想，探索缺血性腦血管病的最佳治療方法成為了臨床與基礎(chǔ)研究的熱點。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是一類具有多分化潛能的干細胞，在缺血性腦血管病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景。本文對BMSCs的來源與生物學特性、分離與純化、移植途徑、時機和數(shù)量及其在動物模型與臨床治療上的應(yīng)用進行綜述，以深入認識BMSCs移植在治療缺血性腦血管病中的重要作用。

骨髓間充質(zhì)干細胞；移植；治療；缺血性腦血管病

缺血性腦血管病是指由于腦的供血動脈（頸動脈和椎動脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱。在所有腦血管病中，缺血性腦血管病占87%多［1］。缺血性腦血管病死亡率高，致殘率高，在幸存者中約3/4患者遺留癡呆、偏癱、失語等后遺癥狀，部分患者喪失勞動能力和生活能力。隨著中國人口老齡化進程的不斷加劇以及該疾病發(fā)病的年輕化，缺血性腦血管病已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題和社會經(jīng)濟問題。雖然目前臨床上對該病的治療方法較多，如溶栓、抗凝、營養(yǎng)神經(jīng)等，但這些方法均不能從根本上修復(fù)受損腦組織。因此，探尋更有效的治療方法成為臨床與基礎(chǔ)研究的熱點與難點。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是一種多分化潛能的干細胞，具有分化為神經(jīng)細胞的潛能，在缺血性腦血管病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景［2-5］?，F(xiàn)就BMSCs治療缺血性腦血管病的研究進展進行綜述。

1 BM SCs

1.1 BMSCs的來源與生物學特性有研究證實所有鼠科動物的器官或組織中都存在有BMSCs［6］，任何組織均需要保留其祖細胞來補充自身細胞的凋亡和促進自身細胞的更新［7］。但目前BMSCs主要來源于骨髓，在骨髓中的含量為0.001%～0.01%，且隨著年齡的增加逐漸減少［8-9］。此外，從成年人的脂肪組織、肝臟、牙髓，以及臍血、胎盤和羊膜中也均可分離獲得BMSCs［10-14］。BMSCs在生理穩(wěn)態(tài)下增殖并不明顯，但在富含血清的培養(yǎng)環(huán)境中可貼壁生長并形成集落［15］，表現(xiàn)出很強的自我更新和增殖能力，并在一定條件下分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和其它類型的細胞等［12，16-17］。BMSCs在動物及人體組織中具有易獲得、多向分化、無免疫排斥等優(yōu)點，使得其常作為種子細胞被廣泛應(yīng)用于科學研究中。

1.2 BMSCs的獲取、分離與純化目前實驗研究用BMSCs最常從大鼠或小鼠中獲取，具體方法即將動物麻醉或脫頸處死后，將其置于75%的酒精中5 min，在無菌條件下分離其股骨和脛骨后，剪去兩端骨骺，用注射器抽取含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨頭變白，隨后收集沖洗后的BMSCs懸液，采用全骨髓貼壁法或密度梯度離心法于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。而對BMSCs分離、純化主要采用全骨髓貼壁法或密度梯度離心法。全骨髓貼壁法是根據(jù)干細胞的貼壁生長特性，通過定期換液的方法去除不貼壁的細胞即造血細胞等來達到分離純化BMSCs的目的。密度梯度離心法則是用一定的介質(zhì)即淋巴細胞分離液在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞懸液或勻漿置于分離液的頂部，通過重力或離心力的作用使細胞分層分離，因為BMSCs是有核細胞，屬于單核細胞層，故抽取離心后中間的云霧狀單核細胞層，經(jīng)洗滌和離心后，棄上清，胎牛血清重懸細胞并計數(shù)細胞密度和培養(yǎng)細胞。全骨髓貼壁法操作相對簡單、對細胞活性損傷小，可以得到高純度、高活性、高分化潛能、生物學形態(tài)和特征穩(wěn)定的BMSCs［18-21］，但也有研究證實全骨髓貼壁法聯(lián)合其它方法比單純使用全骨髓貼壁法更方便、快捷、有效［22-23］，用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結(jié)合可以有效分離、純化人BMSCs［24-27］；目前臨床上也常采用密度梯度離心法和貼壁法相結(jié)合的方式分離培養(yǎng)人BMSCs。

隨著流式細胞儀等實驗技術(shù)的開展與成熟，流式細胞分選BMSCs法和免疫磁珠法也獲得了一定范圍的應(yīng)用，但其應(yīng)用因技術(shù)要求高、分離過程繁瑣、對細胞活性影響大等缺點及尚未找到BMSCs的特異性抗原等因素而受到限制。

1.3 BMSCs的移植途徑、時機和數(shù)量如何將BMSCs移植到損傷部位并在宿主內(nèi)正常存活分化，是BMSCs治療缺血性腦血管病的前提和關(guān)鍵。目前多數(shù)學者證實BMSCs可通過立體定向（紋狀體或側(cè)腦室）、血管內(nèi)（動脈或靜脈）或經(jīng)腰椎穿刺注入蛛網(wǎng)膜下腔等途徑進行移植，但哪種途徑最優(yōu)尚未有統(tǒng)一的定論。有研究報道立體定向途徑優(yōu)于靜脈移植途徑［28］。但是由于可行性及立體定向過程中對腦可能造成的繼發(fā)性損害等因素導(dǎo)致該途徑目前仍不能被諸多患者所接受。而動靜脈途徑雖有其獨特的優(yōu)勢但也有移植所需細胞數(shù)量多、易被其他器官所攝取且不易透過血腦屏障等弊端而應(yīng)用受限。蛛網(wǎng)膜下腔移植既具有可避開血腦屏障的障礙，又有利于BMSCs進入腦內(nèi)等優(yōu)點，可能是最易被患者所接受的移植途徑。

選擇合適的時機和數(shù)量對移植BMSCs至關(guān)重要。移植過早、數(shù)量過多不利于BMSCs正常存活和發(fā)揮作用；移植過晚、數(shù)量過少也不能及時挽救腦缺血癥狀而達到治療的目的。有動物研究認為在腦缺血再灌注損傷動物模型7 d后為最佳移植點，但將其廣泛地運用于臨床還需大量的數(shù)據(jù)去進一步驗證［29］。

2 BM SCs移植治療缺血性腦血管病的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 BMSCs移植在缺血性腦血管病動物模型中的應(yīng)用近期研究發(fā)現(xiàn)，用缺氧/復(fù)氧預(yù)處理的人BMSCs和未經(jīng)處理的正常BMSCs分別與缺血大鼠皮層神經(jīng)元共同培養(yǎng)，缺氧/復(fù)氧預(yù)處理的BMSCs能促進缺血大鼠皮層神經(jīng)元的存活，增強其促生存信號、營養(yǎng)因子釋放和細胞遷移，具有挽救缺血皮層神經(jīng)元的能力，對腦缺血具有治療作用［30］。Sun等［31］將用異氟醚預(yù)處理后的BMSCs移植到腦缺血再灌注損傷小鼠模型后觀察發(fā)現(xiàn)，異氟醚預(yù)處理可增加BMSCs植入缺血腦組織的數(shù)量并促進缺血腦組織功能的恢復(fù)。Hideo等［32］在建立小鼠永久性局灶性腦缺血模型7 d后，采用立體定位儀將BMSCs移植到缺血側(cè)紋狀體，在移植2或4周取腦，進行熒光原位雜交和免疫染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植2周后大約一半的BMSCs表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)生長因子（NGF）mRNA，但是其后BDNF和NGF mRNA的陽性細胞百分率下降；在移植4周后，微管蛋白-2（神經(jīng)元標志物）表達陽性的BMSCs逐漸升高。這一發(fā)現(xiàn)表明BDNF可能是BMSCs發(fā)揮營養(yǎng)作用的一個關(guān)鍵因素，在缺血性腦血管病早期行干細胞療法進行BMSCs移植對缺血的腦組織具有營養(yǎng)作用。

同時早期研究證實在腦缺血1 d后經(jīng)紋狀體移植的BMSCs可顯著增加成年大鼠皮質(zhì)缺血區(qū)半暗帶軸突出芽和髓鞘的再生［33］。劉敬霞等［34］也發(fā)現(xiàn)BMSCs移植對大鼠腦缺血再灌注損傷組織神經(jīng)軸突再生具有一定促進作用。移植的BMSCs可以遷移到缺血區(qū)表達神經(jīng)細胞表型或通過刺激缺血區(qū)各種生長因子的表達，減少神經(jīng)細胞的凋亡、刺激血管的生成、重建突觸和樹突、增加軸突的再生以及內(nèi)生性神經(jīng)干細胞的分化來促進腦功能的修復(fù)。此外，也有研究證實由BMSCs分泌的細胞因子還具有免疫調(diào)節(jié)、血管生成、抗炎和抗凋亡效應(yīng)［35］。

2.2 BMSCs移植在臨床治療缺血性腦血管病的應(yīng)用目前BMSCs治療缺血性腦血管病已逐步從基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)至臨床實踐，并已成為治療缺血性腦血管病的一大熱點。據(jù)陳玉梅［36］報道，將臨床上符合條件的患者根據(jù)自愿原則分為干細胞移植組和對照組（常規(guī)用藥組），干細胞移植組在無菌條件下通過骨髓穿刺取自體骨髓經(jīng)密度梯度離心法獲取人BMSCs，經(jīng)腰椎穿刺途徑將分離培養(yǎng)后的BMSCs回輸患者體內(nèi)，神經(jīng)功能NIHSS評分和BI指數(shù)評分評價治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，進行自體BMSCs移植可顯著改善腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損癥狀。謝旭芳等［37］也證實腦梗死患者自體BMSCs移植可顯著改善其腦缺血后神經(jīng)功能損傷。

越來越多的學者關(guān)注BMSCs移植的安全性問題。近期研究報道，對18例慢性腦卒中處于穩(wěn)定期的患者移植經(jīng)修飾的BMSCs（sb623細胞）12個月后觀察發(fā)現(xiàn)，sb623細胞移植安全性良好，可顯著改善腦卒中患者的神經(jīng)功能［38］。Díez-Tejedor等［39］將20例出現(xiàn)急性缺血性腦卒中的患者隨機分為試驗組和對照組，試驗組在患者出現(xiàn)腦卒中癥狀后的第1個2周內(nèi)靜脈注射脂肪源性BMSCs，對照組給予同等劑量的安慰劑，患者在治療后隨訪2年以評估BMSCs給藥方式的安全性和有效性以及其在治療方面對腦組織的保護作用和修復(fù)潛能，目前此項研究正處于Ⅱ期臨床實驗，尚未得到最終結(jié)局。盡管BMSCs移植的安全性問題已在一些研究中得到證實，但是BMSCs仍存在有很多尚未解決的問題。BMSCs的自我更新和增殖潛能有類似于腫瘤細胞的特征，是否存在有致瘤性的可能為移植安全性的一大隱患。雖然BMSCs移植在短期內(nèi)未見有不良反應(yīng)的報道，但其移植后的長期不良反應(yīng)還有待于時間去進一步驗證，這些問題都將制約著BMSCs移植的廣泛運用。

3 小結(jié)

BMSCs具有來源廣泛、易分離獲得、易培養(yǎng)、多向分化潛能、移植不存在倫理學爭議等優(yōu)點，在缺血性腦血管病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景。目前大量動物研究已經(jīng)證實BMSCs對缺血腦組織神經(jīng)再生、損傷修復(fù)均有一定促進作用，同時也有報道BMSCs移植對腦梗死患者具有治療作用。但將其廣泛地應(yīng)用于臨床治療中還面臨著諸多挑戰(zhàn)，比如BMSCs移植的途徑、時間和數(shù)量還未有統(tǒng)一的標準；移植后潛在的不良反應(yīng)對治療效果的影響等，這些將制約BMSCs移植在臨床上的廣泛運用。而這些問題的解決，將為臨床實施BMSCs治療缺血性腦血管病提供新的思路和目標。

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Re s e a r c hPr o g r e s so fT r a n s p l a n t a t i o no fBo n eM a r r o w St r o ma lCe l l si nt h eT r e a t me n to fIs c h e mi c Ce r e b r o v a s c u l a r D i s e a s e

XING Haihui1，XIE Juhua2，ZHANG Sujun3，LUO Yinzhou4，CHEN Fengyang4，DING Xiaohui2*
（1.Postgraduate of Grade 2015，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Histology and Embryology；3.Class 3，Grade 2012；4.Class 2，Grade 2015）

Ischemic cerebrovascular disease is a frequently occurring disease，and the clinical therapeutic effect is not ideal.To explore the best treatment method of ischemic cerebrovascular disease becomes a hot spot in clinical and basic research.Bone marrow stromal cells are a kind of stem cells with multiple differentiation potential，which has broad application prospects in the treatment of ischemic cerebrovascular disease.This paper briefly reviews the sources and biological characteristics，separation and purification，transplantation approaches，timing and quantity of the bone marrow stromal cells and application in animal model and clinical therapy，which will help us to understand the role of bone marrow stromal cells in the treatment of ischemic cerebrovascular disease.［Keywords］bone marrow stromal cells；transplantation；treatment；ischemic cerebrovascular disease

R743.3

A

1008-2344（2017）02-0167-04

2016-08-08

（文敏編輯）

沈陽醫(yī)學院大學生科研課題（No.20150806）；遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（No.201510164000006）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（No.201510164006）；遼寧省教育廳課題（No. L2014406）

丁曉慧（1971—），女（漢），教授，博士，研究方向：心腦血管缺血性疾病.E-mail：1285448068@qq.com

d o i：10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.02.029