自體動(dòng)脈血建立大鼠腦出血模型技巧

徐天策，鄭勝哲

自體動(dòng)脈血建立大鼠腦出血模型技巧

徐天策，鄭勝哲*

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 延邊 133000）

目的：探討自體動(dòng)脈血腦內(nèi)注射法建立大鼠腦出血模型的技巧。方法：采用自體動(dòng)脈血腦內(nèi)注射的方法，通過立體定向儀，將120只Wistar大鼠從尾動(dòng)脈中提取的50 μl自體不抗凝動(dòng)脈血注入大鼠尾狀核制成大鼠腦出血模型，通過行為學(xué)觀察，評價(jià)模型建立的穩(wěn)定性。結(jié)果：通過Longa評分法評價(jià)大鼠行為學(xué)，成功率為89.2%。結(jié)論：通過精準(zhǔn)定位、定時(shí)以及對大鼠全程生命體征維持等制作技巧使大鼠腦出血模型成功率達(dá)89%以上。

自體動(dòng)脈血；腦出血；動(dòng)物模型

腦出血是臨床常見的致死、致殘率較高的疾病，嚴(yán)重威脅人類的健康。建立穩(wěn)定性高、與人類腦出血相似程度高的實(shí)驗(yàn)性腦出血?jiǎng)游锬Ｐ蛯ρ芯磕X出血的實(shí)驗(yàn)研究必不可少。目前，大鼠腦出血模型的制備方法主要為膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型和自體動(dòng)脈血腦內(nèi)注入建立腦出血模型，前者由于無法控制出血量和出血部位，而且出血性為滲出性，與人類腦出血相似程度較后者低，故本實(shí)驗(yàn)整體上參考 Hua、Yang、Lee等［1-3］的方法，注血采用周中和等［4］的二次注血/退針法，通過立體定位儀，將大鼠的自體不抗凝動(dòng)脈血注入大鼠尾狀核部建立腦出血模型。近年來我們在粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）對腦出血大鼠模型抗炎作用機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了大量自體動(dòng)脈血注入制作腦出血模型，現(xiàn)根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，歸納整理出自體不抗凝動(dòng)脈血注入建立腦出血模型的一些制作技巧及體會。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取成年雄性Wistar大鼠120只，體重250～300 g（由延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。

1.2 主要儀器 腦立體定位儀、100 μl微量注射器、牙科鉆（深圳瑞沃德公司生產(chǎn)），大鼠斷頭器，動(dòng)物手術(shù)器械，無菌消毒巾等。

1.3 大鼠腦出血模型制作過程 新鮮配制的10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后頭部備皮，俯臥位固定于立體定位儀上，調(diào)節(jié)立體定位儀，將大鼠門齒固定于門齒鉤上，使前后囟位于同一水平線，調(diào)節(jié)耳間線，當(dāng)聽到耳桿穿破鼓膜的破裂聲后，固定耳桿使大鼠頭部無法移動(dòng)［5-6］，將大鼠頭部皮毛消毒后正中切開皮膚，3%雙氧水剝蝕骨膜，暴露前后囟門及冠狀縫，于前囟后0.2 mm，中線旁開3 mm處，用牙科鉆鉆開一個(gè)直徑大約1 mm的小孔［7］，不傷及硬腦膜及腦組織。用40℃溫水加熱清洗鼠尾，待充血后乙醇消毒，剝離尾動(dòng)脈，使用微量注射器取不抗凝動(dòng)脈血50 μl固定在定位儀上，將微量注射器通過孔洞進(jìn)針至6 mm尾狀核部，采用兩次自體動(dòng)脈血注入法［4-8］，先將動(dòng)脈血?jiǎng)蛩僮⑷?10 μl，停止注血 2 min，然后再次均勻緩慢的將動(dòng)脈血注入40 μl，讓針停留4 min，開始退針大約2.0 mm后再次停針4 min，之后可將注射器緩慢地完全退出，等待期間注意用無菌紗布包扎鼠尾止血，縫合切口后再用無菌棉球壓迫止血。

1.4 觀察指標(biāo) 待大鼠清醒后進(jìn)行行為學(xué)觀察，采用Longa評分法［9］評價(jià)，0分：神經(jīng)系統(tǒng)功能無缺損；1分：左前側(cè)肢體不能完全伸直；2分：在大鼠行走時(shí)，出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈的現(xiàn)象；3分：在大鼠行走時(shí)，出現(xiàn)癱瘓側(cè)肢體的傾倒；4分：不能自行行走，出現(xiàn)意識喪失的情況。本實(shí)驗(yàn)1～3分視為模型制作成功。評價(jià)后將大鼠用斷頭器斷頭取腦，清除血跡，去除大腦組織額極前部4 mm及嗅球部分，可見大腦右側(cè)半球有注血孔，根據(jù)注血孔的位置將腦組織切割開，以冠狀位的位置，觀測血腫是否形成在尾狀核［10］。

2 結(jié)果

制作的120例腦出血模型中，10只大鼠Longa評分1分，62只大鼠Longa評分2分，35只大鼠Longa評分3分；其余13只失敗，其中1只為麻醉過程中死亡，考慮麻醉劑量過量，2只經(jīng)切開取腦后證實(shí)動(dòng)脈血未注入尾狀核，2只術(shù)后感染死亡，5只Longa評分為0分，3只Longa評分為4分。模型制作成功率為89.2%。

3 討論

3.1 術(shù)前注意事項(xiàng) 術(shù)前12 h禁食水，可使大鼠的血液變成高凝狀態(tài)，血液較前濃縮，有助于血腫形成，并且可以防止麻醉期間返流、誤吸；腹腔注射麻醉、頭部皮膚切開及尾部動(dòng)脈取血前必須做好消毒，以減少傷口感染機(jī)會，避免不必要的死亡。

麻醉藥物盡量新鮮配制，存放時(shí)間最長不宜超過1周，劑量須按照動(dòng)物體重計(jì)算，并嚴(yán)格避光配置保存，用避光注射器抽取藥物，防止藥物藥效降低，造成第1次麻醉無法達(dá)到預(yù)期效果，反復(fù)多次注藥，致死動(dòng)物死亡，如需再次補(bǔ)充麻醉劑量不要超過初次的一半。

3.2 立體定位儀固定 準(zhǔn)確固定是實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)，稍有偏差血液將無法準(zhǔn)確注入到大鼠尾狀核，定位儀的門齒鉤需與耳間線平面下方的2.4 mm處一致，這樣就可以保證大鼠的前囟和后囟在同一水平線上［11］，耳間線的固定在實(shí)驗(yàn)開始既是難點(diǎn)，也是關(guān)鍵之處，將大鼠門齒固定在門齒鉤應(yīng)該在耳間線固定之后。位置固定精確后，固定的力度需要適量，保持大鼠頭部無法活動(dòng)的情況下，也不能太過用力影響大鼠呼吸。

3.3 取血及注血操作 先用肝素將微量注射器沖洗，防止抽血時(shí)因針管堵塞造成取血失??；用微量注射器取尾動(dòng)脈血的過程要快，否則數(shù)十秒內(nèi)血液就可能凝固，同時(shí)抽取血液時(shí)應(yīng)細(xì)致勻速，避免有氣泡產(chǎn)生，注射完畢后也應(yīng)用肝素沖洗，避免下次使用時(shí)堵塞。本次實(shí)驗(yàn)初期使用蒸餾水清洗，后造成多只微量注射器堵塞，堵塞后強(qiáng)行推動(dòng)針芯會使針芯彎曲影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取血時(shí)盡量一次成功，多次取血會造成血管攣縮，血液凝固無法抽取血液。

在使用牙鉆打孔時(shí)，鉆孔力度要適度，可采取多次、點(diǎn)鉆的方法，在感受到顱骨快穿透、未及硬腦膜時(shí)，可用微量注射器輕輕捅破，切不可暴力鉆孔，否則極易損傷硬腦膜及腦組織，造成出血，影響實(shí)驗(yàn)的效果。

應(yīng)盡量緩慢、勻速，有條件可使用微量注射泵注血，手動(dòng)注血需采用點(diǎn)推進(jìn)旋轉(zhuǎn)注血，快速注血可能造成血液延針管返流，血腫形成不完全，或速度過快時(shí)顱壓升高過快，血液破進(jìn)側(cè)腦室，流入蛛網(wǎng)膜下腔，實(shí)驗(yàn)效果達(dá)不到預(yù)期。

實(shí)驗(yàn)過程中需及時(shí)止血，用無菌紗布按壓止血，盡量少使用過多棉球，防止大鼠失血過多死亡［7］，同時(shí)還應(yīng)該注意維持大鼠體溫，大鼠失血會造成體溫下降，可使用動(dòng)物保溫墊來維持體溫。

退針時(shí)須有停針時(shí)間，并且退針勻速，以保證血腫形成充分，否則可造成血液延針管回流影響實(shí)驗(yàn)效果。

全部實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間盡量保證在40 min內(nèi)完成，時(shí)間上與臨床高血壓腦出血過程相似，并且可避免大鼠從麻醉中清醒、或者休克死亡。

3.4 術(shù)后護(hù)理 大鼠術(shù)后勤換墊料，使墊料保持干燥、清潔，保證通風(fēng)與適應(yīng)的溫度，于尾部及頭部的創(chuàng)口可涂抹青霉素粉末［12］，防止感染，飼料、水分充足，有的大鼠術(shù)后偏癱癥狀明顯，可將飼料和水分放在旁邊可觸及的地方，以免行動(dòng)不便的大鼠因飲食不順利死亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過相對較多的成功模型實(shí)例證實(shí)了使用大鼠自體動(dòng)脈血腦內(nèi)注入法制作大鼠腦出血模型是相對成熟且成功率較高，并且將近些年相關(guān)文獻(xiàn)與此次經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合總結(jié)了一些實(shí)驗(yàn)技巧可顯著提高實(shí)驗(yàn)成功率，避免不必要的失敗，本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒β蕿?9.2%，與近些年文獻(xiàn)報(bào)道造模成功率為71%～80%［13］的相同實(shí)驗(yàn)相比，成功率顯著提高，對今后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)具有借鑒意義。

［1］ Hua Y， Schallert T， Keep RF， et al.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Stroke， 2002， 33（10）：2478-2484.

［2］ Yang GY， Betz AL， Chenevert TL， et al.Experimental intracerebral hemorrhage： relationship between brain edema，blood flow，and blood-brain barrier permeability in rats［J］.J Neurosung，1994，81（1）：93-102.

［3］ Lee KR，Betz AL，Kim S，et al.The role of the coagulation cascade in brain edema formation after intracerebral hemorrhage［J］.Acta Neurochir，1996，138（4）：369-401.

［4］周中和，曲方，何祥，等.一種改良大鼠自體血腦出血模型：二次注血/退針法［J］.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2004，12（4）：406-408.

［5］Xi GH，Hua Y，Bhasin RR，et al.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage：effects of extravasated red blood cells on blood flow and blood-brain barrier integrity［J］.Stroke，2001，32（12）：2932-2938.

［6］ Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenaseinduced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（5）：801-807.

［7］朱文煥，周岱.大鼠腦出血模型制備的體會［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，15（5）：13-14.

［8］張波，溫權(quán)，甘元華，等.兩次自體動(dòng)脈血注射法構(gòu)建大鼠尾狀核腦出血3模型的研究［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，37（6）：19-23.

［9］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［10］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：1-2.

［11］楊亞萍，劉曉鵬，臺立穩(wěn)，等.自體血注入法大鼠腦出血模型建立的制作技巧［J］.神經(jīng)藥理學(xué)報(bào)，2012，2（2）：29-31.

［12］李惠，婁季宇，楊霄鵬.大鼠腦出血模型制作技巧［J］.中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2007，10（2）：152-153.

［13］張昊，馬曉依，呂妍，等.大鼠腦出血模型［J］.中國醫(yī)藥指南，2012，10（34）：88-89.

The Skills of Establishing Intracerebral Hemorrhage Model in Rats by Injecting Autologous Arterial Blood into Caudate Nucleus

XU Tiance，ZHENG Shengzhe*
（Department of Neurology，Yanbian University Hospital，Yanbian 133000，China）

Objective：To investigate the skills of establishing intracerebral hemorrhage model in rats by injecting autologous arterial blood into caudate nucleus.Methods：The method by injecting of autologous arterial blood into caudate nucleus was used.Through a stereotaxic apparatus，50 μl autologous arterial blood from caudal artery was injected into the caudate nucleus to establish intracerebral hemorrhage model in 120 Wistar rats.The stability of the model was evaluated through behavioral observation.Result：The neurological behavior of the rats was evaluated with Longa score， and the success rate was 89.1%.Conclusion： This experiment improved the model's success rate by precise positioning， timing and maintenance of vital signs of rats，which will be helpful to increase the success rate of the model to more than 89%.

autologous arterial blood；cerebral hemorrhage；animal model

R743.3

A

1008-2344（2017）06-0495-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.011

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.H0907）

鄭勝哲（1969—），男（朝鮮族），博士，主任醫(yī)師，研究方向：腦血管病及酒精中毒.E-mail：mikezheng23@163.com

2017-06-07

（文敏編輯）