鉛(Pb)脅迫對泥蚶血液MT及Vg基因表達的誘導(dǎo)效應(yīng)研究

謝清清, 陳彩芳, 吳林德, 林志華

(1. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315211; 2. 浙江萬里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用重點實驗室,浙江 寧波 315100)

受工業(yè)發(fā)展及城市廢棄物隨意排放的影響, 土壤和近海海域的重金屬污染日益嚴重。重金屬在環(huán)境中極其穩(wěn)定、不易被消除, 并能通過食物鏈積累和擴大, 嚴重威脅著生物的生存及人類的健康。鉛(Pb)是環(huán)境中最常見的七種重金屬之一, 被我國《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》列為重點綜合整治對象, 也是目前已篩選出的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)的一個重要組成部分[1-2]。已有研究表明 Pb能對許多無脊椎海洋動物, 如腹足綱軟體動物和雙殼類動物產(chǎn)生影響[3]。作為非必需金屬元素, Pb在生物體內(nèi)富集會促進活性氧自由基的生成, 提高機體的氧化壓力, 從而對機體造成氧化損傷。

金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一種低分子量的蛋白質(zhì), 廣泛存在于大多數(shù)生物體內(nèi)。MT所富含的半胱氨酸巰基可與重金屬配位結(jié)合并將其排出體外, 在參與非必需金屬元素的解毒方面具有重要作用[4-5]。此外, MT在增進機體對外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)和清除自由基抗氧化保護方面也有重要作用[6]。近年來, 貝類 MT, 不管是在基因還是蛋白水平均已開展了大量研究工作[7-14]。但大部分側(cè)重于探究MT與重金屬鎘(Cd)之間的關(guān)系, 對于 Pb與 MT之間是否具有相同的作用機制, 我們?nèi)灾跎佟?/p>

卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg) 是卵生動物卵黃中主要成分的前體, 主要存在于成熟雌性個體中,在雄性個體和幼體中表達量很少, 甚至不表達[15]。而在環(huán)境內(nèi)分泌干擾素(如 Cd、Pb等)誘導(dǎo)下, 雄性和幼體中 Vg也會相應(yīng)表達[16]。此外, 研究還發(fā)現(xiàn) Vg具有抗氧化能力[17-18]。Nelson等[19]發(fā)現(xiàn)蜜峰能夠通過Vg清除體內(nèi)自由基來降低氧化壓力而延長壽命。而在貝類中, Zheng等[17]也發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝Vg具有抗氧化活性。對貝類Vg基因的相關(guān)研究主要集中于扇貝、文蛤、泥蚶等少數(shù)經(jīng)濟貝類[17-18,20-22]。Chen等[20]克隆得到泥蚶Vg全長, 推測其具有多個金屬結(jié)合位點, 表明泥蚶Vg具有金屬結(jié)合能力; 且在1、3、6和9 μg/L Cd暴露28 d后, 泥蚶消化腺和血液Vg均顯著上調(diào), 表明其在泥蚶重金屬解毒中發(fā)揮重要作用。吳林德等[21]發(fā)現(xiàn)泥蚶消化腺 Vg表達量和 Pb脅迫具有一定的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng), 推測其抗氧化功能在Pb脅迫引起的氧化損傷中起作用。

泥蚶( Tegillarca granosa) , 俗稱血蚶、花蚶, 是一種棲息于沿海灘涂的廣溫性雙殼貝類。由于雙殼貝類自身用于代謝的混合氧化系統(tǒng)存在缺陷, 導(dǎo)致其體內(nèi)污染物的釋放較慢, 造成體內(nèi)保持較高的重金屬富集程度[23-24]。泥蚶不僅能富集重金屬, 且對重金屬有極強的耐受性。因此, 本文擬研究不同濃度重金屬Pb脅迫下泥蚶血液Vg、MT基因的表達規(guī)律, 有助于探索貝類的重金屬耐受及其抗氧化解毒機制,同時也是研究環(huán)境毒理學(xué)、生物健康及海岸保護的重要一環(huán)[25]。

1 　 材料與方法

1.1　實驗材料

實驗所用泥蚶由寧波甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司提供, 在非繁殖期選取活力好、大小均一且外殼無損傷的2齡泥蚶, 殼長為(2.94±0.16)cm。

1.2　泥蚶攻毒實驗

實驗所用泥蚶在砂濾海水中暫養(yǎng)7 d, 水溫(21±1.0)℃, pH 為 8.1, DO>5 mg/L, NH4-N<0.05 mg/L, 持續(xù)充氣, 每日換水后投喂適量藻類。

將Pb(NO3)2配制成濃度為1.000 g/L 母液備用;根據(jù)《海水水質(zhì)標(biāo)準》(GB 3097-1997), 海水養(yǎng)殖用水中Pb的限量值為5 μg/L。設(shè)置實驗組Pb2+濃度梯度為1、3、6、9 μg/L, 并以未添加Pb2+的自然海水作為對照組, 1 μg/L和3 μg/L為低于水質(zhì)標(biāo)準的實驗濃度, 6 μg/L及9 μg/L為高于水質(zhì)標(biāo)準的實驗濃度,各組均設(shè)三組平行。攻毒時間為28 d。

開始實驗前為消除容器對重金屬的吸附作用,先用等濃度Pb2+的實驗水體浸泡塑料箱24 h。此后,向每個塑料箱內(nèi)分別加入20 L實驗水體及40個泥蚶,實驗期間連續(xù)充氣, 每24 h換水1次, 并投喂扁藻。采樣在實驗開始的 0、7、14、21、28 d進行, 每箱取 4個泥蚶, 抽取血液于液氮中速凍后放于-80℃冰箱保存。

1.3　總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

用CWBIO的Trizol 總RNA 提取試劑, 提取所得泥蚶血液總RNA。再用TaKaRa PrimeScripttmRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)合成cDNA第一鏈, 用于泥蚶MT、Vg基因的熒光定量實驗。

1.4　泥蚶血液MT、Vg基因在不同濃度Pb2+脅迫下的表達規(guī)律研究

用 Primer Premier 5.0 軟件根據(jù)泥蚶MT、Vg的cDNA序列設(shè)計熒光定量引物, 以合成的 cDNA 第一鏈為模板對引物進行篩選。選擇無非特異性擴增和引物二聚體的引物, 最終獲得目的基因引物MT-real-F/MT-real-R、Vg-real-F/Vg-real-R(表 1), 根據(jù)chen的文章獲得泥蚶內(nèi)參基因引物Tg-β-actin-F、Tg-β-actin-R[20]。使用 ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR儀(ABI, USA)和 SYBR@Premix ExTMKit (TaKaRa,Japan)對不同濃度Pb2+脅迫下泥蚶血液 MT及Vg表達進行相對定量分析, 反應(yīng)體系為 20 μL, 分別為2 μL 的 cDNA、引物各 1 μL、6 μL 的 ddH2O 和 10 μL的SYBR@PCR Mix。反應(yīng)程序為: 預(yù)變性95℃ 15 min;95℃ 5 s, 60℃ 20 s, 72℃ 25 s, 40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束時, 進行溶解曲線分析, 每個樣品做3個平行。

表1　實驗所用到的qRT-PCR引物序列Tab. 1 The qRT-PCR primer sequences used in the experiment

1.5　數(shù)據(jù)分析

采用2–ΔΔCt法計算各處理組泥蚶MT、Vg的相對表達量。實驗數(shù)據(jù)采用 SigmaPlot13.0 Two Way ANOVA對各個組同時進行時間效應(yīng)及濃度效應(yīng)分析, P<0.05表示顯著差異, P<0.01表示極顯著差異。

2　結(jié)果

2.1　不同濃度 Pb2+脅迫下泥蚶血液 MT的表達規(guī)律

經(jīng)過28d的慢性攻毒實驗, 以β-actin為內(nèi)參基因, 以各時間點對照組泥蚶血液MT基因的表達量為基礎(chǔ)值1, 得到各個時間點其它濃度組 MT基因相對表達量, 結(jié)果如圖 1。

相同Pb濃度水平攻毒時間對泥蚶血液MT基因表達量的影響如下: 在1 μg/L Pb2+脅迫下, 泥蚶MT基因的相對表達量在14 d時達到最高值, 較7 d與28 d而言差異極顯著(P<0.01), 然后開始下降, 在28 d時表達回到最初水平。在3 μg/L Pb2+脅迫下, 其血液MT mRNA水平在14 d時到達最高值, 且與其他時間點相比差異極顯著(P<0.01); 隨著時間推移其表達情況整體呈現(xiàn)先上升后下降再上升的一種波動狀態(tài)。其他兩個濃度組, 泥蚶MT mRNA的表達水平基本上隨攻毒時間推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。不同的是, 6 μg/L實驗組其表達量在21d時達到最高值,與14 d時相比具有顯著性(P<0.05), 且較7 d與28 d而言差異極顯著(P<0.01); 而 9 μg/L實驗組在14 d時其 mRNA水平達到最高表達, 與其他時間點相比差異極顯著(P<0.01)。

相同攻毒時間下不同重金屬濃度對泥蚶血液MT基因表達的影響如下: 第7天, 各實驗組均無顯著差異。14 d時, 各濃度組泥蚶MT mRNA水平較對照組均顯著提高(P<0.01), 9 μg/L實驗組其表達水平最高。21 d時, 1、6及9 μg/L實驗組泥蚶MT mRNA水平較對照組均顯著提高(P<0.01), 且兩個高于水質(zhì)標(biāo)準限值的實驗組其基因表達水平大于1 μg/L實驗組的表達水平。28 d時, 各實驗組泥蚶MT mRNA水平較對照組無顯著性差異。

上述結(jié)果表明, 在較長時間低劑量重金屬 Pb2+暴露下, 泥蚶血液MT mRNA水平與Pb2+濃度存在較好的正相關(guān)劑量效應(yīng); 另一方面, 各濃度組泥蚶血液MT mRNA水平隨時間推移基本上呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。

圖1　不同Pb2+濃度組泥蚶血液 MT基因相對表達量Fig. 1 Relative expression of MT gene in the blood of T.granosa under different concentrations of Pb2+

2.2　不同濃度Pb2+脅迫下泥蚶血液Vg表達規(guī)律

經(jīng)過28 d的Pb2+暴毒實驗, 泥蚶血液Vg mRNA的表達情況變化如圖2所示。相同Pb濃度水平攻毒時間對泥蚶血液Vg表達量的影響如下: 1 μg/L Pb2+脅迫下, 各時間點泥蚶血液Vg的表達較對照組均無顯著差異。3 μg/L Pb2+脅迫下, 其表達在14 d時被誘導(dǎo)達到最大值, 較其他時間點差異極顯著(P<0.01);在隨后的 21 d, 泥蚶血液 Vg的表達水平開始降低,但較對照組而言仍具顯著性(P<0.01), 到28 d時幾乎不表達; 總體上該濃度組泥蚶血液Vg的表達隨時間推移呈現(xiàn)先升后降的趨勢。6 μg/L Pb2+脅迫下, 各時間點泥蚶血液 Vg表達量與對照組相比均無明顯差異。9 μg/L Pb2+脅迫下, 泥蚶血液Vg基因表達水平在前21 d均無顯著變化, 但到 28 d時被顯著誘導(dǎo)達到較高表達水平, 較其他各時間點均差異顯著(P<0.01)。

圖2　不同Pb2+濃度組泥蚶血液Vg基因相對表達量Fig. 2 Relative expression of Vg gene in the blood of T.granosa under different concentrations of Pb2+

相同攻毒時間下不同Pb濃度對泥蚶血液Vg表達量的影響如下: 在 7 d時, 各濃度組泥蚶血液 Vg的表達量較對照組均無顯著差異; 14 d時, 僅3 μg/L實驗組泥蚶血液Vg的表達較同時期對照組而言顯著上升(P<0.01); 21 d時, 同樣僅3 μg/L實驗組泥蚶血液Vg較同期對照組顯著表達(P<0.01); 28 d時, 除9 μg/L實驗組泥蚶血液 Vg表達顯著上升外(P<0.01), 其他濃度實驗組較同時期對照組均無顯著變化。通過較長時期低劑量重金屬暴露下泥蚶血液 Vg表達量比較可知, 3 μg/L Pb2+濃度對其誘導(dǎo)表達的效果最為顯著。

3　討論

近年來, 環(huán)境中重金屬污染的日益嚴重, 引發(fā)了關(guān)于重金屬對水產(chǎn)生物抗氧化相關(guān)基因或蛋白的“研究熱”。包永波等通過對蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激蛋白、鈣結(jié)合蛋白和硫代謝相關(guān)蛋白是泥蚶應(yīng)對重金屬鎘脅迫的關(guān)鍵蛋白[26]。但目前關(guān)于Pb脅迫下生物體內(nèi)的免疫防御機制并不清晰。僅有少數(shù)研究表明Pb能減弱小鼠[27]、長牡蠣[28]的抗氧化能力。因此在Pb污染日益嚴重的當(dāng)下, 探究機體對Pb刺激的應(yīng)答具有重要意義。

MT活性結(jié)構(gòu)中的金屬離子能在體內(nèi)釋放作為抗氧化的促進劑, 并暴露出半胱氨酸殘基中的巰基與氧自由基發(fā)生反應(yīng)[29]。此外, MT可螯合機體內(nèi)部的金屬離子, 參與體內(nèi)金屬離子代謝, 調(diào)節(jié)金屬離子穩(wěn)態(tài), 防止及修復(fù)由于金屬離子失衡對機體造成的氧化損傷[30]。任玉娟等發(fā)現(xiàn)不同濃度的Cd(0.5、5、50 mg/L)脅迫下, 無齒蚌MT基因的表達量均在14d顯著上調(diào)[5]。Khati等[31]將翡翠貽貝在200 μg/LCd2+脅迫7 d后, 發(fā)現(xiàn)實驗組MTs相較對照組而言更高。本實驗發(fā)現(xiàn)泥蚶在各濃度 Pb2+脅迫下 MT基因表達量在14 d顯著上調(diào), 表明MT對重金屬Pb的作用與Cd相似, 只有機體中的Pb2+積累到一定程度時, MT才會被顯著誘導(dǎo)。但在暴毒 14 d后, 相對表達量開始下降, 且在28 d時回落到7 d的水平, 隨時間的推移整體呈現(xiàn)先增后減的趨勢。周湖明等[9]在對近江牡蠣進行慢性Pb攻毒實驗中, 發(fā)現(xiàn)MT表達量呈先增后減的模式?；舳Y輝等[11]在對縊蟶研究中也發(fā)現(xiàn), 其內(nèi)臟團MT表達呈現(xiàn)脈沖式波動, 具有較強的時間依賴性。說明Pb2+刺激能誘導(dǎo)MT基因表達, 合成大量的MT與Pb2+結(jié)合, 當(dāng)MT含量太高時又會對自身的轉(zhuǎn)錄機制產(chǎn)生負反饋抑制其表達[32-34]。同時 MT參與機體新陳代謝, 會在相關(guān)酶的作用下被降解[35],故呈現(xiàn)先上升在下降的趨勢。

Vg具有一定的免疫防御功能, 可以通過與金屬離子結(jié)合、清除體內(nèi)自由基等方式來發(fā)揮其抗氧化作用[36-38]。顧海龍等[39]發(fā)現(xiàn)在Cd脅迫下, 泥蚶消化腺 Vg被顯著誘導(dǎo)表達, 并維持在較高水平; 吳林德等[21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過 1、3、6 μg/L 的 Pb脅迫 28 d后, 泥蚶內(nèi)臟團Vg的相對表達呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在本實驗中, 泥蚶血液Vg基因表達量隨暴毒時間的延長, 3 μg/L和9 μg/L濃度組其被顯著誘導(dǎo)表達, 且在暴毒14 d后, 3 μg/L濃度組的相對表達量總體也呈現(xiàn)先增后減的趨勢。Corona等[40]發(fā)現(xiàn)蜂王在其腹脂肪體合成Vg蛋白作為抗氧化劑, 有助于延長蜂王的壽命。Hiramatsu等[41]研究發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝Vg是一種強效的免疫保護蛋白, 具有氧化活性。

綜上所述, 推測是由于Pb脅迫引起了泥蚶體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng), 產(chǎn)生了大量 ROS, 機體通過誘導(dǎo)Vg等基因的表達, 清除自由基, 從而緩解氧化壓力,防止ROS對機體造成損傷。通過兩個基因表達趨勢的比較發(fā)現(xiàn), 在28 d時, 各濃度組泥蚶血液MT基因表達均處于較低水平, 而此時泥蚶血液Vg基因顯著表達, 猜測兩者之間存在一定協(xié)調(diào)互補關(guān)系。而在低濃度長時間Pb2+暴毒下, 泥蚶血液MT基因的敏感性要優(yōu)于泥蚶血液 Vg基因。綜上可見, 從泥蚶血液MT和 Vg基因的表達情況來看, 兩者均不同程度地參與貝類重金屬解毒。但其具體的誘導(dǎo)機制和解毒機理及相互關(guān)系還有待探究。

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