他克莫司對肝臟缺血/再灌注損傷作用的研究進展

陳峰，王建，張雅敏，劉子榮（.天津醫(yī)科大學一中心臨床學院, 天津 3009；. 天津市第一中心醫(yī)院肝膽外科，天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心, 天津 3009）

肝移植是當前解決肝臟晚期病變、肝外傷、肝衰竭等急重癥肝臟疾病的唯一有效方法［1］。臨床上的移植肝需要經(jīng)歷熱缺血、冷灌注、低溫保存、復溫、缺血/再灌注等多個環(huán)節(jié)，而每一環(huán)節(jié)都可能對移植肝造成不同程度的損傷［2］。其中，肝臟的缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是主要的。它能夠降低肝臟的解毒作用，阻礙微循環(huán)，嚴重者可導致肝功能衰竭，直接影響預后情況。因此，關于減少供肝IRI的研究顯得尤為重要。他克莫司（FK506）作為一種免疫抑制劑在肝臟IRI中起重要的保護作用［3］。FK506能防止肝臟缺血/再灌注損傷期肝細胞內鈣超載，減輕氧自由基及脂質過氧化作用，維持三磷酸腺苷（triphosadenine， ATP）含量、保護細胞膜等功能。盡管當前關于FK506對肝臟缺血/再灌注作用的研究越來越多，但仍缺乏系統(tǒng)的認識。

1 FK506的作用機制

FK506是從筑波鏈霉菌發(fā)酵液中提取的大環(huán)內酯類免疫抑制劑［4］，1994年被美國食品和藥物管 理 局（Food and Drug Administration， FDA） 批準用于實體器官移植。FK506是一種高度親脂性的化合物，很容易穿過細胞膜進入細胞［5］。胞漿中含有的鈣調磷酸酶能夠使活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells， NFAT）的細胞質亞單位去磷酸化，從而使其向細胞核內易位并且與核亞單位結合，形成的復合物可與多種細胞因子如白細胞介素-2（interleukin，IL-2）基因的啟動子結合，從而上調后者的轉錄，而進入細胞的FK506與FK506結合蛋白形成的復合物能夠抑制鈣調磷酸酶的活性，從而抑制細胞因子基因的轉錄，影響細胞因子IL-2、IL-3、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、γ-干 擾 素（interferon-γ，INF-γ）等的表達［4，6］。這在一定程度上保護了移植的肝臟，有利于其術后功能恢復。

2 肝臟IRI與FK506的應用

在肝臟移植過程中，細胞及分子水平結構、功能的改變觸發(fā)了細胞損傷，而研究發(fā)現(xiàn)FK506在肝臟中的應用對IRI具有一定的抑制功效。

2.1 鈣超載：肝臟在缺血過程中，氧化磷酸化作用的減少導致ATP缺乏，而依賴ATP進行的鈣離子跨膜主動轉運受到影響，導致細胞鈣離子超載，擾亂了鈣穩(wěn)態(tài)［7］；缺血的同時引起肝細胞缺氧導致線粒體去能、鈉離子和氫離子穩(wěn)態(tài)改變，進而使肝血竇內皮細胞和庫普弗細胞（kupffer cells， KC）腫脹［8］。前期研究發(fā)現(xiàn)，肝缺血前給予FK506處理能夠抑制線粒體內鈣離子的濃度，維持其功能并調控引發(fā)炎癥通路的酶系統(tǒng)，降低肝臟的損傷［9］。而在全肝缺血/再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506可能通過提高線粒體呼吸作用、氧化磷酸化作用和抗氧化性能或者抑制鈣離子超載而減輕心肌線粒體的功能障礙［10］。這表明FK506對線粒體相關功能的作用有助于器官的保護。

2.2 微循環(huán)障礙：微循環(huán)障礙的發(fā)生可以由一氧化氮（NO）和血管緊張素（ET）之間的失平衡引起［8，11］。在肝臟缺血/再灌注過程中，ET濃度的增高導致血管收縮肝竇狀隙變窄，血流淤滯，繼而損傷肝細胞。Soda等［12］的研究顯示，F(xiàn)K506對內皮細胞中的血管收縮物質（ET-1）的表達有直接影響，可能改善肝臟微循環(huán)。而NO參與血流動力學和微循環(huán)的改變，能夠擴張微血管，減輕中性粒細胞的聚集，改善肝臟微循環(huán)，降低肝臟損傷［13］。因此，肝臟局部缺血預處理的保護作用可能存在內源性NO調節(jié)作用［14-17］。這與使用CD47單克隆抗體阻斷CD47對NO信號通路抑制的實驗中［18］，發(fā)現(xiàn)此抗體應用后能夠減弱移植肝的IRI，保護肝功能并提高受體存活率的結果相符。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506對體外培養(yǎng)的內皮細胞進行處理后，ET-1含量明顯增加而NO含量沒有明顯改變［19］。但低劑量FK506聯(lián)合NO抑制劑（AGH）處理移植肝，術后3天丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平明顯低于單用FK506組，而且術后第5、8、10天組織檢查發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應用組幾乎沒有淋巴細胞浸潤。該實驗結果表明，兩者聯(lián)合應用可以減少浸潤的炎癥細胞、誘導缺血耐受，同時對大鼠肝移植進行聯(lián)合雙重藥物處理有預防的效果［20］。

2.3 氧自由基、細胞因子及中性粒細胞之間的作用：活化的KC釋放活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）和促炎細胞因子，包括TNF-α和IL-1等［21-22］。而活化的內皮細胞和肝細胞可以通過線粒體和黃嘌呤脫氫酶/黃嘌呤氧化酶（XDH /XOD）途徑產(chǎn)生ROS［23-24］。細胞因子促進中性粒細胞的活化和聚集，從而有助于釋放的活性氧和蛋白酶損傷肝實質［21，25］。毛細血管收縮也有助于肝臟中性粒細胞的聚集［26］。此外，細胞因子IL-1β和TNF-α可以募集并激活CD4+T淋巴細胞，產(chǎn)生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor， GM-CSF）、γ-IFN，這些細胞因子進一步促進KC活化、TNF-α和IL-1分泌、中性粒細胞募集和黏附入肝血竇［27］。這與賀凱等［28］研究發(fā)現(xiàn)的在肝臟缺血/再灌注早期CD4+T淋巴細胞先于中性粒細胞進入缺血區(qū)，并可能對中性粒細胞浸潤產(chǎn)生調節(jié)作用是一致的。血小板活化因子為中性粒細胞ROS產(chǎn)生做好準備，而白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）有助于中性粒細胞反應的放大［21，25］。

促炎細胞因子的分泌激活了機體免疫系統(tǒng)，而FK506對促炎細胞因子IFN-γ、TNF-α的分泌有較強的抑制作用，發(fā)揮了免疫抑制功能；同時對GM-CSF也有明顯的抑制效果，降低了中性粒細胞的產(chǎn)生，減輕了移植物的炎癥損傷［29］。魏思東等［30］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506組中肝臟糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體（glucocor-ticoid-induced TNF receptor，GITRL）的表達水平明顯降低，而抗炎細胞因子IL-10含量升高。說明在肝臟移植中FK506抑制了GITRL的表達，加強了免疫耐受。由于GITRL具有促進T細胞增殖和激活的效應，F(xiàn)K506可以通過抑制GITRL的表達來減輕肝移植排斥反應。另外，肝移植患者經(jīng)FK506治療后，CD4+T細胞水平明顯降低，由此而誘導的細胞因子表達水平降低，并抑制T細胞免疫排斥反應［31］。

2.4 抗氧化劑：移植物中抗氧化劑的水平與其損傷有關。在肝細胞缺血缺氧階段，內源性的抗氧化劑如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）會失活或耗盡，超氧化物的清除減少［32］。這與研究發(fā)現(xiàn)肝移植物中抗氧化劑SOD的過表達、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的預處理都可降低其損傷，提高成活率是一致的［33］。

在對預處理的肝臟進行再灌注2小時后，F(xiàn)K506（10 ng/ml）組導致血漿ALT含量降低，還原型谷胱甘肽的氧化產(chǎn)物（GSSG）的含量顯著降低，而內源性細胞內的GSH的濃度沒有變化。相對應的，再灌注后GSSG的膽汁濃度及血漿中的含量明顯增加。這表明當FK506作為移植肝的沖洗液時，會通過一個未知的通路來影響缺血后GSH的代謝［34］。ROS水平的增加是已知的能參與缺血/再灌注損傷的發(fā)病機制之一。FK506在體內的應用與減少ROS相關［35］。一種可能的作用機制是ROS通過維持細胞質和細胞外GSH/GSSG發(fā)揮解毒作用。該現(xiàn)象很可能是由FK506在肝細胞中抗氧化作用導致的。這與Pratschke等［34］的研究結果相符，即肝細胞100%的吸收了應用劑量為10 ng/ml的FK506。

2.5 信號通路的激活：IRI啟動內質網(wǎng)蛋白質的錯誤折疊，后者激活一個高度保守的未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）信號轉導通路。而保守的UPR激活需要肌醇需要酶1、PKR樣ER激酶（PERK）和激活轉錄因子（ATF-6）3個內質網(wǎng)跨膜蛋白來協(xié)同完成。如果損壞非常嚴重，不能恢復平衡，內質網(wǎng)應激信號轉導通路就會引發(fā)細胞的凋亡和壞死［33］。

在肝臟缺血損傷中，Toll樣受體4（toll like receptor-4， TLR4）信號通路同樣起到了一定的作用。Ellett等［36］用敲除TLR4的動物進行實驗，發(fā)現(xiàn)TLR4的缺失減少了促炎因子釋放及肝臟損傷。而通路中髓樣分化的初級反應基因88和TIR結構域接頭分子誘導INF-β激活細胞內信號傳導，最終引發(fā)炎癥反應［33，37］。Kilinc等［38］研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，術前給予FK506處理的供體大鼠缺血/再灌注后早期TLR4的表達水平顯著地降低。

2.6 炎癥反應：研究發(fā)現(xiàn)FK506的濃度和劑量比值與肝移植受體IL-18和IFN-γ有關，IL-18或IFN-γ在血清中含量高，則FK506的濃度與劑量比值低。而在IL-18含量高的實驗組，其移植肝功能障礙的發(fā)生率也高。這是基于IL-18上調P-糖蛋白（P-gP）的結果［39］。在另一個實驗中，同種異體移植炎癥因子-1（allograft inflammatory factor-1，AIF-1）的mRNA、蛋白質及誘導物IFN-γ、IL-1β在IRI的原位移植和同種異體移植排斥模型中顯著增加。而AIF-1在炎癥和免疫過程中發(fā)揮作用，其活化與肝臟的損傷有關聯(lián)。該實驗表明經(jīng)低劑量的FK506預處理后，部分抑制AIF-1活化及其誘導物IFN-γ、IL-1β并減少熱缺血及冷IRI［40］。另外，研究中發(fā)現(xiàn)AIF-1被抑制的原因可能是其誘導物被抑制的結果。因為FK506在活體能夠抑制IFN-g和IL-1b的上調，但在應用IFN-g和IL-1b刺激的大鼠巨噬細胞中卻無限制AIF-1上調的作用。因此，F(xiàn)K506不會對巨噬細胞產(chǎn)生直接作用，而有可能是淋巴細胞［40］。Kristo等［41］的研究同樣發(fā)現(xiàn)FK506具有抗炎性能，對移植肝進行灌洗能減少前炎癥酶前體的產(chǎn)生并能夠在全基因組基礎上抑制炎癥和免疫反應。

2.7 肝功能的保護：白三烯受體拮抗劑（ONO-4057）聯(lián)合FK506在大鼠肝移植模型中進行研究，發(fā)現(xiàn)術后血清轉氨酶水平低于單獨應用FK506組。而單用ONO-4057卻沒有減少IRI，這說明其預處理對FK506的保護功能有額外的作用［42］。另外，王東等［43］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506能在一定程度上保護脂肪肝供體大鼠肝移植圍術期移植物的功能。在臨床前期的動物模型中發(fā)現(xiàn)FTY720與亞治療劑量的FK506聯(lián)合應用能夠有效地預防移植術后急性排斥反應的發(fā)生，并明顯減少FK506可能造成的肝腎毒性［44］。

初步的臨床數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)K506預處理在人類肝移植表現(xiàn)出不同的效果。在一實驗中，Peter等［45］用20 ng/ml FK506門靜脈給藥對早期肝功能產(chǎn)生有益效果，顯著降低了肝移植術后轉氨酶水平。但在另一項隨機對照試驗中，Kristo等［41］發(fā)現(xiàn)FK506經(jīng)門靜脈給藥處理，術后第6天ALT、天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase， AST）含量與對照組相比未有降低。

2.8 T細胞：自然殺傷T細胞（natural killer T cell， NKT）和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）對循環(huán)肝細胞有毒性作用，并因此抑制肝臟再生［46-47］。在經(jīng)歷肝部分切除的小鼠模型中，F(xiàn)K506可以抑制NKT細胞的擴散［48］。而在另一項研究中發(fā)現(xiàn)：① 實驗組中FK506降低了NK細胞在肝臟的浸潤；② FK506與雷帕霉素聯(lián)合應用在肝缺血/再灌注中的保護作用是伴隨著肝臟T淋巴細胞的減少和淋巴細胞亞群相對比例的復合變化而完成的［49］。該實驗表明此作用不僅是主效應細胞的減少，而且還有Th1/Th2早期的降低和調節(jié)性T淋巴細胞的逐漸增加。這與之前發(fā)現(xiàn)的Th1抑制Th2的活化來加速移植排斥和Th2 抑制Th1來誘導移植物被接受的作用相符合［50］。在缺血/再灌注的大鼠組，F(xiàn)K506還增強了循環(huán)細胞的比例。另外，實驗表明盡管信號通路不同，但以共同的方式改變了早期局部免疫反應［49］。Tamura等［51］研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑FTY720與FK506聯(lián)合應用于鼠肝移植模型可以顯著減少移植肝的淋巴細胞浸潤，并且肝組織結構沒有明顯的變化。

2.9 細胞凋亡：再灌注期間，TNF-α和其他介質活化了與細胞凋亡相關的蛋白，如caspase-3 、caspase-8及釋放入胞質的線粒體細胞色素c，導致DNA的破壞和細胞凋亡［27］。而肝細胞的凋亡破壞了細胞保護屏障。FK506處理的大鼠脂肪肝在缺血/再灌注后壞死細胞明顯減少，而凋亡細胞數(shù)量增加了，同時防止了ATP含量的降低。但在對照組測得細胞凋亡數(shù)量和ATP含量明顯降低，而壞死細胞數(shù)量增加［52］。該實驗說明FK506通過防止ATP的損耗來保護脂肪肝對抗IRI。

TNF超家族成員的受體CD40的活化會通過FasL的表達介導Fas誘導的人肝細胞凋亡，而器官移植時，低氧會增加FasL的表達引發(fā)肝損傷［53］。在大鼠肝移植模型中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506通過對Fas表達的下調和Bcl-2表達的上調發(fā)揮抗細胞凋亡作用［54］。同樣，Gómez-Lechón等［55］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506在體外可阻止Fas誘導的人肝細胞凋亡，從而維持細胞保護屏障的完整性。

2.10 熱休克蛋白：熱休克蛋白（heart shock protein， HSP），在肝臟缺血/再灌注中被誘導表達，雖然有關研究發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)的時間、變化的規(guī)律和分布有所不同，但都表明與肝臟IRI的發(fā)生、發(fā)展有關。它能調整應激過程中細胞的存活能力，保護細胞免受損傷，有利于細胞結構和功能的恢復，進而維持內壞境的穩(wěn)定。HSPs對肝臟保護作用的機制主要有調控炎癥因子的表達、抑制中性粒細胞浸潤、抗細胞凋亡和抗氧化作用［56］。而伴隨HSP70表達增加的轉基因小鼠同樣證實不容易遭受缺血損傷。前期的研究已表明，在培養(yǎng)的肝細胞中FK506能夠增強HSP70誘導型的表達［9］。但HSP70在臨床應用的研究報道尚少。所以，具有保護性能并可被FK506誘導產(chǎn)生的HSP70在人肝臟缺血/再灌注中的作用需要進一步研究。

2.11 核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）：NF-κB是一種調節(jié)許多基因表達的可誘導的核轉錄因子。在肝臟熱缺血和冷缺血過程的急性損傷反應中發(fā)揮了多種作用。在KC中，活化的NF-κB通過細胞因子表達的增強加重了缺血/再灌注肝臟的炎癥反應和損傷，而在肝細胞中NF-κB卻起到了細胞保護作用［57］。這種作用在其他實驗中被證實，NF-κB受體激活劑（RANK）及它的配體（RANKL）相互作用提高了NF-κB的活化，減弱了肝臟的IRI［58］。而前期實驗研究表明FK506能夠阻斷NF-κB的早期活化［9］。

2.12 血小板活化：肝臟的IRI刺激了KC和中性粒細胞的活化，而活化的中性粒細胞釋放中性粒細胞彈性蛋白酶并黏附于肝血竇內皮細胞。而血小板也參與了肝臟IRI，其在肝血竇的黏附導致了再灌注后肝功能障礙。二者協(xié)同加劇肝竇內皮細胞凋亡［59］。該實驗證明了于缺血/再灌注后顯著增加的血小板黏附是中性粒細胞誘導的而不是KC。但另一實驗發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后，肝血竇內KC數(shù)量的減少降低了黏附于血小板的KC數(shù)量，并導致KC和血小板之間相互作用的減弱［60］。說明KC-血小板間的相互作用與KC數(shù)量有關。另外，活化的血小板可以通過分泌功能性的CD154來誘導ROS集聚在肝細胞內引起凋亡［53］。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，臨床上應用FK506會出現(xiàn)血小板減少的現(xiàn)象。但在體外進行FK506對血小板功能影響的實驗表明，當前治療劑量的FK506不會直接引起人血小板的凋亡或活化，但其對血小板聚集功能有一定的影響，可能會間接加重器官移植后血小板的局部聚集［61］。

2.13 肝再生：對應用FK506預處理的大鼠實施70%肝切后，進行再生肝細胞分裂指數(shù)等檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比明顯升高［62］。同樣，70%肝切并伴有門脈狹窄的鼠肝給予FK506處理，與未用藥對照組相比測得：剩余肝臟重量顯著增加，核分裂指數(shù)較高，肝再生所需的IL-6表達明顯增加［63］。以上結果表明，F(xiàn)K506具有促進肝臟再生的能力。然而，Lodewijk等［64］的實驗發(fā)現(xiàn)，在肝臟再生期間他克莫司的新陳代謝會被抑制。這是因為肝移植應用的許多免疫抑制藥物是通過細胞色素P450-3A4系統(tǒng)進行新陳代新的，而肝臟再生是與下調細胞色素P450-3A4系統(tǒng)相關的。所以，肝再生與FK506的應用存在一定的矛盾。這也正是FK506治療窗狹窄的體現(xiàn)。

3 結語和展望

缺血/再灌注對肝臟會產(chǎn)生多重的病理生理學反應，造成其不同程度的損傷。包括氧化磷酸化作用減少導致ATP的耗竭，鈣離子超載，ROS、促炎介質的形成，巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的募集和活化，細胞因子的釋放及微循環(huán)障礙等。因此，在移植后很難達到理想的保護效果，而最近的研究發(fā)現(xiàn)FK506或與其他藥物聯(lián)合的應用對移植肝的干預或預處理具有許多優(yōu)勢，如減少缺血造成的細胞損傷，降低術后血清轉氨酶的含量，促進移植肝術后肝功能的恢復等。

盡管關于FK506的動物實驗及臨床研究對IRI的作用取得了不少進展，但目前對FK506的肝保護作用仍缺乏明確的認識，一些實驗結果尚存在相互矛盾之處，并且肝臟IRI是多因素復合反應的結果。因此，免疫抑制劑FK506對移植肝進行預處理或干預治療從而減少缺血/再灌注造成損傷的潛在治療作用及可能的不良反應仍需進一步的研究。