誘導多能干細胞應(yīng)用研究進展

孫傳河，高鵬琳，廖偉龍，姜文斐，潘衛(wèi)東

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腦病科，上海 201203

綜述

誘導多能干細胞應(yīng)用研究進展

孫傳河，高鵬琳，廖偉龍，姜文斐，潘衛(wèi)東

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腦病科，上海 201203

利用體細胞重編程技術(shù)將已分化的體細胞轉(zhuǎn)化為誘導多能干（induced pluripotent stem，iPS）細胞是生命科學領(lǐng)域的一個里程碑事件。iPS細胞與胚胎干細胞的作用類似，均有分化成機體各種成熟細胞的潛能，但前者可以避免胚胎干細胞研究中存在的免疫排斥和醫(yī)學倫理等問題。因此，iPS細胞在基礎(chǔ)及臨床研究領(lǐng)域均展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本文對iPS細胞歷經(jīng)10年的研究歷程、iPS細胞目前在臨床各類疾病及藥物監(jiān)測中的應(yīng)用以及iPS細胞研究中存在的問題進行綜述，重點闡述iPS細胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。

誘導多能干細胞；神經(jīng)系統(tǒng)疾病；心血管系統(tǒng)疾??；視網(wǎng)膜病變；傳染??；藥物監(jiān)測

潘衛(wèi)東

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PAN Weidong

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2006年，日本Takahashi等[1]首次利用特定的轉(zhuǎn)錄因子將小鼠成纖維細胞重編程為誘導多能干（induced pluripotent stem，iPS）細胞，這一研究掀起了一場醫(yī)學變革。10年后的今天，iPS細胞在生物研究領(lǐng)域的影響逐漸凸顯出來。

1 iPS細胞研究的發(fā)展歷程

2006年8月，日本Takahashi等[1]首次誘導出小鼠iPS細胞，此細胞具備分化成表皮細胞、神經(jīng)細胞、肌纖維細胞等多種類型細胞的能力。2007年，Takahashi等[2]進一步簡化了上述誘導過程，將24個轉(zhuǎn)錄因子縮減至4個轉(zhuǎn)錄因子，成功誘導出人體iPS細胞；同年，Yu等[3]篩選出另一組轉(zhuǎn)錄因子。2008年，Liao等[4]利用患者的體細胞誘導出致病的iPS細胞。2009年，誘導干細胞的效率得到提升，并且轉(zhuǎn)錄因子基因既可以被成功導入，又可以被成功移除[5]；同年，利用iPS細胞成功誘導出多巴胺神經(jīng)元[6]。2012年，John Gurdon和Shinya Yamanaka因發(fā)現(xiàn)成熟細胞可被重新編輯而被授予諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。2013年，Maeda等[7]將2例老年黃斑變性患者的表皮細胞誘導成iPS細胞，隨后將iPS細胞成功轉(zhuǎn)化成視網(wǎng)膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium，RPE）。2014年，日本理化學研究所開展了自體人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）來源的RPE移植治療年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）的臨床試驗[8]。

2 iPS細胞的應(yīng)用

2007年，小鼠鐮狀紅細胞貧血癥通過iPS細胞得以成功治愈[9]。2008年，肌萎縮側(cè)索硬化癥患者的皮膚細胞首次被誘導成iPS細胞且分化為運動神經(jīng)元[10]。2009年，利用iPS細胞誘導出的內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮前體細胞成功治療了血友病A小鼠，這給單基因遺傳病的治療帶來了希望[11]。起初，在iPS細胞誘導為成熟細胞的過程中，一般會有病毒DNA的參與，而Lu等[12]則避免了這一局限，為iPS細胞在人類中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.1 iPS細胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

2008年，利用iPS細胞成功誘導出神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元[13]，這為神經(jīng)退行性病變的治療帶來了希望；同時，該方法也將取代以往神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制研究常用的動物轉(zhuǎn)基因或基因敲除模型，利用人體iPS細胞模型來研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如此可以動態(tài)地全面觀察疾病過程中分子和細胞水平的變化，避免以往動物模型研究存在的鼠類及其他嚙齒類動物與人類種屬之間存在差異的局限。換言之，人體iPS細胞模型是研究人體發(fā)育過程的最佳體外模型。

2.1.1 多發(fā)性硬化

李梅等[14]認為，iPS細胞在多發(fā)性硬化治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。利用Takahashi等[1-2]的方法，將iPS細胞來源的神經(jīng)干細胞和少突膠質(zhì)前體細胞重新編程后移植入實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠模型以及其他脫髓鞘動物模型后，發(fā)現(xiàn)可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子如白血病抑制因子等，促進內(nèi)源性髓鞘細胞分化，使動物的殘疾狀態(tài)得以改善，并觀察到髓鞘再生。此外，iPS細胞調(diào)控的營養(yǎng)作用可維護血腦屏障的完整性，使炎性反應(yīng)局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)可以減輕髓鞘的受損。iPS細胞還可最終分化成少突膠質(zhì)細胞，促進髓鞘形成及修復(fù)，從而對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎及其他脫髓鞘疾病具有治療作用。

2.1.2 帕金森病

帕金森病是以中腦多巴胺神經(jīng)元調(diào)亡為特征的神經(jīng)退行性病變，一旦發(fā)病，不可逆轉(zhuǎn)。目前臨床上常用的治療手段僅是改善癥狀，而無法延緩病情的進展。隨著醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，細胞移植為帕金森病的治療帶來了新的希望。通過干細胞技術(shù)誘導出正常的多巴胺神經(jīng)元，并將其導入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，有望徹底治愈帕金森病。有學者報道，將多巴胺神經(jīng)元植入帕金森病患者腦中，可使其運動癥狀得到一定程度的改善[15]；但鑒于獲取正常多巴胺神經(jīng)元需要破壞胚胎，而這種行為違背了醫(yī)學倫理學的原則，因此導致細胞移植的發(fā)展受到了限制。iPS細胞的出現(xiàn)可望成功解決這一難題。2010年，利用帕金森病患者的iPS細胞，成功誘導出多巴胺神經(jīng)元[16]；將誘導成功的多巴胺神經(jīng)元移植入大鼠模型后，能夠改變大鼠的運動功能[17]。此后，有學者開始利用帕金森病患者的iPS細胞對多巴胺神經(jīng)元的死亡機制進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體功能受損是神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，基因突變導致多巴胺神經(jīng)元易于發(fā)生氧化損傷的原因是突變的基因可導致多巴胺神經(jīng)元的脆性增加[18-19]。

2.1.3 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病是一種以進行性認知和記憶障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞退行性疾病，嚴重時可出現(xiàn)精神行為異常，給患者及其家屬和社會均帶來巨大的負擔。阿爾茨海默病一旦發(fā)生，將呈進行性加重，且無法逆轉(zhuǎn)，目前尚缺乏滿意的治療方法。因此，研究阿爾茨海默病的發(fā)病機制以及有效的防治手段迫在眉睫。既往研究的結(jié)果顯示，阿爾茨海默病的發(fā)生主要與β淀粉樣肽大量沉積導致神經(jīng)元毒性、Tau蛋白的神經(jīng)毒性導致神經(jīng)損傷以及神經(jīng)纖維纏結(jié)等有關(guān)[20-21]。特別是β淀粉樣肽的聚集，可導致神經(jīng)元發(fā)生退行性病變。此外，基因突變也是引發(fā)阿爾茨海默病的重要因素。目前已能夠獲得基因突變的iPS細胞[22]，將其進一步分化成神經(jīng)元細胞后，發(fā)現(xiàn)存在β淀粉樣肽的大量聚集，由此提示β淀粉樣肽可導致阿爾茨海默病的發(fā)生。

2.1.4 Huntington病

Huntington病是由Huntington基因中的三核苷酸重復(fù)序列（CAG）重復(fù)擴增產(chǎn)生具有細胞毒性的Huntington蛋白所致。一般認為，三核苷酸重復(fù)序列（CAG）超過35個才會發(fā)病。Huntington病在臨床上主要表現(xiàn)為舞蹈樣動作和進行性認知障礙。有學者利用Huntington病患者的iPS細胞對三核苷酸重復(fù)序列（CAG）重復(fù)擴增的長度進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常人體iPS細胞相比，Huntington病患者的iPS細胞在神經(jīng)發(fā)育、RNA代謝和蛋白穩(wěn)態(tài)等方面均存在差異，并且三核苷酸重復(fù)序列（CAG）重復(fù)擴增長度較短的細胞的基因和蛋白表達均更易受到干擾，而重復(fù)擴增長度最長的細胞對細胞刺激物的反應(yīng)最弱，由此提示Huntington病與重復(fù)擴增長度有關(guān)[23]。近年來的不少研究都觀察到Huntington病患者存在轉(zhuǎn)錄抑制因子活性的改變，其iPS細胞中的溶酶體活性發(fā)生改變，這為Huntington病的病理機制以及治療研究提供了新的線索[24-25]。

2.2 iPS細胞在心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

Nelson等[26]觀察發(fā)現(xiàn)，利用iPS細胞誘導成的心臟實質(zhì)細胞具有正常心肌細胞的恢復(fù)性收縮和電位穩(wěn)定等特性；同時，iPS細胞作為自體細胞，可以更好地修補心臟細胞。近年來的研究[27]證實，在iPS細胞的誘導分化過程中，可以順利轉(zhuǎn)化出可擴展的心臟祖細胞，該細胞可以進行自我更新，且適合低溫貯藏，還能夠繼續(xù)分化并培育出低度異質(zhì)性的其他細胞，由此意味著可顯著縮減實驗時間和經(jīng)費。Lalit等[28]發(fā)現(xiàn)了5種特異性轉(zhuǎn)錄因子，能夠?qū)⑿∈蟪衫w維細胞誘導為心臟祖細胞，后者在催化劑和白細胞抑制因子的作用下，可以不斷擴增。Zhang等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)，在酪氨酸激酶JAK抑制劑3、骨形態(tài)生成蛋白4、激活素、CHIR99021和SU5402的參與下，特異性轉(zhuǎn)錄因子可將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為誘導的可擴展心臟祖細胞；在骨形態(tài)生成蛋白4的作用下，該細胞能夠不斷擴增，并且分化成心肌細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞。Cao等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)合細胞因子的作用下，通過人多能干細胞（human pluripotent stem cells， hPSCs） 可獲得同種的心血管祖細胞，后者可以自我更新，并不斷擴增。能夠獲得可擴增祖細胞的其他方法包括將可發(fā)揮作用的基因進行轉(zhuǎn)換，使其具有永久性。Birket等[31]等將Dox-inducible Myc表達片段導入hiPSCs，可使心臟祖細胞成倍擴增。類似的方法曾被報道用于血小板或紅細胞的增殖研究[32-33]?？傊?，來自iPS細胞的可擴展細胞不但可以定向分化，且分化效率亦不斷提高。因此，心肌梗死等心血管疾病實現(xiàn)完全自我修復(fù)是值得期待的。

2.3 iPS細胞在視網(wǎng)膜病變中的應(yīng)用

2009年已提出通過誘導iPS細胞來治療視網(wǎng)膜變性疾病[34]；此后，利用iPS細胞可成功誘導出視網(wǎng)膜前驅(qū)細胞，將其移植入視網(wǎng)膜變性小鼠體內(nèi)，可誘導出具有正常視網(wǎng)膜生理特點的視網(wǎng)膜類型的細胞。2013年，Maeda等[7]利用2例老年黃斑變性患者的表皮細胞誘導成iPS細胞，隨后將iPS細胞成功轉(zhuǎn)化成RPE。此后不久，日本的研究人員開始研發(fā)其他的誘導方法，即刺激激發(fā)獲得多能狀態(tài)（stimulus-triggered acquisition of pluripotency，STAP），這一方法對Takahashi等［1-2］的理論造成了一定的沖擊。

2.4 iPS細胞在感染性疾病中的應(yīng)用

iPS細胞可以模擬人類胚胎發(fā)育過程，所以可被用于診斷孕婦是否感染Zika病毒以及該病毒是如何導致嬰兒小頭畸形的。Qian等[35]利用iPS細胞塑造出類腦器官，當發(fā)生Zika病毒感染時，發(fā)現(xiàn)Zika病毒首先侵襲神經(jīng)干細胞而不是新生的神經(jīng)元，繼而導致大量神經(jīng)干細胞的死亡以及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的減少，最終導致小頭畸形。

2.5 iPS細胞在藥物監(jiān)測中的應(yīng)用

iPS細胞已被成功應(yīng)用于藥物監(jiān)測，利用iPS細胞能夠鑒定出適用于疾病的藥物。2016年，研究人員從患有遺傳性痛覺障礙的患者體內(nèi)獲取iPS細胞，進而誘導出感覺神經(jīng)元；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈉通道阻滯劑可以降低感覺神經(jīng)元的興奮性，從而減輕疼痛[36]。由此可見，iPS細胞可用于測試患者對藥物的敏感性，但尚需得到更多證據(jù)的支持。

2.6 iPS細胞的其他應(yīng)用

一些研究團隊還發(fā)現(xiàn)，iPS細胞不僅可以被塑造成人類器官，如肝和腸等，還有助于揭示疾病的發(fā)病機制。例如，利用iPS細胞可以演示與青光眼發(fā)病相關(guān)的基因復(fù)制與神經(jīng)細胞叢凋亡的關(guān)聯(lián)[37]，以及從基因和細胞更新的角度闡釋Huntington病的發(fā)病機制[23]。

3 iPS應(yīng)用中存在的問題

iPS細胞研究已經(jīng)過了漫長而輝煌的10年發(fā)展歷程。相較于胚胎干細胞，iPS細胞盡管避免了醫(yī)學倫理學問題及免疫排斥，但仍存在一些問題值得深思，亟待解決。

首先，誘導iPS細胞的方法雖然幾經(jīng)改進[38-39]，但不少誘導方法的效率依然很低，僅有少量細胞能夠完全誘導成功，并且誘導后的iPS細胞的狀態(tài)并不穩(wěn)定，致使其在實驗過程中很難受到控制。Paquet等[40]在對1例阿爾茲海默病患者進行iPS細胞研究時即遇到這一難題，他們發(fā)現(xiàn)患者的iPS細胞在培養(yǎng)過程中不受控制，推測這可能與基因表達有關(guān)，遂將目光轉(zhuǎn)向基因修飾。近年來，精準的基因修飾方法已經(jīng)得到了很好的應(yīng)用，其中基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9是近年來被廣泛應(yīng)用的基因修飾工具。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可以將疾病相關(guān)突變因子導入iPS細胞中，與未進行基因修飾的細胞相比顯示出明顯的優(yōu)勢。利用CRISPR技術(shù)可使iPS細胞發(fā)生特定的點突變，從而可以直接獲得阿爾茲海默病突變細胞。

其次，由于iPS細胞僅是一種胚胎細胞類似物，所以在應(yīng)用于一些遲發(fā)性疾病如癡呆的研究時，并不十分理想。研究人員正設(shè)法通過蛋白水平的修飾，使iPS細胞發(fā)育成熟，從而使其得到更好的應(yīng)用。再者，盡管現(xiàn)在已有許多被誘導成功的細胞，但研究人員尚不清楚其中的具體過程。目前，主要通過監(jiān)測基因表達水平以系統(tǒng)性地鑒別這些細胞的身份及安全性。

4 iPS應(yīng)用的未來展望

一般而言，一項基礎(chǔ)研究的成果能夠被成功地應(yīng)用于臨床大約需要花費20年的時間。iPS細胞的應(yīng)用同樣也將經(jīng)歷一個漫長的過程。2016年3月，歐洲iPS細胞銀行啟動了利用iPS細胞構(gòu)建人類疾病細胞模型的計劃，Shinya Yamanaka亦參與其中，目標是獲取多種具有免疫兼容性的iPS細胞。在iPS細胞相關(guān)的細胞治療領(lǐng)域，未來面臨的最大挑戰(zhàn)不是來自于技術(shù)，而是需要獲得政府部門和藥物生產(chǎn)廠商的大力支持。此外，在藥物監(jiān)測和疾病模型構(gòu)建方面，iPS細胞僅能簡化這一過程。

總之，任何一項新技術(shù)的應(yīng)用都將經(jīng)歷一個漫長的過程，iPS細胞技術(shù)也不例外。

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Progress in application of induced pluripotent stem cells

SUN Chuanhe, GAO Penglin, LIAO Weilong, JIANG Wenfei, PAN Weidong
Department of Neurology, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Induced pluripotent stem (iPS) cells can be directly generated from differentiated somatic cells by transduction, which is a great revolution in life sciences. iPS cells are similar to embryonic stem cells and have the potential to differentiate into mature cells, but the former can avoid immunological rejection and medical ethics which exists in the study of embryonic stem cells. Therefore, iPS cells have shown a good prospect in the field of basic and clinical research. This paper reviews the 10-year development course of iPS cells research, the use of iPS cells in many kinds of diseases and clinical drug monitoring, and the problems in the study, especially focusing on the application of iPS cells in nervous system diseases.

Induced pluripotent stem cells; Nervous system diseases; Cardiovascular system diseases;Retinopathy; Communicable diseases; Drug monitoring

March 30, 2017; accepted for publication June 7, 2017

Copyright ? 2017 by Journal of Neurology and Neurorehabilitation

10.12022/jnnr.2017-0014

國家自然科學基金面上項目（編號：81373619）

FUNDING/SUPPORT: General Project of National Natural Science Foundation of China (No. 81373619)

CONFLICT OF INTEREST: The authors have no con fl icts of interest to disclose.

孫傳河, 高鵬琳, 廖偉龍, 等. 誘導多能干細胞應(yīng)用研究進展[J]. 神經(jīng)病學與神經(jīng)康復(fù)學雜志, 2017, 13(2):74-79.

To cite: SUN CH, GAO PL, LIAO WL, et al. Progress in application of induced pluripotent stem cells. J Neurol and Neurorehabil, 2017,13(2):74-79