AGR2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

孟冠男， 楊照微，楊素麗，黃麗紅，才子斌*，何成彥，郭宏華

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

AGR2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

孟冠男1， 楊照微2，楊素麗2，黃麗紅2，才子斌1*，何成彥2，郭宏華2

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

目的 初步探討前梯度蛋白2(Anterior Gradient-2,AGR2)在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。用以定義新的結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物。方法 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中蛋白質(zhì)表達(dá)譜由二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)完成，蛋白表達(dá)情況通過免疫印跡驗(yàn)證。結(jié)果 被篩選的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的差異蛋白共39個(gè)，其中19個(gè)為上調(diào)表達(dá)蛋白。結(jié)論 AGR2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能是新的結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物。

結(jié)直腸癌；AGR2；二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

(ChinJLabDiagn,2017,21:0389)

近年來，結(jié)直腸癌在中國的發(fā)病率逐年增高，在公眾眼中已被視為常見腫瘤之一[1]。手術(shù)和化療對(duì)于早期的結(jié)直腸癌的治療具有較好的效果[2]。然而，由于對(duì)化療不敏感且容易復(fù)發(fā)使得晚期結(jié)直腸癌患者的五年存活率只有50%[3]。因此，在結(jié)直腸癌進(jìn)入晚期之前對(duì)其進(jìn)行診斷對(duì)于提高結(jié)直腸癌的生存率顯得尤為重要。在二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選出的39個(gè)表達(dá)存在差異蛋白中，前梯度蛋白2(AGR2)是上調(diào)表達(dá)蛋白之一。研究顯示，AGR2在細(xì)胞的生長增殖過程中扮演了重要角色。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本來自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，組織標(biāo)本庫取病理確診為結(jié)直腸癌的證實(shí)為Dukes B期腺癌患者，患者術(shù)前未接受任何治療，為接受手術(shù)治療后的新鮮組織標(biāo)本。所用癌旁正常組織為遠(yuǎn)離癌組織10厘米以上且位于癌組織上段。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，取手術(shù)新鮮組織，沖洗，液氮速凍，-80℃保存。

1.2 方法 通過LC-MS/MS法篩選出的結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的39個(gè)有顯著差異的蛋白質(zhì)中選擇上調(diào)蛋白AGR2做免疫印跡，從蛋白表達(dá)的角度驗(yàn)證前期實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.3 主要試劑 N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TMED)、二硫代蘇糖醇(DTT)、考馬斯亮藍(lán)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴酚藍(lán)、苯甲基磺酰氟(PMSF)購于Sigma公司。碘代乙酰胺(IAM)、IPG預(yù)制膠條、礦物油、蛋白質(zhì)定量試劑盒(RCDC Protein Assay Kit)購于Bio-Rad公司。TPCK修飾的測(cè)序級(jí)胰酶購自Promeg公司。Agilent 1200高效液相色譜儀購自美國Agilent公司，LTQXL離子肼質(zhì)譜儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SEQUEST算法計(jì)算二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用圖譜數(shù)據(jù)，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x—±s)表示實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，用SPSS11.0軟件分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析 本實(shí)驗(yàn)的每個(gè)蛋白的豐度通過譜圖數(shù)來衡量。衡量的標(biāo)準(zhǔn)如下：①兩個(gè)樣品中蛋白譜圖數(shù)的差值≥72；②兩個(gè)樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值≥1。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析數(shù)據(jù)中腫瘤組織與癌旁組織的蛋白，得到39個(gè)有顯著差異的蛋白，本文以上調(diào)蛋白AGR2為中心進(jìn)行論述，AGR2質(zhì)譜結(jié)果見圖1，圖2。

圖1 AGR2蛋白中序列肽段GWGDQLIWTQTYEEALYK的串聯(lián)質(zhì)譜圖

圖2 AGR2蛋白中序列肽段LAEQFVLLNLVYETTDK的串聯(lián)質(zhì)譜圖

2.2 AGR2在結(jié)直腸癌組織與癌旁組織表達(dá)水平的比較 在上述實(shí)驗(yàn)中鑒定出的19個(gè)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的蛋白中選出AGR2做蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。癌組織明顯高于癌旁正常組織。

3 討論

結(jié)直腸癌作為我國常見腫瘤之一，發(fā)病率逐年增加。其預(yù)后及存活率與疾病診斷的階段密切相關(guān)。對(duì)于早期診斷的結(jié)直腸癌患者，其五年生存率高達(dá)82.9%[4]，而晚期診斷的五年生存率則只有50%。為了提高患者的生存率，探索可用于早期診斷和判斷復(fù)發(fā)的方法意義深遠(yuǎn)。

圖3 AGR2在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

近期的研究顯示，AGR家族有三種亞基：AGR1,AGR2和AGR3。AGR2也叫做hAG-2或Gob-4，可編碼長度為17kDa的分泌性蛋白，是人類與非洲爪蟾蜍蛋白(xenopus laevis pritein，XAG-2)的直系同源基因。蟾蜍胚胎中的XAG-2誘導(dǎo)了黏液腺的分化[5,6]，雖然AGR2 在人體內(nèi)的功能尚不清楚，有研究顯示AGR2 可以誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移和腫瘤的增殖。通過抑制P53促進(jìn)細(xì)胞的存活。增強(qiáng)了細(xì)胞的黏附和遷移能力。AGR2在一些生物學(xué)通路包括遷移和轉(zhuǎn)移中有著重要的生物學(xué)功能[7,8]。AGR2在多種人類腫瘤中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與轉(zhuǎn)移表型及不良預(yù)后相關(guān)[9,10]。AGR2在氨基酸序列同源性的基礎(chǔ)上被認(rèn)為是二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)家族的一員,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種分泌蛋白[10]，同時(shí)也存在于細(xì)胞核和細(xì)胞表面。在正常組織中，AGR2高表達(dá)于肺、氣管、胃腸道以及包含粘蛋白分泌細(xì)胞或具有分泌功能的組織中[7]。AGR2既高表達(dá)于膀胱尿道上皮，又高表達(dá)于氣管；AGR2高表達(dá)于肺癌但并沒有高表達(dá)于尿路上皮癌。在前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌中，AGR2的表達(dá)隨腫瘤的分期而降低。有研究表明，AGR2可以通過促進(jìn)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞表面的受體表達(dá)來調(diào)控表皮生長因子受體(EGFR)通路。在正常的胰腺組織中并沒有發(fā)現(xiàn)AGR2的表達(dá)，但在早期胰腺炎中卻因?yàn)镋GFR信號(hào)通路的開啟，誘導(dǎo)了AGR2在細(xì)胞表面的出現(xiàn)。EGFR的高表達(dá)增強(qiáng)了下游信號(hào)的傳導(dǎo)；突變型EGFR受體能夠持續(xù)活化EGFR；自分泌環(huán)的原有功能加強(qiáng)等。在惡性腫瘤中EGFR的過表達(dá)占有重要的位置，多種惡性腫瘤組織中都有EGFR的過表達(dá)。AGR2同時(shí)具有促進(jìn)兩棲動(dòng)物和魚組織的再生功能。AGR2作為細(xì)胞增殖、遷移的刺激因子為人們所熟悉，與化療耐藥性、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)。分泌性AGR2與乳腺癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。并可以作為前列腺癌的腫瘤標(biāo)志物。由上述趨勢(shì)，我們推測(cè)AGR2的表達(dá)量與腫瘤的類型相關(guān)，并且在不同類型的腫瘤中AGR2扮演的角色可能也不同[11]。AGR2可作為合適的候選基因用以探索循環(huán)腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而探索其與不同腫瘤之間的關(guān)系。盡管大量研究顯示AGR2的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床參數(shù)相關(guān)，但AGR2在癌癥進(jìn)展中所扮演的具體角色并不清楚。

本研究通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出的結(jié)直腸癌相關(guān)蛋白AGR2，并對(duì)其在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況通過免疫印跡的方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AGR2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯增高，提示AGR2可能是結(jié)直腸癌新的生物標(biāo)志物。

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Expression Significance of AGR2 in Colorectal Cancer

MENGGuan-nan,YANGZhao-wei，YANGSu-li，etal.

(OncologyDepartment,TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective Detect the expression of Anterior Gradient-2 in colorectal cancer and its clinical significance,to define new biomarkers of colorectal cancer.Methods colorectal cancer tissues and pericarcinous tissues were analyzed with liquid chromatography/mass spectrometry,Protein expression were verified by western-blot.Results The number of mitochondrial proteins detected from colorectal cancer tissues and pericarcinous tissues is 39 and 19 were overxpressed.Conclusion AGR2 is overexpressed in colorectal cancer tissues and is the potential biomarker of colorectal cancer.

Colorectal Cancer;Anterior Gradient-2;LC-MS

國家自然基金資助項(xiàng)目(81572082)；吉林省科技發(fā)展項(xiàng)目(20150101153jc,20140311092YY，20150101153，20150414015)

1007-4287(2017)03-0389-03

R735.3+5 R735.3+7

A

2016-12-19)

*通訊作者