hsa-miR-381過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和表達(dá)

周蘇娜，葉文廣，崔耀友，梁軍#，張明鑫*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院放療科，西安 710061；2第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所；3第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科；*通訊作者，E-mail:zmx3115@163.com；#共同通訊作者，E-mail:liangjtangdu@163.com)

hsa-miR-381過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和表達(dá)

周蘇娜1,2，葉文廣2，崔耀友1，梁軍1#，張明鑫2*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院放療科，西安 710061；2第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所；3第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科；*通訊作者，E-mail:zmx3115@163.com；#共同通訊作者，E-mail:liangjtangdu@163.com)

目的 構(gòu)建hsa-miR-381過表達(dá)慢病毒載體病毒載體，并對其在食管鱗癌TE10細(xì)胞中miR-381表達(dá)調(diào)節(jié)效果進(jìn)行鑒定。 方法 利用PCR法擴(kuò)增miR-381基因序列，將目的基因miR-381克隆到攜帶Green&Puro的慢病毒載體LV3中，經(jīng)雙酶切及測序鑒定后大量抽提；利用脂質(zhì)體將含目的基因的重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；用得到的慢病毒轉(zhuǎn)染TE10細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染狀況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)染前后miR-381的表達(dá)。 結(jié)果 酶切與測序結(jié)果證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，并成功包裝成慢病毒，實(shí)驗(yàn)組病毒滴度為2×108TU/ml，空白陰性對照組病毒滴度為2×108TU/ml。TE10細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒后miR-381的表達(dá)升高，TE10-381組has-miR-381的表達(dá)豐度是TE10組的456.05倍。 結(jié)論 LV3-hsa-miR-381慢病毒載體構(gòu)建成功，并能明顯增加TE10細(xì)胞中miR-381的表達(dá)量。

miR-381； 慢病毒載體； 食管鱗癌； 基因轉(zhuǎn)染

食管癌的發(fā)病率和致死率在常見腫瘤中分別占第八和第六位，其中食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)在東亞地區(qū)占主要地位，約50%的ESCC病例發(fā)生在中國[1]。研究發(fā)現(xiàn)microRNAs(miRNAs)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-381在多種腫瘤中如肝癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌基因的功能，可以通過抑制肝受體同系物-1(liver receptor homolog 1，LRH-1)、轉(zhuǎn)錄因子Yin Yang 1(YY1)、Twist家族堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(Twist1)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等抗腫瘤的作用[3-6]。研究miR-381在ESCC中的表達(dá)和作用，有助于對ESCC的深入了解，為其檢測、治療、預(yù)防等提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建has-miR-381過表達(dá)慢病毒載體(LV3-hsa-miR-381)，通過熒光顯微鏡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)驗(yàn)測TE-10細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，為研究miR-381在ESCC中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

食管鱗癌細(xì)胞株TE10、人胚腎上皮細(xì)胞株293T購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 載體和主要試劑

混合包裝載體質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)和慢病毒載體pGLV3/H1/GFP+Puro載體(LV3)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；大腸桿菌菌株DH5α為西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM、胎牛血清、胰酶Trypsin-EDTA Solution和鏈霉素(10 000 μg/ml)/青霉素(10 000 U/ml)購自美國GIBCO公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自日本Takara公司；BamHⅠ、EcoRⅠ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Marker購自加拿大Fermentas公司；瓊脂糖、DNA凝膠回收試劑盒、Taq聚合酶購自北京天根生化科技有限公司；PrimeScript RT試劑盒、SYBR酶購自美國ABI公司；Lipofectamine 2000、Trizol購自美國Invitrogen公司；LB培養(yǎng)基購自美國ATCC公司。

1.3 細(xì)胞分組

根據(jù)后期實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染情況，分為TE10組(空白TE10細(xì)胞)、TE10-NC組(轉(zhuǎn)染陰性LV3-NC病毒)、TE10-381組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)LV3-hsa-miR-381病毒)。

1.4 hsa-miR-381的基因擴(kuò)增

根據(jù)GeneBank提供的hsa-miR-381基因組序列的信息數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)has-mir-381上游引物：GCGAGGTTGCCCTTTGTA；hsa-miR-381下游引物：CACTTCCTCAGCACTTGTTGGTAT。目的基因上下游引物分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ及保護(hù)堿基，用于慢病毒載體的亞克隆。引物由上海吉瑪基因技術(shù)有限公司合成，按照PCR試劑盒操作說明提取TE10細(xì)胞miR-381的互補(bǔ)DNA(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)、以得到的cDNA為模板進(jìn)行目的基因的大量擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 30 s、62 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠回收基因片段。

1.5 LV3-hsa-miR-381重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定

將擴(kuò)增的has-miR-381基因片段及載體質(zhì)粒LV3在37 ℃下用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切2 h，酶切完成后按照凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。二者在T4連接酶的作用下，16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，將抽提好的質(zhì)粒用BamHⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切并鑒定。取測序正確后的克隆，搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用除內(nèi)毒素大提試劑盒大量抽提陽性重組質(zhì)粒。

1.6 慢病毒的包裝

在轉(zhuǎn)染前24 h，取在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%-90%融合時(shí)的293T細(xì)胞，接種至15 cm培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染前2 h將培養(yǎng)基更換為無血清的新鮮培養(yǎng)基。利用脂質(zhì)體將含目的基因的重組質(zhì)粒(LV3-hsa-miR-381)和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組慢病毒)，同時(shí)利用脂質(zhì)體將不含目的基因的質(zhì)粒(LV3-NC)和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(構(gòu)建陰性對照組慢病毒)，在在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育4-6 h，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。包裝后產(chǎn)生過表達(dá)hsa-miR-381的慢病毒(LV3-hsa-miR-381)和空白陰性對照慢病毒(LV3-NC)。

1.7 慢病毒的收獲、濃縮

將上述培養(yǎng)72 h的293T細(xì)胞上清液收集到50 ml離心管中，于4 ℃，4 000 r/min離心4 min；將離心管上清液倒入50 ml 注射器內(nèi)，用0.45 um過濾器過濾。濾液于4 ℃，20 000 r/min離心2 h。將濃縮液收集分裝，-80 ℃保存。

1.8 慢病毒滴度的測定

用培養(yǎng)基將指數(shù)生長期的239T細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按3×104個(gè)/孔接種至96孔板中，混勻后于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。將慢病毒原液10 μl，用10% FBS的DMEM 培液10倍稀釋4個(gè)梯度。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μl稀釋的病毒液，同時(shí)設(shè)立空白對照組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入100 μl 10% FBS的DMEM培液，于37 ℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。通過熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度，計(jì)算病毒滴度(病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量)，病毒LV3-hsa-miR-381b和LV3-NC的滴度分別為2×108TU/ml和2×108TU/ml。

1.9 慢病毒轉(zhuǎn)染ESCC TE10細(xì)胞

將對數(shù)生長期的TE10細(xì)胞，按1×106個(gè)/孔接種至6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長至密度約為40%時(shí)侵染病毒。將侵染TE10細(xì)胞的慢病毒原液用10% FBS的1640培養(yǎng)液按梯度1 ∶10稀釋3個(gè)梯度，加入終濃度為5 μg/ml的聚凝膠以增加轉(zhuǎn)染率。吸去6孔板中的原培養(yǎng)液，加入上述稀釋的病毒液，同時(shí)設(shè)立空白對照組。培養(yǎng)24 h更換成正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)并拍照。

1.10 實(shí)時(shí)qPCR檢測TE10細(xì)胞miR-381的表達(dá)水平

嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR檢測轉(zhuǎn)染后的TE10組、TE10-NC組和TE10-381組細(xì)胞中miR-381的表達(dá)水平。細(xì)胞中加入1 ml Trizol，按說明提取細(xì)胞總RNA并測定其純度和濃度。按照PrimeScript RT試劑盒的操作說明，以RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在SYBR酶的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)時(shí)qPCR循環(huán)95 ℃變性3 min，95 ℃ 30 s、62 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-381的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

凝膠電泳分析顯示：PCR擴(kuò)增的特異性條帶在113 bp左右，與Genebank發(fā)布的結(jié)果相符(見圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒LV3-hsa-miR-381的鑒定

挑取1個(gè)陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增和抽提質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoR Ⅰ對陽性克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳后得到的陽性克隆條帶見圖2。表明質(zhì)粒所在8 000 bp大小的為陽性重組質(zhì)粒LV3-hsa-miR-381。

1-4.PCR產(chǎn)物；5.空白對照；6.Marker圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析hsa-miR-381的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 1 Analysis of PCR-amplified products of hsa-miR-381 by agarose gel electrophoresis

1.pGLV3/H1/GFP+Puro質(zhì)粒(LV3)；2.LV3-hsa-miR-381重組質(zhì)粒Bam HⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切；3.Fermentas SM0331GeneRuler DNA Ladder Mix圖2 重組質(zhì)粒LV3-hsa-miR-381電泳后得到的陽性克隆條帶鑒定結(jié)果Figure 2 Identification of the positive clones of recombinant plasmid LV3-hsa-miR-381 after electrophoresis

2.3 DNA測序鑒定

過表達(dá)載體LV3-hsa-miR-381陽性克隆測序結(jié)果見圖3,4，通過Blast證實(shí)其基因序列與miR-381序列匹配，表明miR-381的基因正確地插入到了載體LV3中。

紅字斜體顯示為插入的has-miR-381前體序列圖3 LV3-hsa-miR-381過表達(dá)載體陽性克隆測序結(jié)果Figure 3 The sequencing of LV3-hsa-miR-381-overexpressed vector

測序波峰圖顯示has-miR-381前體序列正確插入質(zhì)粒圖4 LV3-hsa-miR-381過表達(dá)載體陽性克隆測序波峰圖Figure 4 DNA sequencing of LV3-hsa-miR-381-overexpressed vector

2.4 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

TE10-381組感染過表達(dá)LV3-hsa-mir-381病毒，TE10-NC組感染空白陰性對照慢病毒LV3-NC，病毒感染96 h后進(jìn)行熒光拍照。各組細(xì)胞熒光拍照結(jié)果見圖5，可見病毒感染成功。

圖5 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后熒光蛋白表達(dá)情況 (×100)Figure 5 Expression of green fluorescent protein in stable transgenic cell line after transfection (×100)

2.5 PCR 驗(yàn)證TE10細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LV3-hsa-miR-381過表達(dá)病毒效率的結(jié)果

以U6為內(nèi)參，TE10組為基準(zhǔn)，校正計(jì)算各組2-ΔΔCt值。TE10組為1.00±0.47，TE10-NC組為2.95±1.26，TE10-381組為456.05±96.64。上述結(jié)果顯示TE10-381組細(xì)胞與TE10組、TE10-NC組細(xì)胞相比，miR-381的含量明顯升高，TE10-381組has-miR-381的表達(dá)豐度是TE10組的456.05倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖6)。

與其他兩組比較，*P<0.05圖6 實(shí)時(shí)qPCR檢測各組細(xì)胞中miR-381表達(dá)結(jié)果Figure 6 qRT-PCR expression of miR-381 in cells by real-time qPCR

3 討論

miRNA作為一類非編碼單鏈小分子RNA，參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)行為相關(guān)的基因表達(dá)，且研究證實(shí)許多miRNA與腫瘤的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為及腫瘤耐藥相關(guān)[7]。近年來關(guān)于miRNA的功能研究越來越多。隨著miRNA研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)miR-381在腫瘤和正常組織中呈差異性表達(dá)，且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。miR-381在肺腺癌中表達(dá)下調(diào)，靶向調(diào)控分化抑制蛋白1(inhibitor of differentiation 1,ID1)影響細(xì)胞遷移和侵襲[8]。結(jié)腸癌組織中miR-381的表達(dá)明顯下降，其發(fā)揮抑癌基因的功能，調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲、遷移及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)能力[4,6,9]。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)miR-381的表達(dá)下調(diào)和食管鱗癌細(xì)胞株的惡性表型如增殖、侵襲能力增加，放療抵抗增加相關(guān)[10]。正是由于miR-381在消化道組織中的表達(dá)特異性，提示miR-381在食管癌的發(fā)展過程中發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

常用的慢病毒載體是在人類免疫缺陷病毒1型基礎(chǔ)上修飾改造而得到的一種多用途、安全的轉(zhuǎn)基因載體[11]。慢病毒可以高效地感染內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，將需要的目的基因重組到慢病毒載體，然后通過重組載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞的持久表達(dá)。相對于非病毒載體，病毒載體具有如下優(yōu)勢[12]：①慢病毒載體可轉(zhuǎn)染有絲分裂期包括分裂終末期的細(xì)胞；②維持目的基因在靶細(xì)胞中長期而穩(wěn)定的表達(dá)；③實(shí)現(xiàn)從時(shí)間性、空間性的精確調(diào)控目的基因的表達(dá)；④實(shí)現(xiàn)功能相關(guān)的數(shù)個(gè)基金的共表達(dá)；⑤免疫反應(yīng)小，安全性高。

為進(jìn)一步闡明mir-381在調(diào)控食管癌的發(fā)生與發(fā)展中的可能分子機(jī)制，本研究選擇應(yīng)用重組慢病毒載體技術(shù)構(gòu)建了能夠穩(wěn)定而持久過表達(dá)外源mir-381的重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增測序，顯示其基因序列與miR-381序列匹配，說明miR-381的基因正確地插入到了載體中；重組過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染食管鱗癌TE10細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達(dá)情況，看到重組的過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒能夠高效的感染目的細(xì)胞；通過實(shí)時(shí)qPCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的TE10細(xì)胞中miR-381的表達(dá)顯著升高，為研究miR-381對ESCC發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)信號通路以及生物學(xué)功能的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Global cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[2] Nana-Sinkam SP,Croce CM.Clinical applications for microRNAs in cancer[J].Clin Pharmacol Ther,2013,93(1):98-104.

[3] Zhang Q,Zhao S,Pang X,etal.MicroRNA-381 suppresses cell growth and invasion by targeting the liver receptor homolog-1 in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep,2016,35(3):1831-1840.

[4] Liang Y,Zhao Q,Fan L,etal.Down-regulation of MicroRNA-381 promotes cell proliferation and invasion in colon cancer through up-regulation of LRH-1[J].Biomed Pharmacother,2015,75:137-141.

[5] Xia B,Li H,Yang S,etal.MiR-381 inhibits epithelial ovarian cancer malignancy via YY1 suppression[J].Tumour Biol,2016,37(7):9157-9167.

[6] He X,Wei Y,Wang Y,etal.MiR-381 functions as a tumor suppressor in colorectal cancer by targeting Twist1[J].Onco Targets Ther,2016,9:1231-1239.

[7] Wang XC,Zhang ZB,Wang YY,etal.Increased miRNA-22 expression sensitizes esophageal squamous cell carcinoma to irradiation[J].J Radiat Res,2013,54(3):401-408.

[8] Rothschild SI,Tschan MP,Jaggi R,etal.MicroRNA-381 represses ID1 and is deregulated in lung adenocarcinoma[J].J Thorac Oncol,2012,7(7):1069-1077.

[9] 尹慧,王偉,張強(qiáng),等.MicroRNA-381的表達(dá)下降促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖與侵襲[J].西南國防醫(yī)藥,2016,26(7):697-700.

[10] Zhou S,Ye W,Ren J,etal.MicroRNA-381 increases radiosensitivity in esophageal squamous cell carcinoma[J].Am J Cancer Res,2015,5(1):267-277.

[11] Zufferey R,Dull T,Mandel RJ,etal.Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficientinvivogene delivery[J].J Viral,1998,72(12):9873-9880.

[12] Mátrai J,Chuah MK,Vanden Driessche T.Recent advances in lentiviral vector development and applications[J].Mol Ther,2010,18(3):477-490.

Construction,transfection and expression of hsa-miR-381 over-expressed lentivirus vector

ZHOU Suna1,2,YE Wenguang2,CUI Yaoyou1,LIANG Jun1#,ZHANG Mingxin2*

(1DepartmentofRadiotherapy,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710061,China；2TumorInstitute,FourthMilitaryMedicalUniversity；3DepartmentofGastroenterology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:zmx3115@163.com;#Co-correspondingauthor,E-mail:liangjtangdu@163.com)

ObjectiveTo construct hsa-miR-381-over-expressed lentivirus vector,and to investigate the regulation effect of miR-381 in esophageal squamous cell carcinoma TE10 cells after transfection.MethodsThe miR-381 sequence was obtained by PCR amplification,and then inserted into the lentiviral vector LV3 with Green&Puro.The miR-381 sequence was confirmed by double-enzyme cleavage and DNA sequencing and extracted.The recombinant lentivirus plasmid and packaging plasmid pGag/Pol,pRev,and pVSV-G were co-transfected into 293T cells by liposomes.The viral yielded by 293T cell was transfected into TE10 cells.The status of transfection was observed by fluorescence microscope,and the expression of miR-381 was detected by real-time quantitative PCR before and after transfection.ResultsRestriction enzyme digestion and sequencing results showed that recombinant plasmid was successfully constructed and packaged to lentivirus.The miR-381 sequence was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing,and successfully inserted into the vector.The viral titer was 2×108TU/ml.After transfection,the expression of miR-381 was significantly up-regulated in TE10 cells,and the expression abundance of hsa-miR-381 in TE10-381 increased by 456.05 times.ConclusionThe LV3-has-miR-381 lentiviral vector is successfully constructed,and it could significantly increase the miR-381 expression in TE10 cell.

miR-381； lentivirus vector； esophageal squamous cell carcinoma； gene transfection

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81301922)

周蘇娜，女，1983-09生，博士，主治醫(yī)師,E-mail：annyzhou0913@163.com

2016-12-08

Q78

A

1007-6611(2017)03-0241-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.009