西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞PDX-1 mRNA表達(dá)的影響

鄭坤杰，武 革，耿建林，吳美芬，方 爍

(1河北省衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科，衡水 053000；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；*通訊作者，E-mail：wuge427427@126.com)

西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞PDX-1 mRNA表達(dá)的影響

鄭坤杰1，武 革2*，耿建林1，吳美芬2，方 爍2

(1河北省衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科，衡水 053000；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；*通訊作者，E-mail：wuge427427@126.com)

目的 觀察西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠糖脂代謝及胰島β細(xì)胞胰腺十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)mRNA表達(dá)水平的影響。 方法 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組及西格列汀組。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病模型組與西格列汀組給予高脂飼料喂養(yǎng)，于第8周末以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)30 mg/kg腹腔注射，成模后西格列汀組給予西格列汀100 mg/kg灌胃，每日1次，共持續(xù)4周。其余兩組予等量的生理鹽水灌胃。HE染色觀察胰島細(xì)胞組織學(xué)改變，以實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)大鼠胰腺胰島細(xì)胞PDX-1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，治療前模型組及西格列汀組空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)增高，胰島素敏感指數(shù)(ISI)、PDX-1 mRNA的表達(dá)量明顯減低(P<0.01)。與治療前比較，西格列汀治療后2型糖尿病大鼠FBG、FINS、TG、TC下降(P<0.01)，ISI明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，西格列汀組胰腺PDX-1 mRNA的表達(dá)量可明顯增高(P<0.01)。 結(jié)論 西格列汀可上調(diào)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞PDX-1基因的表達(dá)。

西格列??； 糖尿??； 胰島β細(xì)胞； 胰腺十二指腸同源盒-1； 大鼠

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種腸肽類激素，其作用的多效性在糖尿病治療領(lǐng)域已顯示了廣闊應(yīng)用前景。西格列汀是二肽基肽酶-4(dipeptidylpeptidase-4,DPP-4)抑制劑，主要通過(guò)選擇性抑制DDP-4的活性，從而延長(zhǎng)GLP-1的作用。GLP-1增加β細(xì)胞數(shù)量的作用被視為其重要的β細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，有研究顯示，GLP-1的這一作用是依賴于PDX-1基因的正常表達(dá)。PDX-1是β細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與β細(xì)胞胰島素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)β細(xì)胞再生和修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立T2DM大鼠模型，觀察西格列汀對(duì)T2DM大鼠胰腺PDX-1基因表達(dá)水平的影響，探討其對(duì)胰島β細(xì)胞增殖與再生的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周近交系雄性SD大鼠60只(SPF級(jí))，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0008。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，real-time PCR試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，西格列汀購(gòu)自默沙東公司，血糖儀及血糖檢測(cè)試紙條購(gòu)自德國(guó)羅氏公司,PCR儀購(gòu)于德國(guó)Biometra公司。

1.3 動(dòng)物模型的建立

雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、糖尿病模型組、西格列汀組，每組20只。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余兩組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg，正常對(duì)照組注射同等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。實(shí)驗(yàn)組72 h后測(cè)隨機(jī)尾靜脈血糖。以兩次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，然后西格列汀組給予西格列汀100 mg/kg灌胃，每日1次；正常對(duì)照組和模型組則給予相同體積生理鹽水灌胃。

1.4 糖脂代謝指標(biāo)測(cè)定

用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)，ELISA法檢測(cè)血清胰島素(INS)。ISI=Ln[1/FBG·FINS]。

1.5 胰島細(xì)胞組織學(xué)觀察

將固定于10%甲醛中的胰島脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片。將切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，伊紅染色，蘇木精復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片。光鏡下觀察，進(jìn)行病理學(xué)分析。

1.6 Real-Time RT-PCR法檢測(cè)胰腺組織PDX-1 mRNA

Trizol一步法提取總RNA。取2 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，62 ℃ 30 s收集熒光信號(hào))；融解曲線分析：溫度60-95 ℃。PDX-1 mRNA的引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，上游引物：5′-GCGAGATGCTGGCAGACC TCT-3′，下游引物：5′-GGCAGACCTGGCGGTTCACAT-3′,片段長(zhǎng)度94 bp;以18sRNA為內(nèi)參，上游引物：5′-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3′，下游引物：5′-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3′，片段長(zhǎng)度108 bp;PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，62 ℃ 30 s收集熒光信號(hào)；融解曲線分析：溫度60-95 ℃。DNA擴(kuò)增儀自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。定量資料組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)比較采用onewayANOVA分析及q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖、血脂及相關(guān)指標(biāo)情況

與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組及西格列汀組FBG、FINS、TG、TC明顯升高(P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.01)。西格列汀組治療后與治療前及糖尿病模型組比較，F(xiàn)BG、FINS、TG、TC明顯降低(P<0.01)，ISI明顯升高(P<0.01)；而模型組FBG、FINS、TG、TC較治療前明顯升高(P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.01，見(jiàn)表1，2)。

組別nFBG(mmol/l)FINS(mU/L)ISI治療前治療后治療前治療后治療前治療后正常對(duì)照組205．13±0．645．32±0．79 15．14±1．3515．40±1．22 -4．34±0．21-4．39±0．23 模型組2014．17±0．72?16．81±2．05?△30．06±1．50?30．59±1．64?-6．04±0．09?-6．21±0．16?西格列汀組2014．40±0．94?8．99±1．61?#△30．14±1．48?27．55±1．25?#△-6．07±0．09?-5．60±0．22?#△ F197．24861．316310．906285．950477．007175．017 P0．0000．0000．0000．0000．0000．000

與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與治療前比較,△P<0.05

組別nTGTC治療前治療后治療前治療后正常對(duì)照組200．79±0．080．82±0．101．45±0．251．53±0．20模型組201．73±0．11?2．02±0．22?1．97±0．24?2．41±0．29?西格列汀組201．76±0．12?1．24±0．22?#△202±035?166±037?#△ F23045787447999013967 P0000000000010000

與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與治療前比較,△P<0.05

2.2 西格列汀對(duì)大鼠胰腺組織的影響

正常對(duì)照組大鼠胰腺組織HE染色，胰島呈圓形或卵圓形，分布均勻、形狀規(guī)則、界限清楚，胰島細(xì)胞數(shù)量多。模型組胰島體積變小，分布彌散，部分胰島排列、形狀不規(guī)則，結(jié)構(gòu)不清，胰島細(xì)胞數(shù)量減少，部分可見(jiàn)細(xì)胞核固縮。西格列汀組胰島形狀偶可見(jiàn)不規(guī)則，界限稍模糊，胰島細(xì)胞數(shù)量較模型組增多(見(jiàn)圖1)。

A.正常對(duì)照組 B.模型組 C.西格列汀組圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色 (×200)Figure 1 HE dying of pancreatic tissues in three groups (×200)

2.3 大鼠胰腺組織PDX-1 mRNA的表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，模型組和西格列汀組PDX-1 mRNA的表達(dá)量均降低(P<0.01)，西格列汀組治療后PDX-1 mRNA的表達(dá)量明顯增高,與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

組別nPDX?1mRNA正常對(duì)照組204．23±0．24模型組201．00±0．05?西格列汀組202．88±0．13?#

經(jīng)one-way ANOVA分析,F=1 069.57,P=0.000;與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3 討論

人類PDX-1在出生及成年后呈特異性表達(dá)于90%的β細(xì)胞和少量的(10%)δ細(xì)胞。近年來(lái)，由于PDX-1基因在胰島素分泌過(guò)程中不可缺少，PDX-1在胰腺發(fā)育、分化、再生及胰島素分泌過(guò)程中的作用受到關(guān)注[1-3]。因此，越來(lái)越多的研究致力于利用PDX-1在β細(xì)胞分化發(fā)育中的關(guān)鍵作用，將胚胎干細(xì)胞、成體肝細(xì)胞或胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞等非胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為具有分泌胰島素功能的細(xì)胞[4]。Lee等[5]用編碼小鼠PDX-1基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染人類脂肪組織源性干細(xì)胞(human adipose tissue-derived stem cells,hASCs)，并將hASCs在高糖環(huán)境下分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)外源性的PDX-1能明顯增加胰島素基因的轉(zhuǎn)錄以及胰腺發(fā)育所必需的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子如FoxA2、NKx2.2和NeuroD的表達(dá)。但長(zhǎng)期高血糖、脂代謝紊亂可以損傷PDX-1基因,使PDX-l表達(dá)下調(diào),使胰島素的分泌減少，導(dǎo)致β細(xì)胞功能逐漸衰退,進(jìn)而加重了糖脂代謝紊亂。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到,T2DM模型組大鼠FBG、TG、TC較正常對(duì)照組明顯增高，PDX-1 mRNA表達(dá)下降，胰島β細(xì)胞數(shù)量減少，表明糖脂毒性對(duì)T2DM大鼠胰島β細(xì)胞具有損傷作用，導(dǎo)致胰島細(xì)胞數(shù)量減少，而T2DM大鼠胰腺PDX-1表達(dá)的減少，可能正是T2DM大鼠胰島β細(xì)胞功能減弱的重要原因。

已有研究表明，DPP-4抑制劑西格列汀可以通過(guò)提高GLP-1水平，降低胰高血糖素，降低肝臟及腸道內(nèi)載TG脂蛋白的水平來(lái)影響TG水平以及改善血糖[6，7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，西格列汀組使用西格列汀干預(yù)后其血糖明顯下降，其大鼠胰島細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，且胰腺胰島β細(xì)胞PDX-1 mRNA的表達(dá)增多。上述結(jié)果表明西格列汀對(duì)胰島胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其上調(diào)PDX-1有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確，有研究顯示，GLP-1類似物Exendin-4誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞和胰島細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上類似，在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入Exendin-4，PDX-1及胰島素基因的表達(dá)明顯增多，胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的比例增加了4倍，胰島素分泌量亦增加了2.5倍。說(shuō)明Exendin-4可通過(guò)增加PDX-1基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)化[8]。Pugazhenthi等[9]發(fā)現(xiàn)DDP-4抑制劑阿格列汀可明顯增加2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞胰島素和PDX-1水平，且β細(xì)胞存活率亦明顯增加。上述研究均證明了西格列汀可直接或間接調(diào)控PDX-1基因的表達(dá)，從而增加INS基因的轉(zhuǎn)錄，降低血糖。研究還發(fā)現(xiàn)，DPP-4抑制劑可增加β細(xì)胞分化和增殖，增強(qiáng)胰島體系結(jié)構(gòu)重塑并保持胰島功能[10]。本研究表明，西格列汀對(duì)糖脂代謝紊亂起著正向作用，并可增加胰島β細(xì)胞PDX-1 mRNA的表達(dá)，并一定程度地改善胰島β細(xì)胞功能。

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Effect of sitagliptin on the expression of PDX-1 mRNA in islet beta cells of type 2 diabetes rats

ZHENG Kunjie1,WU Ge2*,GENG Jianlin1,WU Meifen2,FANG Shuo2

(1DepartmentofEndocrinology,HarrisonInternationalPeaceHospitalofHengshuiCity,Hengshui053000，China；2DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:wuge427427@126.com)

ObjectiveTo explore the influence of sitagliptin on the glucose and lipid metabolism and the expression level of pancreatic duodenal homeobox-1(PDX-1)mRNA in type 2 diabetes rats.MethodsSixty SD rats were randomly divided into normal control group,T2DM group and sitagliptin group.The rats were given normal diet in normal control group.The rats were given high fat diet in T2DM group and sitagliptin group,and the rats were intraperitoneally injected with streptozotocin(STZ)30 mg/kg at the end of 8 weeks. The rats in sitagliptin group were treated with daily intragastric sitagliptin(100 mg/kg)for 4 weeks after the modeling.Hematoxylin and Eosin staining was used to observe the histological changes of islet cells.Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(real-time RT-PCR)was used to detect the expression of PDX-1 mRNA in pancreatic islet cells.ResultsBefore treatment,the levels of FBG,FINS,TG and TC in sitagliptin group and T2DM group were significantly higher than in normal control group(P<0.01),while the level of ISI and the expression of PDX-1 mRNA were significantly lower.After treatment,the levels of FBG,FINS,TG,TC in sitagliptin group were decreased(P<0.01)，while the level of ISI was significantly increased(P<0.01).The expression of PDX-1 mRNA in sitagliptin group was significantly higher than in T2DM group(P<0.01).ConclusionSitagliptin can upregulate the expression of PDX-1 mRNA.

sitagliptin； diabetes mellitus； islet beta cells； PDX-1； rats

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011B031800231)

鄭坤杰，女，1986-02生，碩士，住院醫(yī)師，E-mail:w820lxy@sohu.com

2016-10-26

R587.1

A

1007-6611(2017)03-0231-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.007