背景因素、適應時間及物體位置對小鼠新事物識別的影響

廖 雁，南 方，郭寶璐，梁月琴，范彥英

(山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室,太原 030001;*通訊作者,E-mail:fyanying6@hotmail.com)

背景因素、適應時間及物體位置對小鼠新事物識別的影響

廖 雁，南 方，郭寶璐，梁月琴，范彥英*

(山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室,太原 030001;*通訊作者,E-mail:fyanying6@hotmail.com)

目的 觀察不同背景因素、適應時間及物體位置對小鼠新事物識別(NOR)的影響,評價小鼠學習記憶能力。 方法 50只8-12周的雄性昆明小鼠,隨機分為4組,用于4個測驗。盒子背景(黑盒、白盒)的測試(10只),空盒適應次數(1次、2次和3次)測試(15只),物體放置位置(角落、半角落和中間)測試(15只),不同事物適應次數(1次和2次)測試(10只)。通過視頻跟蹤記錄小鼠在盒子內的活動軌跡,統(tǒng)計其探索新舊事物的時間,計算小鼠對新事物的鑒別指數(DI)來評價各組小鼠的學習記憶情況。 結果 黑盒組小鼠對事物探索的總時間比白盒組明顯更高(P<0.05);小鼠在空盒適應1次和2次對新事物的DI值較舊事物無明顯差別,但適應3次具有明顯差異(P<0.05);三種不同物體放置位置對小鼠探索物體的時間和DI值無顯著影響;事物適應2次組的小鼠探索新物體的時間與1次組相比顯著降低(P<0.05);小鼠對新事物的DI值在3，5，7和10 min測試時間點上無明顯差異。 結論 進行NOR測試時,選擇黑色背景盒子及讓小鼠在空盒適應3次可較好地評價小鼠學習記憶能力,不同物體放置位置對小鼠新事物識別影響較小。另外,選擇事物適應1次和3 min的測試時間即可,其既能保證有較穩(wěn)定的DI值,也能節(jié)省實驗時間。

新事物識別測試； 學習記憶； 小鼠

早在1950年,Berlyne[1]觀察發(fā)現(xiàn)大鼠在同時接受新事物與熟悉事物的刺激時會花更多的時間來探索新事物,Ennaceur等[2]利用大鼠這種先天性行為,并基于其對探索新事物的自然偏愛,設計了新事物識別(novel object recognition,NOR)測試。該測試依據動物對環(huán)境中熟悉的舊物體和陌生的新物體的探索時間長短來評價其記憶功能。實驗動物如果保留了對舊物體的記憶,便會用更多的時間探索新物體;相反,則對兩個物體的探索時間無明顯差異。NOR測試之所以特別受歡迎是因為它不需要外部推動,比如獎勵或處罰,而只需適當的訓練和適應即可,并且它可以在相對較短的時間內完成[3]。而同樣用于測試實驗動物記憶行為的Morris水迷宮實驗,其相比NOR測試過程耗時長,并且對實驗硬件和軟件要求較高[4]。隨著NOR測試逐步被發(fā)展和完善,NOR測試現(xiàn)在廣泛用來通過計算對新事物的偏愛程度從而評價嚙齒類動物的工作記憶、注意力和焦慮等[2,5,6],所以,被常用于檢測腦損傷程度和各種藥物的治療效果[7-9]。NOR測試結果可作為一項評價青少年人群吸毒易感性的指標，并在社會上開始逐漸獲得普及[10]。

以往的研究發(fā)現(xiàn),不同的動物品種、性別、事物(材料和大小)、環(huán)境背景(光線和聲音條件)、設備、實驗設計(適應時間和間隔時間)等都會影響NOR測試的結果[11]。目前缺乏針對小鼠NOR各個具體檢測條件的詳細闡述,影響了該實驗方法的質量控制和規(guī)范化,限制了該方法的推廣應用。本研究觀察了影響NOR測試結果的幾個重要因素,包括空盒背景及適應時間、物體放置位置,事物的適應時間,以確定最佳檢測條件,統(tǒng)計了不同測試時間點的結果來確定最佳的測試時間,以期使該實驗模型能可更好地用于小鼠學習記憶能力的評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康昆明雄性清潔級小鼠50只,年齡8-12周,體重25-35 g,購自于山西醫(yī)科大學實驗動物中心。所有的動物實驗均遵循國家動物飼養(yǎng)和使用指南,動物飼養(yǎng)在溫度(22±1)℃,12 h明暗循環(huán),自由采食和飲水。

1.2 NOR測試

實驗前1 d,先將小鼠放到實驗室,讓其適應環(huán)境1 d,然后進行正式實驗。正式實驗的第一部分為預適應階段,將小鼠放入未放有任何事物的45 cm×33 cm盒子里適應15 min。第二部分包含兩個測試階段(見圖1A)。階段1(T1),在盒子里兩個相對的區(qū)域中放置兩個完全相同的物體(物體1和2),放入小鼠后讓小鼠適應15 min。間隔1 h后,階段2(T2),物體1不變(舊事物),物體2更換為物體3(新事物),隨后再次放入小鼠探索10 min。每只小鼠訓練或測試完成后用酒精擦拭物體和盒子,以消除小鼠停留在上面的氣味,所有實驗項目均在上午9點至下午4點之間進行,測試全過程視頻錄像并保存。記錄小鼠在在物體1探索時間(F)和物體2或3探索時間(N),探索時間從小鼠的鼻子距離事物≤1 cm或者是小鼠直接用鼻子接觸事物開始計時(小鼠爬上物體或者在物體附近走動則不能計入),然后計算小鼠對物體2或3的鑒別指數(discrimination index,DI),計算公式為DI=(N-F)/(N+F)×100%。

圖1 新事物識別測試示意Figure 1 The schematic diagram of novel object recognition test

1.3 實驗方法

根據不同測試參數,分為以下4個實驗,具體各個試驗項目參數見表1。實驗一:取10只小鼠用于測試不同盒子背景對NOR測試結果的影響,按盒子背景顏色分為黑盒和白盒2組,每組5只。實驗二:取15只小鼠用于測試不同空盒子適應時間對NOR測試結果的影響,動物分為3組,每組5只,預適應階段(空盒適應)分別適應1次、2次和3次,每次15 min,每次間隔24 h。實驗三:取15只小鼠用于測試不同物體放置位置對NOR測試結果的影響,動物分為3組,每組5只,對應物體位置分別置于角落、半角落、中間(見圖1B)。實驗四:10只小鼠用于測試不同事物適應次數對NOR測試結果的影響,按事物適應1次和2次分為2組,每組5只,兩組事物適應總時間相同,均為10 min。

表1 新事物識別實驗參數

Table 1 The parameters of novel object recognition test

實驗項目盒背景空盒適應時間事物放置位置事物適應時間T1與T2間隔時間實驗一黑背景，白背景1次(15min) 半角落1次(10min)1h實驗二黑背景1次、2次、3次(每次15min，每次間隔24h) 半角落1次(10min)1h實驗三黑背景3次(每次15min，每次間隔24h) 角落、半角落、中間1次(10min)1h實驗四黑背景3次(每次15min，每次間隔24h) 半角落1次(10min)、2次(每次5min，間隔24h)1h

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同盒子背景對NOR測試結果的影響

在T1階段,不論盒子背景是黑色還是白色,小鼠對兩物體在5 min內探索時間基本相同,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在T2階段,黑盒、白盒組小鼠對兩物體在5 min內探索時間也無顯著差異(P>0.05,見圖2A)。T1階段的兩物體完全相同,對于小鼠來說均為第1次接觸,所以兩組小鼠的DI值均都在-10至10之間,且組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);T2階段,盡管黑盒和白盒組的小鼠對新事物(物體3)的DI值與T1階段相比均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05,見圖2B),但是在T1+T2階段,黑盒組小鼠對事物探索的總時間較白盒組明顯延長(P<0.05,見圖2C)。結果表明,不同盒子背景對NOR測試結果有影響,小鼠在黑盒中較白盒中對事物探索時間延長,對事物更有興趣,但是在空盒適應1次的條件下小鼠仍不能區(qū)別新舊事物,可能是由于空盒適應時間不夠,小鼠在測試階段仍受較大的環(huán)境影響。

2.2 不同空盒子適應次數對NOR測試結果的影響

在T1階段,小鼠在空盒子中適應1次、2次和3次對兩物體在5 min內探索時間及各組間的DI值均無顯著差異(P>0.05);在T2階段,小鼠在空盒子適應1次和2次對兩物體在5 min內探索時間均基本相同,且對新事物的DI值與T1階段相比無顯著差異(均P>0.05),但適應3次的小鼠對新事物的探索時間較舊事物明顯延長,且對新事物的DI值與T1階段相比明顯增加(均P<0.05,見圖3A,B)。另外,在T1階段,不同空盒適應次數組的小鼠對兩物體的探索總時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);T2階段3次組小鼠對兩物體的探索總時間較1次和2次組均顯著延長(均P<0.05, 見圖3C)。結果表明,不同空盒子適應時間對NOR測試結果有影響,如小鼠對空盒環(huán)境更為適應,則小鼠對物體更感興趣并對新物體的辨別能力表現(xiàn)更強,記憶保留效果更好。

2.3 不同物體放置位置對NOR測試結果的影響

在T1階段,不同的物體位置組中小鼠對兩物體在5 min內探索時間及各組間的DI值均無顯著差異(P>0.05);在T2階段,各組小鼠對新事物在5 min內探索時間及DI值均顯著長于舊事物(P<0.05或P<0.01),但各組間對新事物的DI 值無明顯差異(P>0.05,見圖4A,B)。在T1、T2階段,各組間對兩物體探索的總時間均基本相同(見圖4C)。結果表明,不同物體放置位置對NOR測試結果沒有顯著影響。

2.4 不同事物適應次數對NOR測試結果的影響

在T1階段,事物適應1次組和2次組小鼠對兩物體在5 min內探索時間基本相同(P>0.05);在T2階段各組的小鼠對新事物在5 min內探索時間比舊事物均明顯延長且DI值均顯著增加(P<0.05或P<0.01),T2階段各組間對新事物的DI值無明顯差異(P>0.05,見圖5A,B)。T1階段事物適應1次和2次組對兩物體的探索總時間基本相同(P>0.05),但T2階段各組對兩物體的探索總時間1次組較2次組延長(P<0.05,見圖5C)。結果表明,同樣的事物適應時間,若分開2次適應,小鼠雖然能辨別新舊事物,但在T2階段對事物的偏愛程度減弱,對物體的注意力易受事物周圍環(huán)境干擾。

圖2 不同盒子背景對新事物識別(NOR)測試結果的影響Figure 2 Effect of different boxes background on the NOR test in mice

圖3 不同空盒子適應時間對新事物識別(NOR)測試結果的影響 (*P<0.05,**P<0.01)Figure 3 Effect of different environment adaptation times on the NOR test in mice (*P<0.05,**P<0.01)

圖4 不同物體放置位置對新事物識別(NOR)測試結果的影響 (*P<0.05,**P<0.01)Figure 4 Effect of different object position on the NOR test in mice (*P<0.05,**P<0.01)

圖5 不同的舊事物適應次數對新事物識別(NOR)測試結果的影響 (*P<0.05,**P<0.01)Figure 5 Effect of different familiar object adaptation times on the NOR test in mice (*P<0.05,**P<0.01)

2.5 不同測試時間點對NOR測試結果的影響

統(tǒng)計不同時間點的實驗結果,發(fā)現(xiàn)測試3，5，7和10 min時對新事物的DI基本相同(P>0.05,見圖6A)。另外,將10 min測試時間劃分為0-3，3-7和7-10 min不同時間段統(tǒng)計,結果發(fā)現(xiàn)7-10 min組的小鼠對新事物的DI值較0-3 min和3-7 min組略低，但無明顯差異(P>0.05,見圖6B)。結果表明,小鼠在3，5，7，10 min各個時間點對新物體的DI值無明顯差別,都能較好地評價小鼠對新事物的偏愛程度。

A.測試3，5，7，10 min對T2階段物體3的鑒別指數 B.測試0-3，3-7，7-10 min對T2階段物體3的鑒別指數圖6 不同測試時間對新事物識別(NOR)測試結果的影響Figure 6 Effect of different time points in test period on the NOR test in mice

3 討論

本研究觀察到在NOR測試中黑盒可能由于能降低小鼠在盒子中的焦慮,從而增加對事物的注意力,較白盒延長對事物的探索時間;空盒適應3次與適應1次和2次比,小鼠對新事物的識別能力明顯提高;事物放置位置對實驗結果基本無影響;同樣的舊事物適應時間,在測試階段,舊事物適應1次比2次更能保持小鼠對事物的興趣;測試觀察時間選擇3 min 即可,其既能準確反應動物的新事物識別能力,也能有效節(jié)省實驗時間。

最早的NOR測試中,實驗者是用木材制成65 cm×45 cm×65 cm大小的開放盒子[2],在隨著時間的推移,其他材料逐漸被選擇使用,并且各個實驗室所選用的盒子在大小、形狀等特征上各不相同。使用材料現(xiàn)在主要包括有膠合板、丙烯酸,木材和塑料幾種[12,13]。盒子的大小要適應動物的年齡和體重,一般來說32 cm×52 cm×30 cm大小的盒子對應至少50 g的動物,52 cm×52 cm×30 cm大小的盒子對應至少100 g的動物,70 cm×70 cm×30 cm大小的盒子對應至少200 g的動物[14]。綜合考慮上述因素對實驗的影響,本研究均采用大小為45 cm×33 cm×31 cm的塑料盒子。另外盒子背景顏色也各有差異,黑色、白色、灰色均有研究使用[15-17],但不同的背景顏色可能會影響到小鼠探索事物的時間。本研究比較了黑色和白色背景對該模型的影響,發(fā)現(xiàn)動物在黑色背景中對物體興趣更大,或許與動物在黑色環(huán)境中受到的壓力刺激小從而對物體保持了較高的專注而有關。

因各個實驗室條件或習慣不同,關于新事物實驗的研究在各階段所采用的時間和訓練次數有所不同,但尚缺乏相關條件的比較。文獻中采用的環(huán)境適應時間有1 d[18]到連續(xù)2-5 d不等(每天適應5-15 min)[19,20],但不同的環(huán)境適應次數是否影響實驗結果尚不清楚。本研究選擇了不同的空盒適應次數(1次、2次和3次),每次適應15 min,每次間隔24 h。結果發(fā)現(xiàn)小鼠在空盒適應3次對新事物的DI值比1次和2次的都顯著增高,提示增加小鼠空盒適應次數更有利于小鼠新事物識別能力的評價。文獻中關于舊事物熟悉時間也有1-5 d不等[3,12,16],測試階段基本為1次,但是時間上相差較大,最短的3 min[15],最長的達到了15 min[19],事物適應和測試階段間隔時間(inter trial intervals,ITI)一般在1 min-2 h內,動物對新物體具有較高的DI值[2,7]。本研究觀察了在ITI為1 h的前提下,舊事物適應總時間均為10 min,不同的舊事物適應次數(1次和2次)對實驗結果的影響。發(fā)現(xiàn)盡管不同的舊事物適應次數對小鼠探索新物體時間和DI值沒有明顯影響,但與2次相比,舊事物適應1次能使小鼠在T2階段對事物探索保持更多的時間,從而提高實驗結果的穩(wěn)定性和可靠性。此外,我們對比了10 min內多個時間點(3 min、5 min、7 min和10 min)小鼠對新事物的DI值,發(fā)現(xiàn)各時間點之間無明顯差異,提示測試3 min即能有效評價小鼠的新事物識別能力。

此外,盡管事物通常為對稱放置,但物體的放置位置因實驗工作條件不同而有許多的差異[12,15,20,21]。然而,物體放置的位置是否影響NOR測試結果尚不清楚。本研究對比了三種不同物體放置位置對NOR測試結果的影響,包括盒子角落、半角落及中間位置將物體對稱放置,發(fā)現(xiàn)這三種物體放置位置對NOR測試結果沒有顯著影響。

綜上所述,NOR測試結果受多方面因素影響,各個實驗室情況不同所采用的方法也有所細微差別,本研究旨在為新事物識別方法提供參考和借鑒。進行NOR測試時,選擇黑色背景盒子及讓小鼠在空盒適應3次可較好地評價小鼠學習記憶能力,不同物體放置位置對小鼠新事物識別影響較小。另外,選擇事物適應1次和3 min的測試時間即可,其既能保證有較穩(wěn)定的DI值,也能節(jié)省實驗時間

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Influence of background,adaptation time and object position on novel object recognition test in mice

LIAO Yan，NAN Fang，GUO Baolu，LIANG Yueqin，F(xiàn)AN Yanying*

(DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;*Correspondingauthor,E-mail:fyanying6@hotmail.com)

ObjectiveTo investigate the efficacy of novel object recognition(NOR)test in assessment of learning and memory ability in KM mice in different experimental conditions.MethodsFifty male KM mice(8-12 weeks)were randomly divided into 4 groups for four experiments:10 mice were used for background experiment(white or black box),15 mice were used for environment adaptation time experiment(once,twice or three times),15 mice were used for object position experiment(corner,half-corner or centre),and 10 mice were used for familiar object adaptation time experiment(once or twice).The locomotor tracks in the box were recorded.The exploration time for familiar or new object and discrimination index(DI)of new object were analyzed.ResultsThe total exploration time in black box group was significantly longer than in white box group(P<0.05).The DI value of new object and familiar object had no significant difference when mice adapted the enviroment for once or twice,however there was significant difference after three times adaption(P<0.05).The object position experiment showed that different position had no influence on the exploration time and new object DI value.The total exploration time in the group of object adaptation for twice was significantly shorter than that in the group of object adaptation for once(P<0.05).The new object DI value had no significant difference among various time points(3,5,7 and 10 min).ConclusionIn NOR experiment,black box and three-times environment adaptation may be more proper experimental conditions to evaluate novel object recognition ability of mice.The object position and object adaptation times have little influence on the new object DI value.To adapt object for once and observe for 3 min in the test period can not only efficiently evaluate novel object recognition ability of mice,but also save experimental time.

novel object recognition test； learning and memory； mice

國家自然科學基金資助項目(81202520);山西省青年科技研究基金資助項目(2014021038-1)

廖雁，男，1990-06生,在讀碩士，E-mail:liaoyanlgh@outlook.com

2016-12-15

R338

A

1007-6611(2017)03-0215-07

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.004