奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室重構(gòu)和Cx43表達的影響

殷 莎，魏澤卉，張 飛，牛夢珍，王 燕

(山西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，太原 030001；*通訊作者，E-mail：butou1977@163.com)

奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室重構(gòu)和Cx43表達的影響

殷 莎，魏澤卉，張 飛，牛夢珍，王 燕*

(山西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，太原 030001；*通訊作者，E-mail：butou1977@163.com)

目的 觀察奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室重構(gòu)及心肌連接蛋白43(connexin 43,Cx43)表達的影響。 方法 將24只Wistar大鼠隨機分為4組：空白對照組、模型組、奈必洛爾組和阿替洛爾組。除空白對照組，其余三組給予L-NAME(60 mg/kg)制備高血壓模型鼠，藥物治療組同時分別給予奈必洛爾(8 mg/kg)和阿替洛爾(80 mg/kg)。給藥8周，期間每周測定一次收縮壓。實驗結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠，快速分離心臟，免疫組化和Western blot觀察左心室Cx43分布和蛋白表達。 結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠在給予L-NAME 1周后血壓逐漸升高，到給藥第8周時高達(192.36±6.95)mmHg。奈必洛爾組血壓較模型組顯著降低，且明顯較阿替洛爾組低。模型組左心室重構(gòu)，Cx43蛋白表達降低。奈必洛爾抑制左心室重構(gòu)，增加Cx43表達，改善L-NAME致高血壓大鼠Cx43排列紊亂，但阿替洛爾僅增加Cx43表達(P<0.05)，對左心室重構(gòu)無顯著影響。 結(jié)論 奈必洛爾在顯著降壓的同時，可改善L-NAME高血壓大鼠左心室重構(gòu)，增加心肌Cx43表達。

奈必洛爾； 縫隙連接蛋白43； L-硝基精氨酸甲酯； 高血壓

奈必洛爾作為選擇性阻斷β1腎上腺素受體的新型抗高血壓藥物，有著確切的降壓作用和內(nèi)皮保護功能[4]。本課題組前期實驗證實，奈必洛爾在降壓同時，改善自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心室重構(gòu)和Cx43表達異常[5]。但是需要注意的是，不同的高血壓動物模型，其升高血壓及心肌病理改變不同。奈必洛爾是否對其他高血壓動物模型左心室重構(gòu)和Cx43表達改變也具有改善作用呢?

L-NAME是一氧化氮合酶(NOS)抑制劑。L-NAME致大鼠高血壓是基礎(chǔ)研究中常用的高血壓模型。長期慢性L-NAME可導(dǎo)致體內(nèi)一氧化氮(NO)缺乏，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，心肌肥大，心室重構(gòu)及Cx43表達異常。本研究以L-NAME致高血壓大鼠為實驗對象，觀察奈必洛爾對L-NAME致高血壓模型大鼠左心室重構(gòu)和Cx43表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級12周齡Wistar大鼠，雄性，由中國科學(xué)研究院上海實驗動物中心提供，恒溫恒濕飼養(yǎng)。

1.2 藥品與儀器

L-NAME購自Sigma公司，阿替洛爾購自西亞試劑公司，奈比洛爾由德國Menarini公司免費提供，Cx43抗體和HE染色試劑盒購自武漢博士德有限公司。無創(chuàng)血壓計購自成都泰盟科技有限公司。其余試劑均為市售分析純。

1.3 實驗?zāi)Ｐ秃头纸M

第二，不是所有的學(xué)生都能成為大師并進入藝術(shù)史。而且能否進入藝術(shù)史之類的問題，也絕非靠繪畫而詩意棲居的很多學(xué)生輩畫家的遠大理想。面對修煉成佛這樣的主題，他們或許只想成為修行意義上的香客而非佛本身。如同我們不能要求所有的香客都成佛一樣，我們也不能奢望所有的學(xué)生都進入藝術(shù)史。當(dāng)絕大多數(shù)學(xué)生都因為主客觀原因而不能進入藝術(shù)史時，我們應(yīng)該給予他們充分的尊敬，同時主動調(diào)低自己的學(xué)術(shù)評論指數(shù)，矚目并祝福他們以藝術(shù)的名義而享有的和諧生活。

12周齡Wistar大鼠隨機分為4組：空白對照組、模型組[L-NAME 60 mg/(kg·d)]、奈比洛爾組[L-NAME 60 mg/(kg·d)+奈必洛爾8 mg/(kg·d)]、阿替洛爾組[L-NAME 60 mg/(kg·d)+阿替洛爾80 mg/(kg·d)]。連續(xù)灌胃給藥8周，期間所有大鼠每周測定一次收縮壓。試驗結(jié)束，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠，快速分離心臟，取左心室做免疫組織化學(xué)和Western blot實驗。

1.4 大鼠尾動脈壓測量

使用大鼠無創(chuàng)血壓測量儀，調(diào)零預(yù)熱之后采用尾袖套法對清醒的大鼠尾動脈進行收縮壓測量。大鼠尾部插入加壓套，使尾根部緊貼于脈搏傳感器上方，待尾動脈充分充盈，脈搏波穩(wěn)定之后測量3次血壓，取平均值。每周測量一次，選取同一時間段進行測量。

1.5 HE染色和免疫組織化學(xué)染色方法

試驗結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，剪開胸腔，快速分離心臟，冰生理鹽水漂洗。垂直于心臟長軸對稱中點上下切取厚度為2-3 mm橫截面，放入4%多聚甲醛中固定，12-24 h后石蠟包埋，用于HE染色和免疫組化實驗。其余心肌組織放入液氮中，最后保存于-80 ℃冰箱，用于Western blot實驗。

心臟常規(guī)石蠟包埋后，連續(xù)切片，片厚4 μm，多聚賴氨酸貼片。切片按常規(guī)方法脫蠟至水，HE染色觀察左心室重構(gòu)。在免疫組化實驗中，切片脫蠟至水后，0.3%過氧化氫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)抗原，10%山羊血清封閉1 h，加入兔抗大鼠Cx43(1 ∶100)單克隆抗體，4 ℃冰箱過夜，加入羊抗兔二抗，室溫1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。結(jié)果判斷：深棕色黃色顆粒為Cx43表達陽性，細胞核為淡藍色。

1.6 Western blot 方法檢測大鼠心肌組織Cx43蛋白表達水平

取心肌組織標(biāo)本50 mg，置于研缽中在液氮中研磨，按100 mg/ml的比例加入裂解緩沖液，充分研磨后,于4 ℃低溫離心機以13 000×g離心20 min，取上清液測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，用TBST液洗滌印跡膜。放入5%脫脂奶粉封閉液內(nèi)，搖床震動室溫封閉2 h。將封閉后的膜放入雜交盒中，加入兔抗大鼠Cx43，p-CX43 S368一抗，搖床4 ℃過夜。將孵育后的膜放入二抗中，室溫搖床孵育。以GAPDH為內(nèi)參照蛋白。用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠收縮壓影響

與空白對照組相比，模型組血壓持續(xù)性升高，到第8周高達(192.36±6.95)mmHg。奈必洛爾及阿替洛爾均可有效降低血壓，且奈必洛爾組較阿替洛爾組降壓作用更為明顯(P<0.05，見表1)。

2.2 奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室重構(gòu)的影響

空白對照組大鼠的心肌細胞形態(tài)正常，肌纖維排列致密、整齊，無顯著的病理改變。L模型組可見心肌纖維排列雜亂不規(guī)律。奈必洛爾可改善心肌排列紊亂，但阿替洛爾組無明顯改善(見圖1)。模型組心肌橫斷面積(CSA)明顯大于空白對照組和奈必洛爾組(P<0.05，見圖2)。奈必洛爾可顯著降低心肌橫斷面積，但阿替洛爾則無明顯影響。

表1 奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠收縮壓影響 (mmHg)

Table 1 The effect of nebivolol on the systolic blood pressure in the hypertension rats induced by L-NAME (mmHg)

給藥周數(shù)空白對照組模型組奈必洛爾組阿替洛爾組0117．67±9．05126．32±7．23129．13±8．12132．62±6．291120．32±8．69?139．15±8．01136．29±9．12137．31±8．112123．20±10．12148．20±6．18140．36±11．02140．96±9．543124．15±7．37169．41±7．16145．69±10．63?156．31±9．18?4119．85±9．32?171．26±7．33150．96±7．09?#164．32±10．295123．42±8．39?179．16±6．62 155．02±9．15?#169．12±9．166117．5±10．43?186．79±9．12 153．10±8．93?# 170．25±8．97?7126．8±11．62?198．63±7．18155．31±11．02?#180．17±10．69?8128．4±11．45?192．36±6．95152．94±10．59?#176．22±10．29? 與模型組比較，?P<0．05；與阿替洛爾組比較，#P<0．05

A.空白對照組 B.模型組

C.奈必洛爾組 D.阿替洛爾組圖1 奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室重構(gòu)的影響 (HE,×200)Figure 1 The effect of nebivolol on left ventricular remodeling in hypertension rats indeced by L-NAME (HE staining,×200)

與空白對照組比較，△P<0.05;與模型組比較，*P<0.05；與阿替洛爾組比較，#P<0.05圖2 奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室心肌橫斷面積(CSA)的影響Figure 2 Effect of nebivolol on myocardial cross-sectionalarea(CSA)in hypertension rats induced by L-NAME

2.3 奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室Cx43分布和表達的影響

Cx43的陽性表達呈黃色或棕色顆粒?？瞻讓φ战MCx43排列規(guī)整，主要分布于心肌細胞閏盤處(見圖3)。模型組Cx43排列紊亂，并且蛋白表達顯著減少(P<0.05)。奈必洛爾可改善L-NAME致高血壓大鼠Cx43排列紊亂，增加其表達，且較阿替洛爾顯著(P<0.05，見圖4)。

3 討論

本實驗結(jié)果表示，連續(xù)灌胃8周，L-NAME可導(dǎo)致大鼠血壓進行性升高，同時伴隨左心室重構(gòu)和Cx43表達變化。奈必洛爾在顯著降壓的同時，可改善L-NAME致高血壓大鼠心肌上述改變。

A.空白對照組 B.模型組 C.奈必洛爾組 D.阿替洛爾組圖3 奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室Cx43分布和表達的影響 (免疫組化,×200)Figure 3 The effect of nebivolol on distribution and expression of Cx43 in left ventricle of hypertension rats induced by L-NAME (immunohistochemistry,×200)

與空白對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與阿替洛爾組比較，#P<0.05圖4 奈必洛爾對L-NAME致高血壓大鼠左心室Cx43表達的影響Figure 4 The effect of nebivolol on expression of Cx43 in left ventricle of hypertension rats induced by L-NAME

血管內(nèi)皮來源的NO對維持機體血壓平衡具有重要作用。NO缺乏可導(dǎo)致一系列心血管疾病的發(fā)生，如高血壓、動脈粥樣硬化等。長期給予競爭性NOS抑制劑L-NAME可引發(fā)動物的持續(xù)性血壓升高，這主要與血管產(chǎn)生的NO減少有關(guān)[6]。在本研究中利用L-NAME誘發(fā)大鼠持續(xù)性的血壓升高，表明該模型建立是可靠的，是一種理想的高血壓動物模型。奈必洛爾和阿替洛爾均可以顯著降低模型組大鼠血壓，但奈必洛爾的降壓作用更為顯著。這與我們在SHR實驗中觀察到的結(jié)果一致。前期實驗顯示奈必洛爾除了抑制β1受體之外，還可以舒張大鼠不同動脈，并且這種舒張血管作用是NO依賴性的[7]。L-NAME還可通過激動腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)升高血壓[8]。本課題組前期研究表明，奈必洛爾可抑制SHR循環(huán)和局部RAS系統(tǒng)，而阿替洛爾則對RAS系統(tǒng)無顯著影響[9]。結(jié)合本實驗，因此本課題組推測奈比洛爾促進NO釋放,舒張血管,抑制RAS系統(tǒng)可能是奈必洛爾降壓作用較阿替洛爾顯著的原因。

L-NAME抑制NOS活性，減少NO生成，不僅升高血壓，而且促進左心室重構(gòu)。Bunbupha等[10]研究發(fā)現(xiàn)L-NAME 40 mg/kg連續(xù)給藥8周可造成左心室重構(gòu)。這與本實驗研究結(jié)果一致。NO減少血管緊張素Ⅱ分泌，而作為NOS抑制劑，L-NAME可增加AngⅡ生成。這說明在L-NAME致高血壓模型大鼠，心臟局部組織RAS參與左心室重構(gòu)[11]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)奈必洛爾可改善SHR左心室重構(gòu)，這種改善與降低心室AngⅡ有關(guān)[12]。因此有理由推測，奈必洛爾改善L-NAME致高血壓大鼠左心室重構(gòu)與其降低心臟AngⅡ有關(guān)。

已知生理狀態(tài)下Cx43有兩種狀態(tài)：磷酸化與非磷酸化。這兩種狀態(tài)的Cx43共同存在于細胞膜上，而磷酸化Cx43則是完成信息交流的主要狀態(tài)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，心室肌絕大部分Cx43處于磷酸化狀態(tài)。在高血壓狀態(tài)下，Cx43降解和脫磷酸化大量增加。Cx43的羧基末端241-382為主要的磷酸化區(qū)，也是多種激素的識別位點，大多數(shù)蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生于此，羧基末端絲/蘇氨酸殘基的磷酸化程度決定著縫隙連接的通透性。本實驗中，Western blot結(jié)果顯示L-NAME致高血壓大鼠心肌p-Cx43 S368表達降低，而這一改變可以被奈必洛爾糾正。因此本研究小組認為，奈必洛爾對Cx43的調(diào)節(jié)作用有可能是通過調(diào)節(jié)其磷酸化水平而實現(xiàn)的。

綜上所述，奈必洛爾在有效降低L-NAME致高血壓模型大鼠血壓的同時，能夠上調(diào)左心室Cx43及其磷酸化的表達，減輕左心室Cx43的重構(gòu)，對靶器官的損害有明顯改善作用，為奈必洛爾在高血壓的臨床應(yīng)用，提供了積極的基礎(chǔ)理論支持。

[1] Fontes MS,van Veen TA,de Bakker JM,etal.Functional consequences of abnormal Cx43 expression in the heart[J].Biochim Biophys Acta,2012,1818(8):2020-2029.

[2] Chen HJ,Yao L,Chen TG,etal.Atorvastatin prevents connexin43 remodeling in hypertrophied left ventricular myocardium of spontaneously hypertensive rats[J].Chin Med J (Engl),2007,120(21):1902-1907.

[3] Egan Benova T,Szeiffova Bacova B,Viczenczova C,etal.Protection of cardiac cell-to-cell coupling attenuate myocardial remodeling and proarrhythmia induced by hypertension[J].Physiol Res,2016，65(Suppl 1):S29-42.

[4] Wang Y,Zhang M,Liu Y,etal.The effect of nebivolol on asymmetric dimethylarginine system in spontaneously hypertension rats[J].Vascul Pharmacol,2011,54(1-2):36-43.

[5] 魏澤卉，李志東，殷莎，等.奈比洛爾對自發(fā)性高血壓大鼠心肌Cx43重構(gòu)的影響[J].中國藥物與臨床，2017：待發(fā)表.

[6] HenrionD,Dowell FJ,Levy BI,etal.In vitro alteration of aortic vascular reactivity in hypertension induced by chronic NG-nitro-L-arginine methyl ester[J].Hypertension,1996,28(3):361-366.

[7] Wang Y,Zhang M,Liu Y,etal.Neither K+channels nor PI3K/Akt mediates the vasodilative effect of nebivolol on different types of rat arteries[J].J Cardiovasc Pharmacol Ther,2009,14(4):332-338.

[8] Maneesai P,Prasarttong P,Bunbupha S,etal.Synergistic antihypertensive effect of carthamus tinctorius(CT)extract and captopril in L-NAME-induced hypertensive rats via restoration of eNOS and AT(1)R expression[J],Nutrients,2016,8(3):122.

[9] 王燕,張明升,劉宇等.奈比洛爾對自發(fā)性高血壓大鼠循環(huán)和主動脈腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2010,15(7):770-774.

[10] Bunbupha S,Prachaney P,Kukongviriyapan U,etal.Asiatic acid alleviates cardiovascular remodelling in rats with L-NAME-induced hypertension[J],Clin Exp Pharmacol Physiol,2015,42(11):1189-1197.

[11] 鐘南田,符史干,吳衛(wèi)紅,等.L-NAME誘導(dǎo)大鼠高血壓性心臟模型重構(gòu)的研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2006,6(12):2140-2141.

[12] Wang Y,Zhang M,Liu Y,etal.Nebivolol treatment improves resistant arterial function and reduces ventricular hypertrophy and angiotensin Ⅱ in spontaneously hypertension rats[J].Renin Angiotensin Aldosterone Sys,2013,14(2):146-155.

mechanism.MethodsAPN and APN receptors(AdipoR1 and AdipoR2)in cultured adipocytes and vascular smooth muscle cells(VSMCs)were detected by Western blot,and the expression of APN in adipocytes and the expression of AdipoR in VSMCs were also detected after angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ)treatment.The expression of APN and AdipoR in the blood vessels of control and Ang Ⅱ-treated C57BL/6 mice were detected by immunofluorescence staining.Transwell assay was used to observe the migration of VSMCs.ResultsAPN mainly expressed in the perivascular adipocytes,while AdipoR1 and AdipoR2 ubiquitously expressed in the blood vessels.Angiotensin II(Ang Ⅱ)-induced vascular injury resulted in a significant decrease of APN(11.7%±3.6%vs3.0%±1.5%),AdipoR1(13.2%±4.0%vs2.7%±1.6%)and AdipoR2(22.4%±7.1%vs5.7%±1.2%)in the perivascular adipocytes and vascular cells.Immunofluorescence results showed that the distribution and expression of APN and its receptors in blood vessels of mice exhibited the similar tendency as theinvitroresults.APN attenuated Ang Ⅱ-induced vascular smooth muscle cells(VSMCs)migration and p38 phosphorylation(1.2±0.08vs2.3±0.46,P<0.05).ConclusionThe results suggest that perivascular adipocytes-derived APN may attenuate hypertensive vascular injury via its receptor-mediated inhibition of p38 signaling pathway.

Effect of nebivolol on left ventricular and Cx43 remodeling in L-NAME-induced hypertensive rats

YIN Sha,WEI Zehui,ZHANG Fei,NIU Mengzhen,WANG Yan*

(DepartmentofPharmacology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001，China;*Correspondingauthor,E-mail:butou1977@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of nebivololon on left ventricular remodeling and Cx43 expression in L-NAME-induced hypertensive rats.MethodsAll Wistar rats were randomly divided into 4 groups：blank control group,model group,nebivolol group and atenolol group.The model rats were induced by L-NAME.The rats were respectively administered with nebivolol and atenolol for 8 weeks in nebivolol group and atenolol group.The systolic blood pressure was measured every week during the treatment.At the end of experiment,the structure of left ventricle was observed using HE staining.Immunohistochemistry and Western blot were used to observe the expression of Cx43 in the left ventricle of rats.ResultsCompared with control group,the blood pressure was significantly increased at 1 week in model group(P<0.05),and reached (192.36±6.95)mmHg at 8 week.The blood pressure in nebivolol group was significantly lower than in model group and atenolol group(P<0.05).In nebivolol group,the L-NAME-induced arrangement of Cx43 and left ventricular remodeling were alleviated and the decreased expression of Cx43 was increased.While atenolol just had an influence on Cx43 expression but not left ventricular remodeling.ConclusionNebivolol may reduce the blood pressure and increase the expression of Cx43 in L-NAME-induced hypertensive rats,therefore inhibit the remodeling of left ventricular.

nebivolol； Cx43； L-NAME； hypertension

山西省青年科技研究基金資助項目(2012021033-3)

殷莎，女，1990-12生，在讀碩士，E-mail：690506596@qq.com

2016-11-25

R544.1

A

1007-6611(2017)03-0201-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.001