復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥的制備及性能研究①

祝芳芳，張 杰,2，遲艷俠，趙 越，郭曉玲，張向宇

(1.黑龍江省藥學(xué)研究所，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007; 2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081; 3佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥的制備及性能研究①

祝芳芳1，張 杰1,2，遲艷俠3，趙 越1，郭曉玲1，張向宇1

(1.黑龍江省藥學(xué)研究所，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007; 2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081; 3佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：制備復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥，研究其抗壓強(qiáng)度、釋藥性能和體外生物活性。方法：采用化學(xué)法制備磷酸鈣骨水泥，利用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)測(cè)試其載荷強(qiáng)度；采用UV測(cè)試磷酸鈣骨水泥中慶大霉素釋放曲線；利用IR、XRD和SEM研究磷酸鈣骨水泥的體外生物活性、化學(xué)成分和微觀形貌。結(jié)果：與磷酸鈣骨水泥基體材料相比，復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥抗壓強(qiáng)度提高三倍左右，其中慶大霉素的釋放時(shí)間增加一倍，體外生物活性提高。結(jié)論：CNTs的加入有效提高了磷酸鈣骨水泥基體材料的抗壓強(qiáng)度、延長(zhǎng)了材料中藥物釋放時(shí)間、提高了材料的體外生物活性。

磷酸鈣骨水泥；CNTs；慶大霉素；載荷強(qiáng)度

伴隨中國(guó)社會(huì)的不斷發(fā)展和人民生活水平的提高，國(guó)內(nèi)骨材料的需要持續(xù)增長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為骨折、骨組織壞死、骨癌變等疾病[1，2]。盡管人體骨組織自身具有較強(qiáng)的再生能力，但其自我修復(fù)功能只能在小面積、小范圍起修復(fù)作用，這樣一來(lái)就帶來(lái)了對(duì)骨修復(fù)材料市場(chǎng)的巨大需求。現(xiàn)在臨床使用的骨修復(fù)材料大致分為：自體骨、異種骨和人工骨移植材料。其中20世紀(jì)80年代中期美國(guó)發(fā)明了一種新型的自固化生物活性骨缺損修復(fù)材料-磷酸鈣骨水泥(CPC)，是具有代表的人工無(wú)機(jī)骨移植材料，磷酸鈣骨水泥在成分上做到了對(duì)天然骨的仿生，所以發(fā)現(xiàn)后頓時(shí)引起社會(huì)的廣泛關(guān)注[3，4]。碳納米管(以下簡(jiǎn)稱CNTs)是一種重要的組織工程學(xué)材料，力學(xué)性能特別優(yōu)異，有較大的強(qiáng)度和韌性。例如，由一層碳原子的六邊形網(wǎng)格卷曲而成的理想的單壁納米碳管的強(qiáng)度約為鋼的100倍，而比重只有鋼的1/6。對(duì)于CNTs的細(xì)胞毒性，雖然仍有爭(zhēng)議，但是CNTs對(duì)骨細(xì)胞是生物相容的、對(duì)骨組織沒(méi)有任何毒性[5，6]。基于此，本文采用化學(xué)法先合成磷酸鈣骨水泥基體材料，通過(guò)在材料中添加CNTs制備復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥，從而提高磷酸鈣骨水泥的力學(xué)性能、生物活性和釋藥性能。

1 材料和試劑

磷酸三鈣，濃硝酸，磷酸二氫鈣，碳酸鈣，檸檬酸，過(guò)氧化氫，氯化鈉，氯化鉀，磷酸二氫鈉，磷酸二氫鉀，鹽酸，均為分析純；碳納米管；硫酸慶大霉素注射液；自制圓柱型模具(h=3cm，d=2cm)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 磷酸鈣骨水泥基體材料的制備

固相配制：將磷酸三鈣(TCP)、磷酸二氫鈣(MPCP)和碳酸鈣(CC)按照1:1:1比例稱料，充分混合得到固相材料Ⅰ，共6.00g。液相配制：將檸檬酸與蒸餾水按濃度為5wt%進(jìn)行配制，得到溶液a；再將磷酸氫二鈉與蒸餾水按濃度為12wt%進(jìn)行配制，得到溶液b；混合溶液a和溶液b得到液相Ⅱ。用調(diào)和刀將液相Ⅱ與固相Ⅰ充分混合后，將其注入模具。使用封口膜將模具封口，放置在恒溫、干燥處避光保存。

對(duì)磷酸鈣骨水泥基體材料進(jìn)行工藝優(yōu)化，分別考察pH值、液固比和固化時(shí)間對(duì)抗壓強(qiáng)度的影響。其中，pH值:液相Ⅱ的pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、7.0，液固比(mL/g): 液固比為0.3、0.35、0.4、0.45、0.5，固化時(shí)間: 2d、8d、16d、30d、60d。

2.2 復(fù)合型磷酸鈣骨水泥的制備

CNTs羧基化：精確稱取50mgCNTs置于100mL燒杯，加入60mL濃硝酸，用封口膜封住，超聲30min。加熱至100℃，攪拌5h，冷卻至室溫，再放入75℃烘箱，烘干12h。研磨后密封保存，備用。

CNTs負(fù)載慶大霉素：硫酸慶大霉素注射液與CNTs按照30mL:1g比例進(jìn)行混合，加水稀釋至一定體積，在室溫下攪拌4h，抽濾干燥(溫度80℃)，得到載藥CNTs。

復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥：按照固相Ⅰ質(zhì)量的0.3%稱取載藥CNTs，兩者均勻混合后放入模具中，保持液固比為0.4mL/g，再加入液相Ⅱ。pH值為4.5，固化時(shí)間分別為5d、10d、20d、30d、60d。注入模具，干燥密封保存，得到復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥。

負(fù)載慶大霉素磷酸鈣骨水泥：精確量取硫酸慶大霉素注射液的量分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mL；液相Ⅱ的量分別為2.2、2.0、1.6、1.2、0.8和0.4mL。將硫酸慶大霉素注射液與液相Ⅱ混合，再加入到固相Ⅰ中，得到混合料漿，注入模具，干燥密封保存。

2.3 磷酸鈣骨水泥體外生物活性

將所制備的磷酸鈣骨水泥基體材料和復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥分別放入盛有250mLPBS的錐形瓶中，浸泡4周。

2.4 磷酸鈣骨水泥體外釋藥實(shí)驗(yàn)

將負(fù)載慶大霉素磷酸鈣骨水泥和復(fù)合載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥浸泡于PBS中，分別在5h、12h、24h、36h、48h時(shí)取PBS浸泡液測(cè)試吸光度，記為A1i、A2i。得到負(fù)載慶大霉素磷酸鈣骨水泥和復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥在PBS中的藥物釋放曲線。

2.5 磷酸鈣骨水泥測(cè)試表征

采用XRD射線衍射和紅外光譜對(duì)磷酸鈣骨水泥化學(xué)成分進(jìn)行分析。采用掃描電鏡SEM觀察磷酸鈣骨水泥微觀形貌。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 不同條件下磷酸鈣骨水泥基體材料抗壓測(cè)試結(jié)果

不同pH值條件下所制備的磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度見(jiàn)圖1。

圖1 不同pH值條件下磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度

通過(guò)圖1分析可知，當(dāng)pH值﹤4.5時(shí)，磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度隨pH值的增大而增大；當(dāng)pH值>4.5時(shí)，載荷強(qiáng)度隨pH值增大而減小；當(dāng)pH值為4.5時(shí)載荷強(qiáng)度達(dá)到最大，約為1.7MPa左右。不同液固比條件下所制備的的磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度見(jiàn)圖2。

圖2 不同液固比條件下磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度

通過(guò)圖2分析可知，當(dāng)液固比<0.4時(shí)，磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度隨液固比增大而增大；當(dāng)液固比>0.4時(shí)，載荷強(qiáng)度隨液固比增大而減??；當(dāng)液固比為0.4時(shí)載荷強(qiáng)度達(dá)到最大，達(dá)到2.5Mpa左右。

不同固化時(shí)間條件下磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度見(jiàn)圖3。

圖3 不同固化時(shí)間條件下磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度

通過(guò)圖3分析可知，當(dāng)固化時(shí)間<30d時(shí)，磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度隨固化時(shí)間增大而增加；當(dāng)固化時(shí)間達(dá)到30d時(shí)，載荷強(qiáng)度達(dá)到最大，約3MPa。

由圖1、2、3可知，當(dāng)pH值為4.5、液固比為0.4mL/g、固化時(shí)間為30d時(shí)，磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度達(dá)到最大，說(shuō)明抗壓性能達(dá)到最佳。在該最佳條件下制備復(fù)合載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

3.2 復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥抗壓性能測(cè)試結(jié)果

復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥的載荷強(qiáng)度變化曲線見(jiàn)圖4。

圖4 復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥載荷強(qiáng)度隨固化時(shí)間的變化

通過(guò)圖4分析可知，當(dāng)固化時(shí)間<30d時(shí)，復(fù)合載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥的載荷強(qiáng)度隨固化時(shí)間增加而增加；固化時(shí)間達(dá)到為30d時(shí)，其載荷強(qiáng)度達(dá)最大，為10MPa左右。與磷酸鈣骨水泥基體材料相比，復(fù)合載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥的載荷強(qiáng)度提高近3倍。所以，CNTs的加入有效提高了磷酸鈣骨水泥材料的抗壓性能。

3.3 復(fù)合載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥的釋藥性能

通過(guò)圖5分析可知，對(duì)于負(fù)載慶大霉素磷酸鈣骨水泥，藥物釋放速度較快，12h時(shí)藥物基本釋放完全；對(duì)于復(fù)合載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥，藥物釋放速度明顯減慢，24h時(shí)藥物釋放濃度達(dá)最大。也就是說(shuō)，與負(fù)載慶大霉素磷酸鈣骨水泥材料相比，復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥釋藥時(shí)間延長(zhǎng)了1倍，即磷酸鈣骨水泥中添加CNTs可有效降低藥物釋放速度。

圖5 負(fù)載慶大霉素磷酸鈣骨水泥(a)復(fù)合載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥(b)中慶大霉素吸光度隨時(shí)間的變化曲線

3.4 復(fù)合載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥的體外生物活性

載藥CNTs磷酸鈣骨水泥和磷酸鈣基體材料分別在PBS中浸泡4周時(shí)的紅外光譜見(jiàn)圖6。

通過(guò)圖6可知：載藥CNTs磷酸鈣骨水泥(b)在513和1053cm-1左右處有PO43-吸收峰， 1535cm-1處出現(xiàn)吸收峰屬于CO32-，3489cm-1附近出現(xiàn)寬吸收帶屬于締合OH-。與磷酸鈣骨水泥基體材料(a)相比，載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥(b)在513、1053、1535和3489cm-1處的峰面積變寬，吸光強(qiáng)度變大，

說(shuō)明載藥CNTs磷酸鈣骨水泥中類(lèi)骨磷灰石的含量高于負(fù)載慶大霉素磷酸鈣骨水泥，即CNTs的加入提高了磷酸鈣骨水泥的生物活性。

圖6 磷酸鈣骨水泥基體材料(a)載藥CNTs磷酸鈣骨水泥(b)在PBS中浸泡4周的紅外譜圖

3.5 復(fù)合載藥CNTs磷酸鈣骨水泥化學(xué)成分和表面形貌

載藥CNTs磷酸鈣骨水泥的表征如圖7所示。通過(guò)圖7(a)可知，載藥CNTs的磷酸鈣骨水泥材料(a)中主要化學(xué)成分為CaHPO4·2H2O，還有少量的Ca10(PO4)6(OH)2。其中，CaHPO4·2H2O的存在有利于誘導(dǎo)新骨的生成。由圖7(b)，載藥CNTs磷酸鈣骨水泥微觀形貌呈鱗片狀結(jié)構(gòu)。

圖7 載藥CNTs磷酸鈣骨水泥的XRD(a)和SEM(b)

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)法制備了磷酸鈣骨水泥材料，最佳制備條件為在pH值4.5、液固比0.4、固化時(shí)間30d；磷酸鈣骨水泥中添加CNTs后，其抗壓強(qiáng)度提高3倍，藥物釋放時(shí)間延長(zhǎng)1倍，體外生物活性提高；載藥CNTs磷酸鈣骨水泥化學(xué)成分為CaHPO4·2H2O和Ca10(PO4)6(OH)2，并且為鱗片狀結(jié)構(gòu)。

[1]VenkatasubbuGD,RamasamyS,RamakrishnanV.Hydroxyapatite-alginatenanocompositeasdrugdeliverymatrixforsustainedreleaseofciprofloxacin[J].JBiomedNanotechnol, 2011， 7(6):759-767

[2]洪漢標(biāo),陳楷正,陳堅(jiān),等.同種異體骨移植的臨床應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用雜志, 2012, 6(1): 47-48

[3]潘杰, 王勇. 新型人工骨的臨床應(yīng)用[J]. 中外健康文摘, 2012, 9(19): 40-41

[4]鐘招明, 韓智敏, 修虎, 等.同種異體骨移植的免疫反應(yīng)及處理方法[J]. 江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003 , 43(6): 146-147

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[6]KimBS,MooneyDJ.Developmentofbiocompatiblesyntheticextracellularatricesfortissueengineering[J].TrendsBiotechnol, 1998, 16(5): 224-230

1.國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目，編號(hào)：81601616；2.黑龍江省博士后基金項(xiàng)目，編號(hào)：LBH-Z15164；3.黑龍江省科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：H2016086；4.佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：2015xj23。

祝芳芳(1993～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

張杰(1979～)女，黑龍江嫩江人，博士，講師。E-mail：zjie612@163.com。

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1008-0104(2017)01-0003-03

2016-11-12)