鵝Caspase-1基因的克隆與序列分析

劉文俊，邱金輝，陽(yáng)佑天，黃運(yùn)茂，許丹寧，田允波

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥工程學(xué)院，廣東 佛山 528000）

廣東是養(yǎng)鵝大省，素有“水禽之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，2009年以來(lái)鵝飼養(yǎng)量穩(wěn)定在7 000萬(wàn)只以上，每年以2%左右的速度遞增［1-2］。養(yǎng)殖技術(shù)水平落后引致的免疫紊亂、疫病頻發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，限制了養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展［3］。炎癥在動(dòng)物疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，對(duì)炎癥系統(tǒng)的研究有助于從分子層面了解致病機(jī)制。

半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是一類具有特異性天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，該家族蛋白在細(xì)胞凋亡和炎癥機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位［4］。Caspase-1是Caspase家族中最早被鑒定的成員，其在細(xì)胞凋亡中的作用并不突出，但是在炎癥的發(fā)生中起關(guān)鍵作用［5］。該蛋白以前體pro-Caspase-1的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，被稱為“炎性體”的胞質(zhì)中多種蛋白構(gòu)成的復(fù)合體激活，水解成具有活性的Caspase-1，并進(jìn)一步切割/加工前白介素1β（pro-IL-1β）和前白介素18（pro-IL-18），使之成為成熟的促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，進(jìn)而促使細(xì)胞炎癥的發(fā)生［6-7］。NLRP3炎性體是研究最為透徹的炎性體之一，該炎性體于2002年由Martinon等研究發(fā)現(xiàn)，它由NLRP3分子與下游凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（ASC）、Caspase-1組成，該復(fù)合體對(duì)Caspase-1的激活非常重要［8-9］。NLRP3蛋白主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等髓系細(xì)胞，能夠被多種類型的刺激物激活，包括損傷/危險(xiǎn)信號(hào)相關(guān)分子模式（DAMP）和病原體相關(guān)分子模式（PAMP），可通過識(shí)別胞內(nèi)的ROS等因子激活，激活的Caspase-1還可降解抗炎因子Sirtuin-1〔一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴的組蛋白脫乙酰酶蛋白〕，在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)其他炎癥途徑的激活［10］。

目前關(guān)于鵝炎癥系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究未見報(bào)道，相關(guān)基因還未有克隆。本研究采用兼并引物法，參考雞的Caspase-1基因設(shè)計(jì)引物，克隆鵝炎癥通路關(guān)鍵蛋白Caspase-1全長(zhǎng)基因，并進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究鵝炎癥系統(tǒng)的功能和作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：70日齡健康馬崗鵝3只，購(gòu)自清遠(yuǎn)市金羽豐鵝業(yè)有限公司。屠宰后，無(wú)菌采集鵝的脾臟，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：Trizol RNA 提取試劑盒、PrimeScript RT-Master反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒、pMD18-T Vector、Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等，均購(gòu)自TaKaRa公司。

主要儀器：核酸凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 4100，上海）、超微量分光光度計(jì)（Nano-200，美國(guó)）、PCR儀（ABI2720，美國(guó)）和4℃冷凍高速離心機(jī)（Thermo，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雞Caspase-1基因的核苷酸序列（No.AF031351），設(shè)計(jì)1對(duì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)（P1：5′CAGGGCCACCCCGCAGAC3′，P2：5′GGGTGGAAGTGGCTCTCAGGG3′），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 RNA提取與全長(zhǎng)基因擴(kuò)增 采用Trizol RNA提取試劑盒，從鵝脾臟中提取總RNA，cDNA的合成采用PrimeScript RT-Master反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說(shuō)明書操作。以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用引物對(duì)Caspase-1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為25μL，包括 10×PCR buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，上下游引物（10μmol/L）各 0.75μL，Ex Taq 0.25 μL，dH2O 16.75μL，cDNA模板 2μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。在紫外燈下切取目的片段，利用凝膠回收試劑盒按說(shuō)明回收純化，并連接T載體，使用BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 測(cè)序結(jié)果采用Seqmen軟件進(jìn)行拼接，使用Blast N程序?qū)⑵唇有蛄性贕enBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)鑒定。ORF分析采用SeqBuilder軟件進(jìn)行劃分，并翻譯成氨基酸序列。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載已發(fā)表的所有物種Caspase-1基因序列，用MegAlign軟件進(jìn)行同源性比較。蛋白理化性質(zhì)分析采用ExPAsy服務(wù)系統(tǒng)中的ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用PredictProtein 在線分析工具（https：//www.predictprotein.org/）；蛋白結(jié)構(gòu)域分析采用NCBI CDD Tools在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；蛋白三維建模，通過將氨基酸序列提交至瑞士生物信息研究所（SIB）SWISS-MODEL服務(wù)器（http：//swissmodel.expasy.org/），利用 Automated Mode，搜索與目的序列結(jié)構(gòu)相似的氨基酸序列，以搜索到的模板蛋白質(zhì)PDB作為同源性模板預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)［11］。利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，基于General Time Reversible model（GTR） 模型，以最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹，并采用重復(fù)抽樣分析1 000次的方法檢驗(yàn)各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬崗鵝Caspase-1基因克隆和序列測(cè)定

應(yīng)用兼并引物，以鵝脾臟cDNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示成功擴(kuò)增片段，長(zhǎng)度約為1 200 bp（圖1）。對(duì)目的片段連接的T載體進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示大小為1 233 bp（圖2）。通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast N比對(duì)，鑒定結(jié)果顯示所克隆的基因?yàn)镃aspase-1基因，表明成功克隆了鵝Caspase-1基因，命名為go-Caspase-1。SeqBuilder軟件ORF Finder分析顯示，go-Caspase-1擴(kuò)增片段包含完整的ORF，長(zhǎng)度為813 bp，編碼270個(gè)氨基酸（圖3）。將該序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登錄號(hào)為MG463109。

圖1 馬崗鵝Caspase-1基因的擴(kuò)增

圖2 馬崗鵝Caspase-1質(zhì)粒的酶切鑒定

圖3 馬崗鵝Caspase-1核苷酸及蛋白質(zhì)序列

2.2 Caspase-1基因序列同源性分析

使用DNAstar軟件將鵝與人、鼠、大鼠、豬、牛、羊、馬、雞、鴨、家蠅等18個(gè)物種的Caspase-1編碼區(qū)進(jìn)行基因同源性比對(duì)分析，結(jié)果（圖4）顯示，鵝與其他物種的同源性在99.1%～37.4%之間，鵝與鴨的同源性最高為99.1%，與雞達(dá)到84.6%，與中華鱉為64.7%，與余物種的基因同源性均低于60%，證明不同物種間該基因的同源性差異較大，在禽類中有較高的同源性。

圖4 不同物種Caspase-1基因的核苷酸同源性（%）比較

2.3 go-Caspase-1蛋白基本理化特征分析

采用DNAstar軟件和ExPAsy服務(wù)系統(tǒng)中的ProtParam工具對(duì)Caspase-1基因編碼蛋白序列的基本理化性質(zhì)進(jìn)行綜合預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明，go-Caspase-1蛋白共含有270個(gè)氨基酸，分子式為C1383H2166N388O405S13，分子量31.13 ku；含帶正電的氨基酸（Arg+Lys）33個(gè)、帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu）32個(gè)，理論等電點(diǎn)為7.8；含疏水氨基酸86個(gè)、極性氨基酸73個(gè)，總平均疏水性（GRAVY）為-0.42，說(shuō)明該蛋白質(zhì)具有親水性，蛋白在體內(nèi)的半衰期為30 h，屬于長(zhǎng)壽命蛋白。使用PredicrProtein在線分析工具對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Loop）占61.48%，α螺旋結(jié)構(gòu)（alphahelix）占21.85%，β折疊結(jié)構(gòu)（beta-sheet）占16.67%；go-Caspase-1蛋白由20種氨基酸組成，各氨基酸含量在1.1%～10%之間，其中亮氨酸含量最高（占10%）、丙氨酸占4.1%、谷氨酸占3.7%、甲硫氨酸占3.7%，與該蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)。對(duì)α螺旋結(jié)構(gòu)阻礙性較強(qiáng)的脯氨酸（4.8%）和甘氨酸（4.8%）含量較高，可能是蛋白結(jié)構(gòu)以環(huán)狀結(jié)構(gòu)為主的原因。

2.4 go-Caspase-1蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

采用NCBI CDD Tools在線軟件分析Caspase-1分子的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示go-Caspase-1分子主體包含半胱氨酸蛋白酶（CASc Superfamily，CAScS ）結(jié)構(gòu)域，符合典型的Caspase-1結(jié)構(gòu)特征。比較不同物種Caspase-1蛋白，結(jié)果（圖5）顯示，鵝含有270個(gè)氨基酸，鴨含有217個(gè)氨基酸，雞含有283個(gè)氨基酸，與人（404個(gè)氨基酸）、鼠（402個(gè)氨基酸）等哺乳類動(dòng)物蛋白大小相差較大。結(jié)構(gòu)上所有物種均含有CAScS結(jié)構(gòu)域，且結(jié)構(gòu)域內(nèi)的功能結(jié)構(gòu)基本相同，推測(cè)各物種該蛋白均具有相同的功能。此外，分析結(jié)果顯示禽類Caspase-1蛋白均不含有死亡結(jié)構(gòu)域（Death domain superfamily，DDS）。

2.5 Caspase-1蛋白三維結(jié)構(gòu)分析

采用SWISS-MODEL （ ProMod version1.1.0）3D同源建模對(duì)Caspase-1蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示。同源搜索結(jié)果顯示最相似的蛋白模型PBD號(hào)為3e4c.1.A，go- Caspase-1蛋白3D預(yù)測(cè)結(jié)果顯示模型覆蓋率為97%，全模型質(zhì)量估測(cè)（Global Model Quality Estimation，GMQE）值為0.74，該數(shù)值越接近1則建模質(zhì)量越高；全模型和每個(gè)殘基模型質(zhì)量（Global and per-residue model quality，QMEAN）值為 -2.66，該數(shù)值大于-4，表明建模質(zhì)量?jī)?yōu)秀，評(píng)分結(jié)果表明預(yù)測(cè)模型可信。建模結(jié)果顯示，鵝與雞和人的Caspase-1蛋白三維結(jié)構(gòu)呈大致相同的空間構(gòu)型，由α螺旋結(jié)構(gòu)和β折疊結(jié)構(gòu)或環(huán)裝結(jié)構(gòu)交替組成。僅有幾處細(xì)微結(jié)構(gòu)上的差別（圖6箭頭所示），N端的差異最為顯著，人Caspase-1蛋白有一段較長(zhǎng)的α螺旋結(jié)構(gòu)，鵝與雞在N端的螺旋結(jié)構(gòu)較短；此外，3種蛋白還存在部分環(huán)狀結(jié)構(gòu)的空間差異，但對(duì)于整體空間結(jié)構(gòu)影響較小，研究結(jié)果驗(yàn)證了Caspase-1蛋白的空間結(jié)構(gòu)的保守性。

圖5 不同物種Caspase-1蛋白結(jié)構(gòu)域比較

圖6 不同物種Caspase-1蛋白三維結(jié)構(gòu)比較

2.6 Caspase-1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

不同物種間Caspase-1基因分子進(jìn)化分析結(jié)果顯示，Caspase-1基因的物種進(jìn)化呈較明顯的分化（圖7），家蠅等屬于節(jié)肢動(dòng)物門，其進(jìn)化程度相對(duì)較低，進(jìn)化地位最原始，成為一個(gè)分支，位于整個(gè)進(jìn)化樹的基部；其他物種均屬于脊索動(dòng)物門中的脊椎動(dòng)物亞門，共同組成一個(gè)大分支。其中硬骨魚綱鰈形目牙鲆，進(jìn)化地位較低，單獨(dú)一支位于底部；脊椎動(dòng)物亞門中的哺乳綱、鳥綱、爬行綱組成一個(gè)較大的分支。鵝與同屬水禽的鴨基因進(jìn)化距離最近，與雞同屬一個(gè)分支，爬行綱的中華鱉其基因與禽類的進(jìn)化距離較近。

圖7 Caspase-1基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

廣東養(yǎng)鵝業(yè)具有得天獨(dú)厚的自然環(huán)境和種質(zhì)資源，廣東四大名鵝（馬崗鵝、陽(yáng)江鵝、獅頭鵝、烏鬃鵝）中包含世界上最大的鵝種獅頭鵝和最小的鵝種烏鬃鵝，本研究的樣品采自廣東養(yǎng)殖規(guī)模最大的馬崗鵝。伴隨著鵝養(yǎng)殖量逐年增加，相應(yīng)的問題也愈發(fā)突出，粗放的養(yǎng)殖模式導(dǎo)致的疫病高發(fā)與生長(zhǎng)緩慢，限制了行業(yè)的發(fā)展。炎癥是疫病發(fā)生發(fā)展的核心，適度的炎癥反應(yīng)有助于機(jī)體對(duì)抗損傷，但如果炎癥細(xì)胞過度活化，則會(huì)加重?fù)p傷，所帶來(lái)的細(xì)胞病變及生理功能障礙是造成疾病的主要因素［12］。

Caspase 家族的共同特征是能通過自身催化位點(diǎn)的半胱氨酸殘基特異性切割目標(biāo)蛋白的天冬氨酸殘基，在調(diào)控炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中起重要作用。其中Caspase-1、Caspase-4和Caspase-5參與炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)，Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)過程，而Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7是細(xì)胞凋亡發(fā)生的效應(yīng)蛋白。該家族蛋白比較保守，染色體所處的位置也較為相似。人Caspase-1蛋白可以分成3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端主要包含一個(gè)CARD區(qū)，該區(qū)能夠與其他攜帶CARD區(qū)的蛋白相互結(jié)合；p20大亞基與p10小亞基則是發(fā)揮Caspase-1催化活性的區(qū)域，激活后p20與p10形成二聚體，再進(jìn)一步形成四聚體，發(fā)揮其生物學(xué)功能［13］。Caspase-1蛋白可以被多種炎性體激活，如NLRP1炎性體、NLRP3炎性體、AIM2炎性體、RIG-I炎性體以及NLRC4炎性體等［14-15］。其在體內(nèi)扮演了調(diào)控細(xì)胞程序性死亡、調(diào)控炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)炎癥性壞死等多種角色，對(duì)Caspase-1的進(jìn)一步研究有助于了解炎癥系統(tǒng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的［16］。

本研究首次克隆了馬崗鵝Caspase-1基因，并對(duì)其基因同源性、進(jìn)化表達(dá)蛋白的特性、結(jié)構(gòu)域及空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，家禽的Caspase-1基因同源性較高，但與哺乳類動(dòng)物在基因長(zhǎng)度和蛋白結(jié)構(gòu)域上存在較大差異，禽類Caspase-1基因均不含有DDS 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過與DDS家族其他成員包括PYRIN和DED（Death Effector Domain）相關(guān)聯(lián)，是信號(hào)通路中的銜接子，該部分結(jié)構(gòu)的差異預(yù)示禽類在Caspase-1激活的機(jī)制上可能與哺乳類動(dòng)物存在差異。Caspase-1基因在細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡、炎性等多種過程中發(fā)揮重要作用，圍繞該基因進(jìn)一步研究，將有助于疫病的防控和揭示家禽免疫系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制。

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