菠蘿蜜種子中總黃酮的提取工藝及其抗氧化性研究

張錦東，王小玉，游淑珠，趙國鋒，余以剛

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東 珠海 519000；3.珠海市禾協(xié)農(nóng)產(chǎn)品有限公司，廣東 珠海 519100）

菠蘿蜜又稱樹菠蘿、木菠蘿，主要分布于熱帶亞熱帶地區(qū)，是常見的熱帶水果。我國種植菠蘿蜜的記載可追溯至1 000多年前，廣泛分布于廣東、海南、云南、四川等地，近年來種植面積和產(chǎn)量日益增長。菠蘿蜜在實(shí)際生產(chǎn)中以果肉銷售為主，而生產(chǎn)過程中產(chǎn)生約70%的副產(chǎn)物，如種子、果瓤等鮮少被開發(fā)利用，產(chǎn)生的廢棄物造成了環(huán)境污染。菠蘿蜜種子在整果中的含量約為12%，菠蘿蜜種子含有豐富的淀粉和蛋白質(zhì)，其主要組成成分與小麥粉類似；同時(shí)菠蘿蜜種子還含有各種礦物質(zhì)和總黃酮等功能性成分［1-3］，有益氣養(yǎng)血和消炎止痛的功效，營養(yǎng)價(jià)值較高。目前，國內(nèi)外對(duì)菠蘿蜜種子的研究利用主要集中在對(duì)菠蘿蜜種子的化學(xué)組成、淀粉提取工藝及理化性質(zhì)方面［4-10］，對(duì)菠蘿蜜種子中黃酮等功能性成分的相關(guān)研究較少，為此，我們采用四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了菠蘿蜜種子中總黃酮的提取工藝，并采用DPPH法和水楊酸法測定了總黃酮粗提液的抗氧化性，為菠蘿蜜種子的深加工及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菠蘿蜜種子由珠海禾協(xié)農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%）為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。主要試劑：抗壞血酸、二苯代苦味酰基自由基（1，1-pheny-2-picrylhydrazyl，DPPH）、水楊酸、無水乙醇、FeSO4、H2O2、NaNO2、Al(NO2)3、NaOH 等，實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

主要儀器：752S型紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)公司）、JJ200型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）、冷凍干燥機(jī)（廣東永利機(jī)械設(shè)備有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠）、DFY-500型搖擺式高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、JW-3021HR型高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器設(shè)備有限公司）等。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［11-13］

準(zhǔn)確稱取0.0100 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液經(jīng)超聲波溶解后定容至刻度，即配制成0.2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL（相當(dāng)于 0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mg無水蘆?。┯?支25 mL容量瓶中，分別加入蒸餾水至約10.0 mL。依次加入配置好的7.25×10-1mol/L的NaNO2溶液1.0 mL，搖勻并靜置6 min；依次加入配置好的1.59 mol/L Al（NO3）3溶液 1.0 mL，搖勻并靜置 6 min；依次加入配置好的5 mol/L NaOH溶液4.0 mL，分別用蒸餾水定容至刻度，搖勻并靜置15 min。以試劑空白調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在λ= 510 nm處測定吸光度值A(chǔ)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 總黃酮提取工藝的優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）樣品預(yù)處理：菠蘿蜜種子經(jīng)真空冷凍干燥處理后，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過孔徑0.250 mm篩，裝入錫箔袋密封避光保存。

（2）總黃酮粗提液的配制：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的菠蘿蜜種子粉樣品，在文獻(xiàn)［14-17］的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)，以乙醇溶液為溶劑，把樣品加入一定量溶劑中，加熱提取、抽濾，4 000 r/min離心15 min，取上清液；將濾渣按上述方法處理1次，抽濾、離心，合并提取液，將所得到的提取液定容于50 mL容量瓶中；從上述50 mL溶液中準(zhǔn)確移取5.0 mL置于比色皿中，加入7.25×10-1mol/L的NaNO2溶液1.0 mL，搖勻并靜置6 min；加入1.59 mol/L的Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻并靜置6 min；加入5 mol/L的NaOH溶液4.0 mL，搖勻并加入0.4 mL蒸餾水，搖勻并靜置15 min，在510 nm處測其吸光度值A(chǔ)。根據(jù)線性回歸方程y = 0.4174x + 0.0001，計(jì)算菠蘿蜜種子中總黃酮含量。菠蘿蜜種子中總黃酮提取率計(jì)算公式為：

（3）乙醇濃度的確定：固定提取時(shí)間40 min、提取溫度60℃、料液比1∶5 g/mL，選擇乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%分別提取菠蘿蜜種子中黃酮化合物。

（4）料液比的確定：固定乙醇濃度60%、提取時(shí)間40 min、提取溫度60℃，選擇料液比為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL 分別提取菠蘿蜜種子中黃酮化合物。

（5）提取溫度的確定：固定乙醇濃度60%、提取時(shí)間40 min、料液比1∶15 g/mL，選擇提取溫度為40、50、60、70、80℃分別提取菠蘿蜜種子中黃酮化合物。

（6）提取時(shí)間的確定：固定乙醇濃度60%、提取溫度70℃、料液比1∶15 g/mL，選擇提取時(shí)間為30、40、50、60、70 min分別提取菠蘿蜜種子中黃酮化合物。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、提取時(shí)間（D）4個(gè)變化因素，采用L9（34）即四因素三水平的分析方法，分析4種因素對(duì)菠蘿蜜種子中總黃酮提取率的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定正交試驗(yàn)因素水平（表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.4 總黃酮抗氧化活性的測定

1.4.1 DPPH法 DPPH法可以快速、簡便、靈敏地檢測出天然抗氧化劑的抗氧化活性。其氧化活性用清除率來表示，清除率越大，抗氧化性越強(qiáng)。在文獻(xiàn)［18-22］的基礎(chǔ)上，按如下測定步驟操作：（1）取0.25 mL 1.26×10-4mol/L的DPPH溶液與1.0 mL無水乙醇混合并搖勻，在37℃下靜置30 min，以無水乙醇為空白在517 nm波長處測定其吸光度值，記為A0。（2）分別取1 mL提取液與0.25 mL無水乙醇混合并搖勻，在37℃下靜置30 min，以無水乙醇為空白在517 nm測定其吸光度值，記為Aj。（3）分別取1 mL提取液與0.25 mL 1.26×10-4mol/L的DPPH溶液混合并搖勻，在37℃下靜置30 min，以無水乙醇為空白在517 nm測定其吸光度值，記為Ai。計(jì)算總黃酮提取液對(duì)DPPH的清除率：

式中，A0為樣品空白在517 nm波長下測得的吸光度值，Aj為提取液不加DPPH時(shí)在517 nm波長下測得的吸光度值，Ai為提取液加DPPH后在517 nm波長下測得的吸光度值。

以同樣方法測定Vc對(duì)DPPH的清除能力，作為對(duì)照。3次重復(fù)。

1.4.2 水楊酸法 Fenton反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生羥自由基（·OH），水楊酸與羥自由基反應(yīng)產(chǎn)生2，3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在510 nm處的吸光值與·OH的含量成正比。因此可通過紫外分光光度法測定·OH的含量并描述待測物質(zhì)對(duì)·OH的清除能力。在文獻(xiàn) ［23-27］的基礎(chǔ)上，按如下測定步驟操作：（1）取1.0 mL 9.0×10-3mol/L的FeSO4溶液與1.0 mL 9.0×10-3mol/L的水楊酸、1.0 mL 8.8×10-3mol/L的 H2O2、1.0 mL蒸餾水混合并搖勻，在37℃下靜置1 h，以蒸餾水為空白在510 nm波長處測定其吸光度值，記為A0。（2）取 1.0 mL 9.0×10-3mol/L 的 FeSO4溶液與1.0 mL 9.0×10-3mol/L的水楊酸、1.0 mL 8.8×10-3mol/L的H2O2、1.0 mL粗提液混合并搖勻，在37℃下靜置1 h，以蒸餾水為空白在510 nm波長處測定其吸光度值，記為Ai。（3）取1.0 mL 9.0×10-3mol/L的FeSO4溶液與1.0 mL 9.0×10-3mol/L的水楊酸、1.0 mL粗提液、1.0 mL蒸餾水混合并搖勻，在37℃下靜置1 h，以蒸餾水為空白在510 nm波長處測定其吸光度值，記為Aj。計(jì)算總黃酮粗提取液對(duì)·OH的清除率：

式中，A0為樣品空白在510 nm波長下測得的吸光度值，Ai為粗提液加H2O2后在510 nm波長下測得的吸光度值，Aj為粗提液不加H2O2時(shí)在510 nm波長下測得的吸光度值。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel處理，以鄧肯新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮的檢測

以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，蘆丁含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。通過線性擬合得到回歸方程y = 0.4174x + 0.0001，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9993。根據(jù)樣品吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量，結(jié)果表明，黃酮含量在0～2.0mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 總黃酮的提取工藝

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析 （1）乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響：由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度低于60%時(shí)，隨著乙醇濃度的提高，總黃酮含量增加趨勢顯著，總黃酮提取率遞增，其中，乙醇濃度60%時(shí)的總黃酮提取率為1.82%，比乙醇濃度40%時(shí)高了75.7%；當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，總黃酮提取率遞增速率明顯降低，乙醇濃度80%時(shí)的總黃酮提取率只比60%時(shí)高3.3%，說明此時(shí)菠蘿蜜種子中總黃酮提取已經(jīng)較充分。考慮綜合成本等實(shí)際因數(shù)，選取60%為合適的乙醇濃度。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

（2）料液比對(duì)總黃酮提取率的影響：由圖3可知，隨著料液比的降低，總黃酮提取量逐漸遞減；當(dāng)料液比高于1∶15 g/mL時(shí)，總黃酮提取率隨料液比的降低而逐漸遞增，料液比為1∶15 g/mL時(shí)總黃酮提取率達(dá)到峰值2.73%，比1∶5 g/mL時(shí)高了50.0%；當(dāng)料液比小于1∶15 g/mL時(shí)，總黃酮提取率隨料液比的降低而無明顯變化。因此當(dāng)料液比為1∶15 g/mL時(shí)，認(rèn)為總黃酮的提取已經(jīng)比較充分。綜上所述，選取1∶15 g/mL為提取的合適料液比。

圖3 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

（3）提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響：由圖4可知，當(dāng)提取溫度在40～70℃時(shí)，隨著提取溫度的提高，總黃酮含量逐漸遞增，總黃酮提取率也隨之逐漸遞增，提取溫度在70℃時(shí)出現(xiàn)峰值2.84%，其中提取溫度為70℃時(shí)的總黃酮提取率比40℃時(shí)提高了78.6%。當(dāng)提取溫度超過70℃時(shí)總黃酮提取量與提取率均呈現(xiàn)遞減趨勢，提取溫度為80℃時(shí)的總黃酮提取率比70℃時(shí)降低了6.4%，說明溫度過高破壞了黃酮的提取體系，不利于提取。綜上所述，選取70℃為合適的提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

（4）提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響：由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間在30～50 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮含量逐漸遞增，總黃酮提取率也隨之逐漸遞增，提取時(shí)間在50 min時(shí)出現(xiàn)總黃酮提取率峰值（2.89%），其中提取時(shí)間為50 min時(shí)的總黃酮提取率比30 min時(shí)提高了16.7%。當(dāng)提取溫度超過50 min時(shí)總黃酮提取量與提取率均呈現(xiàn)遞減趨勢，提取溫度為70 min時(shí)的總黃酮提取率比50 min時(shí)降低了5.9%，表明提取時(shí)間過長不利于總黃酮的提取，這可能是由于在高溫下提取時(shí)間過長對(duì)部分黃酮造成了影響所致。綜上所述，選取50 min為提取的合適時(shí)間。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 由表2可知，在水浴提取條件下，乙醇濃度為極顯著影響因素，提取溫度、料液比、提取時(shí)間為顯著因素，從實(shí)際生產(chǎn)情況考慮，最終確定生產(chǎn)的最優(yōu)工藝為A3B1C3D2，即70%乙醇、60℃水浴提取50 min、料液比為1∶20。最優(yōu)條件下，菠蘿蜜種子中總黃酮提取率達(dá)到3.30%。

2.3 總黃酮粗提液的抗氧化活性

2.3.1 DPPH法 從圖6可以看出，菠蘿蜜種子中總黃酮提取液和Vc溶液對(duì)DPPH的清除能力均隨濃度的提高而增強(qiáng)，在濃度小于0.1 mg/mL時(shí)，總黃酮提取液對(duì)DPPH的清除能力強(qiáng)于Vc，當(dāng)濃度大于0.10 mg/mL后，Vc對(duì)DPPH的清除能力稍強(qiáng)。菠蘿蜜種子中總黃酮提取液的IC50＞Vc的IC50值，表明低濃度下菠蘿蜜種子中總黃酮提取液的對(duì)DPPH的清除能力較強(qiáng)，抗氧化活性較強(qiáng)。

圖6 不同濃度下反應(yīng)液對(duì)DPPH的清除率

2.3.2 水楊酸法 從圖7可以看出，隨濃度的提高，總黃酮粗提液和Vc溶液對(duì)·OH的清除能力逐漸增強(qiáng)，在濃度小于0.38 mg/mL時(shí)，總黃酮提取液對(duì)DPPH的清除能力強(qiáng)于Vc，黃酮提取液的IC50＞Vc的IC50。當(dāng)濃度大于0.380 mg/mL后，Vc對(duì)·OH的清除能力稍強(qiáng)。在最優(yōu)提取工藝條件下，濃度為0.6 mg/mL的菠蘿蜜種子中總黃酮粗提液對(duì)·OH清除達(dá)到95.3%，表明其總黃酮粗提液對(duì)·OH有較高的清除能力，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

圖7 不同濃度下反應(yīng)液對(duì)·OH的清除率

3 結(jié)論與討論

（1）在水浴條件下，4個(gè)因素對(duì)菠蘿蜜種子粉總黃酮提取率的影響大小為：乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。其中，乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率影響極顯著，料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響顯著；菠蘿蜜種子中總黃酮的提取最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1：20 g/mL，60℃水浴提取50 min，提取率達(dá)到3.30%。

（2）菠蘿蜜種子中總黃酮粗提液對(duì)DPPH及·OH的清除能力隨濃度的提高而增強(qiáng)，濃度在0.3 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH及·OH的清除率分別達(dá)到90.2%和94.1%，說明菠蘿蜜種子中的總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可作為天然健康食品原料。

（3）菠蘿蜜品種眾多，按肉質(zhì)和水分含量可分為干苞和濕苞兩種類型；按花期可分為單造和雙造兩種類型等。由于各品種營養(yǎng)品質(zhì)差異較大，且各營養(yǎng)成分間的相關(guān)性尚有待研究，本試驗(yàn)未對(duì)多品種菠蘿蜜種子的提取工藝及抗氧化性作進(jìn)一步分析，因此仍需進(jìn)一步研究完善。

［1］尹道娟，張國治，薛慧，等. 菠蘿蜜種子粉主要化學(xué)成分和加工性能研究［J］. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014（1）：87-91.

［2］張濤，潘永貴. 菠蘿蜜營養(yǎng)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（4）：88-90，103.

［3］S B Swami，N J Thakor，P M Haldankar，et al.Jackfruit and its many functional components as related to human health［J］. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2012，11 （6）：565-576.

［4］胡美杰. 菠蘿蜜種子淀粉提取工藝、物化特性及其在餅干中的應(yīng)用［D］. 哈爾濱：黑龍江東方學(xué)院，2016.

［5］楊慧強(qiáng)，白新鵬，呂曉亞，等. 菠蘿蜜種子淀粉提取工藝及其物性的研究［J］. 食品科技，2016（3）：237-242.

［6］初眾，胡美杰，徐飛，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取菠蘿蜜種子淀粉工藝［J］. 食品工業(yè)科技，2016，37（20）：189-193，200.

［7］張彥軍，朱紅梅，田建文，等. 菠蘿蜜種子淀粉制備香草蘭微膠囊的工藝研究［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2017（6）：1127-1133.

［8］Fateatun N，Md J R，Md S M，et al. Physicochemical Properties of Flour and Extraction of Starch from Jackfruit Seed［J］. International Journal of Nutrition and Food Sciences，2014，4（3）：347-354.

［9］P L Tran，D H D Nguyen，V H Do，et al.Physicochemical properties of native and partially gelatinized high-amylose jackfruit（Artocarpusheterophyllus Lam.）seed starch［J］. LWT-Food Science and Technology，2015，62 （2）：1091-1098.

［10］K Rengsutthi，S Charoenrein. Physicochemical properties of jackfruit seed starch（Artocarpusheterophyllus）and its application as a thickener and stabilizer in chilli sauce［J］.LWT-Food Science and Technology，2011，44（5）：1309-1313.

［11］河北省技術(shù)監(jiān)督局. DB13/T 385-1998. 食品中總黃酮（蘆?。┑臏y定［S］. 1998.

［12］湖南省技術(shù)監(jiān)督局. DB43/T 476-2009. 植物源性食品中總黃酮的測定［S］. 2009.

［13］全國果品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). NY/T27 41-2015.仁果類水果中類黃酮的測定［S］. 2015.

［14］江新德，江桂仙，邱深玉，等. 菠蘿蜜葉中水溶性黃酮的分離與純化［J］. 南昌工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2015（4）：11-14，25.

［15］郝倩. 菠蘿蜜葉黃酮類化合物的提取及其浸膏的應(yīng)用［D］. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2014.

［16］李絢，龍敏儀. 紫外分光光度法測定食用玫瑰花中類黃酮的含量［J］. 食品研究與開發(fā)，2015（23）：142-144.

［17］鄧夢琴. 菠蘿蜜果皮總黃酮的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其抗氧化活性研究［D］. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［18］韋獻(xiàn)雅，殷麗琴，鐘成，等. DPPH法評(píng)價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)，2014（9）：317-322.

［19］袁園，張瀟，陳碧瓊，等. 草果總黃酮的提取及DPPH自由基清除活性研究［J］. 食品研究與開發(fā)，2017（15）：63-68.

［20］姚文紅，李飛陽，王娟，等. 女貞花總黃酮提取及清除DPPH自由基作用的研究［J］. 食品研究與開發(fā)，2016（14）：42-45，67.

［21］林戀竹，趙謀明. 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH·法、ABTS+·法評(píng)價(jià)抗氧化性結(jié)果的影響［J］. 食品科學(xué)，2010（5）：63-67.

［22］韋獻(xiàn)雅，殷麗琴，鐘成，等. DPPH法評(píng)價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)，2014（9）：317-322.

［23］李艷，鞏士磊，車影，等. Fenton反應(yīng)考察抗壞血酸清除羥基自由基能力及動(dòng)力學(xué)［J］. 應(yīng)用化學(xué)，2015（8）：948-954.

［24］代沙. 紫蘇葉抗氧化物質(zhì)提取、含量測定及抗氧化活性研究［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［25］文紅波，曹運(yùn)長，吳玉蘭，等. 金櫻子總黃酮體外抗氧化活性的研究［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014（7）：1127-1131.

［26］李粉玲，蔡漢權(quán)，林澤平. 紅豆多糖抗氧化性及還原能力的研究［J］. 食品工業(yè)，2014（2）：190-194.

［27］Maja M P，Anton L，Valentina S，et al. Extraction methods，Comparison of major taste compounds and antioxidative properties of fruits and flowers of different Sambucus species and interspecific hybrids［J］. Food Chemistry，2016，200：134-140.