兩株耐高溫酵母菌的鑒定及其特性研究

宋培勇，曾伯平，肖仲久

（遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，貴州 遵義 563000）

隨著石油資源的日漸枯竭，尋找并開發(fā)可再生能源是人類的必然選擇?？稍偕茉窗ㄌ柲堋⑺?、潮汐能、風(fēng)能和生物質(zhì)能等。乙醇就是一種生物質(zhì)能，用途廣泛，可用作燃料、飲料、化工原料、溶劑和消毒劑等。作為車用燃料的乙醇汽油在減少CO、HC、NOx、顆粒物和苯系物等有毒物質(zhì)排放方面具有顯著功效，可以減少環(huán)境污染物的排放，顯著改善空氣質(zhì)量［1］。 酵母菌利用EMP途徑進(jìn)行同型乙醇發(fā)酵，而細(xì)菌利用ED途徑進(jìn)行同型乙醇發(fā)酵。酵母菌由于其卓越的發(fā)酵性能和耐受高溫以及在預(yù)處理和發(fā)酵過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物的能力，用作乙醇生產(chǎn)比細(xì)菌更有效［2］。有多種原料可以用作乙醇生產(chǎn)的潛在底物，如甘蔗、糖用甜菜、甜高粱、乳清和糖蜜等糖類，玉米、小麥、木薯和馬鈴薯等淀粉類，柴草、農(nóng)作物秸稈和殘茬等木質(zhì)纖維素類［2］。纖維素是地球上含量最豐富的可再生資源［3］，用木質(zhì)纖維素類物質(zhì)通過微生物乙醇發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇是解決當(dāng)今能源短缺的理想途徑，而在各種乙醇發(fā)酵方法中，最具發(fā)展?jié)摿蛢?yōu)勢的方法之一就是同步糖化發(fā)酵法（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）。同步糖化發(fā)酵法這一概念最早是由Gauss等［4］于1976年提出的，所謂同步糖化發(fā)酵就是纖維素的酶解（即糖化）和乙醇發(fā)酵在同一裝置內(nèi)同步進(jìn)行。同步糖化發(fā)酵法工藝流程短、設(shè)備投資少、乙醇產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低。但是SSF法也存在致命缺點(diǎn)，即酶水解的最適溫度（55℃）和發(fā)酵溫度（30℃）不一致。為此，人們把目光投向了耐高溫酵母菌。耐高溫酵母是高溫條件下成功生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵因素，高溫發(fā)酵生產(chǎn)乙醇具有冷卻成本低、污染風(fēng)險小、節(jié)約糖化酶的使用等多種優(yōu)點(diǎn)［5］。選育耐高溫酵母可以采取高溫馴化［6-8］、雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合［9］和基因工程等技術(shù)措施。從高溫自然環(huán)境中篩選耐高溫酵母，雖然工作量較大，但篩選獲得的酵母遺傳性狀穩(wěn)定，仍不失為一種可行、可靠和可取的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土樣：試驗土樣從貴州茅臺酒廠附近常年堆放酒糟的地段采集。

培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基［10］、胡蘿卜塊培養(yǎng)基［11］，PDA培養(yǎng)基、McClary培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基［12-13］、種子培養(yǎng)基［14］，EFM 培養(yǎng)基［15］，均參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行配制。

主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀S1000TM Thermal Cycler（Bio-Rad），WD-9413A凝膠成像分析儀、DYY-10C型電泳儀（北京六一），GC7890型氣相色譜儀（美國安捷倫），T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器公司）。

主要藥品及試劑：PCR引物NL-1：5′-GC ATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′、NL- 4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3′（上海生工生物技術(shù)有限公司合成），200 bp DNA Ladder（北京天根生化科技）； PCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離 稱取土樣，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋制成10-3、10-4的土壤懸液，然后采取無菌操作技術(shù)吸取0.1 mL涂布于PDA平板上，每個稀釋度接2個平板，于28～30℃培養(yǎng)，待長出菌落后，挑取單菌落劃線轉(zhuǎn)接于PDA平板，連續(xù)2 次，以獲得純培養(yǎng)，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高溫酵母的篩選 從PDA斜面挑取酵母菌純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPD平板上，分別在37、40、 41、42、43、44、45、46、47℃下培養(yǎng) 48 h，觀察其生長狀況。通過菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、產(chǎn)生子囊孢子和擲孢子與否及是否形成假菌絲等進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理鑒定鑒定。

1.2.3 生化特征測試 進(jìn)行硝酸鹽還原試驗、糖發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、產(chǎn)類淀粉化合物測定。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 酵母菌基因組DNA模板按文獻(xiàn)［16］方法準(zhǔn)備并略作改動：從長出酵母菌菌落且經(jīng)4℃過夜的YEPD平板上挑取菌落，懸浮在100 μL滅菌去離子水中，放超低溫冰箱（-75℃）中凍透，然后取出放沸水中煮10 min，放-20℃保存?zhèn)溆谩?6S rDNA D1/D2區(qū)序列PCR擴(kuò)增引物為NL-1、NL-4［17］，擴(kuò)增程序為：94℃ 3 min；94℃ 40 s，48℃ 45 s，72℃ 45 s，5 個循環(huán)；94℃ 40 s，53℃ 45 s，72℃ 45 s，25 個循環(huán)；72℃ 8 min［18］。擴(kuò)增結(jié)果用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 測序及Blast比對分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交上海生工生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行Blast比對。

1.2.6 耐性測試 （1）耐糖性：制備初始糖濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的培養(yǎng)基，無菌操作接種耐高溫酵母，45℃培養(yǎng)24 h，在OD660下測其生物量。

（2）耐酸性：制備初始pH分別為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5的種子培養(yǎng)基，無菌操作接種耐高溫酵母，45℃培養(yǎng)24 h，在OD660下測其生物量。

（3）耐乙醇性：制備初始乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%的種子培養(yǎng)基，無菌操作接種耐高溫酵母，45℃培養(yǎng)24 h，在OD660下測其生物量。

1.2.7 產(chǎn)乙醇能力測試 乙醇發(fā)酵參照文獻(xiàn)［15］介紹的方法并略作改動：將YEPD斜面上活化的酵母菌株接種于2 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，分別在30℃和45℃、120 r/min條件下培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)接到10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中在30℃和45℃、120 r/min條件下培養(yǎng)18 h，再轉(zhuǎn)接到100 mL EFM培養(yǎng)基中在30℃和45℃、120 r/min條件下培養(yǎng)6 h，然后進(jìn)行厭氧發(fā)酵，72 h后取樣，用氣相色譜法測定發(fā)酵液的乙醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫酵母菌分離篩選

從供試土樣中共分離得到12株酵母菌，經(jīng)48 h耐高溫培養(yǎng)篩選，得到2株能耐45℃以上高溫的酵母菌，分別編號為Y1、Y2，在45℃時能正常生長，且Y1的長勢比Y2稍好。但在46、47℃溫度條件下兩菌株長勢弱、菌落小。

2.2 耐高溫酵母菌的形態(tài)及生理特征

菌株Y1、Y2在PDA平板上菌落大而突起，濕潤，圓形或橢圓形，表面光滑，無皺褶，邊緣整齊，乳白色；菌體細(xì)胞呈圓形或卵圓形，單邊芽殖或多邊芽殖。在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～15 d，結(jié)果在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上兩菌株均未見子囊孢子形成，而在胡蘿卜塊培養(yǎng)基上卻能形成子囊孢子；經(jīng)倒置培養(yǎng)觀察，兩菌株均不見產(chǎn)生擲孢子；在PDA平板上劃線蓋玻片壓片培養(yǎng)，顯微鏡觀察，Y1、Y2均能形成藕節(jié)狀假菌絲。

2.3 耐高溫酵母菌生化特征

糖發(fā)酵及碳源同化試驗表明，在9種供試糖或碳源中，除甘露糖外，在其余8種碳源上的Y1、Y2均表現(xiàn)一致（表1）；氮源利用試驗表明，在5種供試氮源中，Y1、Y2均可生長，只是在以KNO3為氮源時生長弱（表2）；硝酸鹽還原試驗測試，Y1、Y2均為陰性；產(chǎn)類淀粉化合物測定，菌落周圍均未呈現(xiàn)出藍(lán)色，結(jié)果為陰性；產(chǎn)酸試驗，菌落周圍的碳酸鈣未溶解，說明無酸產(chǎn)生。

表1 糖發(fā)酵及碳源同化結(jié)果

表2 氮源同化結(jié)果

2.4 26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增及測序比對分析

用26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增引物NL-1和NL-4［17］，擴(kuò)增到約600 bp大小的DNA條帶（圖 1），與付俊淑等［18］、馬凱等［19］、張曉娟等［20］、趙麗麗等［21］的報道基本一致。據(jù)劉寧等［22］報道，26S rDNA 的 D1/D2 區(qū)域位于大亞基的 5′端，序列長度在600 bp左右，說明本試驗已成功擴(kuò)增到了目的條帶。

圖1 酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交上海生工生物技術(shù)有限公司測序，Y1和Y2均獲得預(yù)期結(jié)果，登錄NCBI輸入測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，結(jié)果見表3。

表3 26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BLAST比對結(jié)果

利用Y1、Y2及其最高相似性菌株序列，并以Saccharomyces cerevisiae strain NL18（與Y1和Y2的相似性均為77%）作為參比菌株，用MEGA4.0中的鄰接法（重復(fù)值1 000）構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示，Y1、Y2及其最相似性菌株聚為一支，而Saccharomyces cerevisiae strain NL18 單獨(dú)一支。Kurtzman 等［17］對子囊菌綱近500種酵母菌的26S rDNAD1/D2區(qū)序列進(jìn)行了測定，認(rèn)為種內(nèi)序列變異≤1%，而種間序列差異＞1%。據(jù)此，Y1和Y2可分別歸類為東方伊薩酵母和庫德畢赤酵母。

圖2 根據(jù)酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 高溫酵母耐性測試

2.5.1 耐糖性 在初始糖濃度范圍內(nèi)，其糖濃度越高，OD660值就越大，但當(dāng)糖濃度達(dá)到并高于25%時出現(xiàn)抑制（表4），表明其耐糖性為25%，較劉暢等［23］報道的耐糖性（10%）高。

表4 初始糖濃度對酵母菌Y1、Y2生長（OD660值）的影響

2.5.2 耐酸性 耐酸性測試結(jié)果（表5）顯示，Y1和Y2菌株的最適pH=4，較劉暢等［23］的報道（pH 5.5）低。

2.5.3 耐乙醇性 在測試濃度下，Y1和Y2都隨初始乙醇濃度的升高，其OD值逐漸降低，Y1在8%及以上濃度時出現(xiàn)抑制作用，Y2在10%及以上出現(xiàn)抑制作用（表6），低于Atiya Techaparin等［2］報道的5株酵母菌（釀酒酵母KKU-VN8、KKU-VN20、KKU-VN27和庫德畢赤酵母KKU-TH33、KKU-TH43）13%的乙醇耐受水平。

表5 初始pH對酵母菌Y1、Y2生長（OD660值）的影響

表6 初始乙醇濃度對酵母菌Y1、Y2生長（OD660值）的影響

2.5.4 產(chǎn)乙醇性能 酵母菌Y1、Y2在不同溫度條件下發(fā)酵72 h后的乙醇產(chǎn)量（V/V）存在差異，在30℃下乙醇產(chǎn)量分別為3.8%、8.7%，45℃下分別為5.1%、9.8%，均高于30℃；Y2在兩種溫度條件下的乙醇產(chǎn)量均高于Y1，亦均高于劉超帝等［5］報道的耐高溫能力和乙醇發(fā)酵能力最強(qiáng)的馬克斯克魯維酵母（40℃、72 h，6.56%）。

3 結(jié)論與討論

本試驗經(jīng)分離、篩選得到2株耐高溫酵母菌Y1和Y2，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定Y1為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），Y2為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。Y1和Y2在45℃時均能正常生長，在46、47℃時能微弱生長，但其長勢明顯變?nèi)?，菌落形態(tài)也有明顯變化。就高溫下的長勢而言，Y1稍優(yōu)于Y2，說明Y1比Y2對高溫的耐受性能略強(qiáng)。耐性測試結(jié)果表明，初始糖濃度對兩株酵母菌的影響相差不大，在25%時出現(xiàn)抑制現(xiàn)象；初始乙醇濃度達(dá)8%時Y1出現(xiàn)抑制，初始乙醇濃度達(dá)10 % 時Y2出現(xiàn)抑制，說明Y2比Y1對乙醇的耐受性要好；Y1、Y2的最適pH均為4；Y1、Y2在45℃下的乙醇產(chǎn)量高于30℃，且Y2在兩種溫度條件下的乙醇產(chǎn)量均高于Y1。說明Y1、Y2可能具有潛在的利用價值，尤其是Y2有較好的乙醇發(fā)酵性能，通過誘變或原生質(zhì)體融合等技術(shù)提高其耐乙醇能力，可望獲得用于同步糖化乙醇發(fā)酵的優(yōu)良菌株。

耐高溫酵母一般從酒醅、腐爛的水果、熱帶溫泉土等環(huán)境樣品中篩選［23-25］。從酒糟堆放地土樣中篩選耐高溫酵母尚未見報道。常年堆放酒糟的土壤由于溫度較高，酒糟中的一些微生物如酵母菌等可進(jìn)入土壤中。本試驗結(jié)果表明，從酒糟堆放地土壤分離的酵母菌中篩選耐高溫酵母是可行的。

傳統(tǒng)權(quán)威的酵母菌鑒定方法是依據(jù)形態(tài)學(xué)及生理生化特征，可將待檢菌株分類到屬和種［26］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和一系列核酸數(shù)據(jù)庫的建立，通過核糖體RNA基因序列比對鑒定微生物菌種越來越盛行。鑒定酵母菌常用核糖體大亞基26S rRNA的D1/D2基因序列，該序列位于5′端。研究表明，26S rRNA的Dl/D2區(qū)域具有較高的變異率，同種不同菌株的堿基差異一般不超過1%［27］，而屬于不同種的菌株其核苷酸序列差異一般較大，根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，可以將絕大部分酵母鑒定到種。因此很多酵母菌的鑒定多用此分析方法［28-29］。該方法以通用引物擴(kuò)增26S rRNA D1/D2區(qū)基因并測序，然后利用核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析就可以對酵母菌進(jìn)行鑒定，其分辨率高于18S rRNA基因序列。該區(qū)域基因序列對未知菌種的快速鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建具有很大優(yōu)勢。我們根據(jù)26S rDNA D1/D2 區(qū)序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，并結(jié)合其形態(tài)學(xué)和生理生化特征，鑒定菌株Y1為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），Y2鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

耐性試驗表明，當(dāng)初始糖濃度達(dá)25%時分離菌株出現(xiàn)生長抑制，因此在進(jìn)行乙醇發(fā)酵性能測試時我們選擇含糖20%的發(fā)酵培養(yǎng)基；菌株生長的最適pH值為4，比徐大鵬等［14］、劉暢等［23］報道的低；當(dāng)初始乙醇濃度達(dá)8%時Y1出現(xiàn)抑制，10%時Y2出現(xiàn)抑制，均比劉暢等［23］報道的低，但均比徐大鵬等［14］報道的高。酵母菌發(fā)酵過程產(chǎn)生的乙醇，當(dāng)達(dá)到一定濃度時，抑制其生長發(fā)育并影響乙醇產(chǎn)率［30］，因此對乙醇的耐受能力也是篩選乙醇高產(chǎn)菌株的前提條件之一。乙醇發(fā)酵試驗表明兩菌株在45℃條件下的乙醇產(chǎn)量都比30℃高，說明高溫有利于乙醇發(fā)酵，尤其是Y2的乙醇發(fā)酵性能更勝一籌。這是耐高溫酵母可用于同步糖化發(fā)酵的潛在優(yōu)勢。

據(jù)孫劍秋等［31］報道，東方伊薩酵母、庫德畢赤酵母和釀酒酵母可能在白酒釀造過程中發(fā)揮更重要的作用。劉婷婷［32］通過研究發(fā)現(xiàn)，東方伊薩酵母是兼香型白酒白云邊酒發(fā)酵堆積料和出池酒醅中的優(yōu)勢菌，而庫德畢赤酵母是香型獨(dú)特的衡水老白干大曲中特有的重要功能菌之一。本試驗從茅臺酒酒糟堆放地土壤中分離到東方伊薩酵母和庫德畢赤酵母，說明東方伊薩酵母和庫德畢赤酵母在多種香型白酒釀造和風(fēng)味成型過程中可能都起一定作用。

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