德國(guó)進(jìn)境海棠樹(shù)根際中厚皮擬毛刺線蟲(chóng)的鑒定

宋紹祎，劉靜遠(yuǎn)，徐沈裕，戚龍君，于 翠，易建平

（上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

德國(guó)進(jìn)境海棠樹(shù)根際中厚皮擬毛刺線蟲(chóng)的鑒定

宋紹祎，劉靜遠(yuǎn)，徐沈裕，戚龍君，于 翠，易建平*

（上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

從上海口岸進(jìn)境的德國(guó)海棠景觀樹(shù)根際分離到1種擬毛刺屬線蟲(chóng)。雌蟲(chóng)雙生殖腺對(duì)伸，受精囊無(wú)，精子分布于子宮內(nèi)；陰門孔狀，陰門骨化結(jié)構(gòu)小，圓三角形到橢圓形，微分離。雄蟲(chóng)腹中頸乳突1個(gè)，位于排泄孔前；精子大，胞核香腸形；交合刺末端微腹彎，桿區(qū)有橫紋；交合傘狹窄；泄殖腔前有3個(gè)腹中交配乳突。厚皮擬毛刺線蟲(chóng)特異引物UNIVERSAL-F/PACHYREV2-R檢測(cè)為PCR陽(yáng)性，其18S序列與GenBank中厚皮擬毛刺線蟲(chóng)的序列相似性為99.30%—100%，序列差異為0—4 bp?；?8S序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示該種線蟲(chóng)與厚皮擬毛刺線蟲(chóng)位于同一聚類組內(nèi)。經(jīng)形態(tài)分類鑒定、PCR檢測(cè)和序列分析，將此線蟲(chóng)鑒定為厚皮擬毛刺線蟲(chóng)Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus。這是我國(guó)口岸首次截獲該種線蟲(chóng)。

厚皮擬毛刺線蟲(chóng)；傳毒種；系統(tǒng)發(fā)育；鑒定

毛刺屬和擬毛刺屬線蟲(chóng)是一類重要的植物根部遷移性外寄生線蟲(chóng)，可影響根系生長(zhǎng)，甚至引起根部生長(zhǎng)停滯，導(dǎo)致植物產(chǎn)生短粗根?。╯tubby root disease）［1-4］。屬內(nèi)的許多種線蟲(chóng)還是一些植物病毒的傳播介體，可使許多經(jīng)濟(jì)作物如果樹(shù)、蔬菜、農(nóng)作物、花卉等造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)已將此類傳毒線蟲(chóng)列入進(jìn)境植物檢疫性有害生物名單。如：厚皮擬毛刺線蟲(chóng)是煙草脆裂病毒（TRV）和豌豆早褐病毒（PEBV）的傳播介體，主要通過(guò)帶根苗木、土壤及介質(zhì)土傳播，主要分布在歐洲的部分國(guó)家，如英國(guó)、愛(ài)爾蘭、比利時(shí)、德國(guó)、瑞士、法國(guó)、意大利、荷蘭等，我國(guó)僅在廣東有分布［5-7］。該類線蟲(chóng)食性雜，不但直接取食為害寄主植物，而且具有傳毒能力，危害較大。

2015年5月，上海出入境檢驗(yàn)檢疫局從德國(guó)進(jìn)境海棠景觀樹(shù)根際截獲一種擬毛刺屬線蟲(chóng)，并進(jìn)行了形態(tài)特征觀察、PCR檢測(cè)和序列分析，現(xiàn)將鑒定過(guò)程報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲(chóng)分離

從進(jìn)境大型海棠景觀樹(shù)根際深處多點(diǎn)采樣，土壤樣品約2 kg。室內(nèi)采用淺盤法分離線蟲(chóng)，將樣品置于淺盤中室溫浸泡過(guò)夜，500目網(wǎng)篩分離線蟲(chóng)，在體視顯微鏡下鏡檢。

1.2 形態(tài)學(xué)特征觀察

挑取線蟲(chóng)制成臨時(shí)玻片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)特征觀察、測(cè)量及拍照，并采用de Man公式對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)計(jì)。

1.3 DNA提取

挑取單條線蟲(chóng)，滅菌水洗滌3次，用挑針捅破或割成多段，使用DNeasy Blood＆Tissue Kit（Qiagen）提取線蟲(chóng)DNA，提取方法按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，獲得擬毛刺屬線蟲(chóng)樣本7520的DNA。

1.4 PCR檢測(cè)

使用厚皮擬毛刺線蟲(chóng)特異引物UNIVERSAL-F（5’-cccgtcgctactaccgatt-3’）/PACHYREV2-R（5’-gcgtacgggcaatacgatac-3’）采用PCR方法擴(kuò)增線蟲(chóng)DNA［8］。PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR Buffer（Mg2＋free）2.5μL，Mg2＋（25 mmol/L）2μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2μL，引物（5μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4μL，ddH2O 16.1μL，總體積25μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃3 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為329 bp［8］。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中電泳，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.5 18S序列擴(kuò)增和分析

使用通用引物1091-F（5’-aggaattgacggaagggcac-3’）/1671-R（5’-tcctctaagtaa atcccattgg-3’）擴(kuò)增線蟲(chóng)DNA的18SRNA部分序列［9-10］，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同1.4，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，序列核實(shí)拼接后和GenBank中相關(guān)種序列進(jìn)行比對(duì)分析。基于18S序列，利用MEGA 4.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)計(jì)值

厚皮擬毛刺線蟲(chóng)德國(guó)群體雄蟲(chóng)、雌蟲(chóng)的測(cè)計(jì)值見(jiàn)表1及表2。

表1 厚皮擬毛刺線蟲(chóng)（雄蟲(chóng)）德國(guó)群體與其他群體的測(cè)計(jì)值比較Table 1 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♂）and other P.pachydermus（♂）population

表1 厚皮擬毛刺線蟲(chóng)（雄蟲(chóng)）德國(guó)群體與其他群體的測(cè)計(jì)值比較Table 1 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♂）and other P.pachydermus（♂）population

注：長(zhǎng)度測(cè)量單位為μm

表2 厚皮擬毛刺線蟲(chóng)（雌蟲(chóng)）德國(guó)群體與其他群體的測(cè)計(jì)值比較Table 2 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♀）and other P.pachydermus（♀）population

表2 厚皮擬毛刺線蟲(chóng)（雌蟲(chóng)）德國(guó)群體與其他群體的測(cè)計(jì)值比較Table 2 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♀）and other P.pachydermus（♀）population

注：長(zhǎng)度測(cè)量單位為μm

2.2 形態(tài)描述

雄蟲(chóng)（圖1）：熱殺死后角質(zhì)層顯著膨脹。唇區(qū)圓，具稍凸起的乳突。瘤針背弓，前部有誘導(dǎo)環(huán)。腹中頸乳突1個(gè)，位于排泄孔之前；排泄孔位于咽（食道）球的前端。腸前伸背覆蓋咽球，咽球內(nèi)有5個(gè)核。單精巢，前伸，精子橢圓形，精子細(xì)胞核臘腸形。交合刺細(xì)長(zhǎng)，末端微腹彎，桿部圓柱形，桿區(qū)有橫紋，引帶與交合刺平行。交合傘狹窄，泄殖腔前有3個(gè)腹中交配乳突，SP1、SP2位于交合刺收縮區(qū)，SP3位于交合傘前區(qū)，相距遠(yuǎn)。亞腹交配乳突2對(duì)，第1對(duì)位于肛門后，不明顯；第2對(duì)位于尾孔前，較大。尾長(zhǎng)與肛門處體寬幾乎等長(zhǎng)。

雌蟲(chóng)（圖2）：熱殺死后角質(zhì)層顯著膨脹。體前部類似于雄蟲(chóng)。雙生殖腺、對(duì)伸，受精囊無(wú)，精子分布于子宮內(nèi)。陰門位于蟲(chóng)體中部稍后，陰門后觀察到3個(gè)側(cè)體孔。陰道近圓形，深度約為體寬的l／3。陰門孔狀（腹面觀），側(cè)面觀陰門骨化結(jié)構(gòu)小，圓三角形到橢圓形，微分離。肛門近尾端，尾非常短，鈍圓形。

圖1 厚皮擬毛刺線蟲(chóng)（雄蟲(chóng)）形態(tài)特征Fig.1 M orphological characters of P.pachydermus（）

圖2 厚皮擬毛刺線蟲(chóng)（雌蟲(chóng)）形態(tài)特征Fig.2 M orphological characters of P.pachydermus（）

2.3 PCR檢測(cè)

線蟲(chóng)樣本7520的DNA用厚皮擬毛刺線蟲(chóng)特異引物UNIVERSAL-F/PACHYREV2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得329 bp的特異性DNA片段，空白對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3）。試驗(yàn)結(jié)果表明：線蟲(chóng)樣本7520為厚皮擬毛刺線蟲(chóng)PCR陽(yáng)性。

2.4 18S序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

引物1091-F/1671-R擴(kuò)增線蟲(chóng)樣本7520的DNA獲得18S部分序列，長(zhǎng)度為570 bp，GenBank登錄號(hào)為KU052863，與GenBank中厚皮擬毛刺線蟲(chóng)P.pɑchydermus相關(guān)序列（FJ040483，AJ439574，AJ439512，JN123367，DQ345525，AF036601）的相似性為99.30%—100%，序列差異為0—4 bp。

根據(jù)GenBank中厚皮擬毛刺線蟲(chóng)及其近似種18S序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，線蟲(chóng)樣本7520與P.pɑchydermus位于同一聚類組內(nèi)（圖4）。

圖4 基于厚皮擬毛刺線蟲(chóng)18S序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 18S sequences of P.pachydermus（Neighbour-Joining，NJ）

2.5 鑒定結(jié)果

根據(jù)Decraemer等［12-13］建立的毛刺科線蟲(chóng)形態(tài)分類多歧檢索表，本研究中德國(guó)群體的鑒定代碼為：雌蟲(chóng)D1-C1-L2-K2-A2（3）-B2-E2-F3-G1-H3-I1-J19-M1-N1-O2-P1-Q1-R2-S1，雄蟲(chóng)F3-D1-P1-A2-B2-C2-E0-G2-H2-I3（1）-J2-K3-L2-M2/7-N1-O1，在多歧檢索表中對(duì)應(yīng)的線蟲(chóng)種類均為厚皮擬毛刺線蟲(chóng)。進(jìn)一步分析，該德國(guó)群體的形態(tài)特征與已報(bào)道的厚皮擬毛刺線蟲(chóng)形態(tài)特征基本一致，因此將其鑒定為厚皮擬毛刺線蟲(chóng)；結(jié)合PCR檢測(cè)和序列分析結(jié)果，確認(rèn)德國(guó)進(jìn)境海棠景觀樹(shù)根際截獲的擬毛刺屬線蟲(chóng)為厚皮擬毛刺線蟲(chóng)（Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus Siddiqi，1974）。

3 討論

18S序列分析結(jié)果表明：厚皮擬毛刺線蟲(chóng)德國(guó)群體與P.mɑcrostylus進(jìn)化關(guān)系很近，其與P.mɑcrostylus（AJ439621，AJ439507，AJ439622）的序列相似性為99.82%，序列差異為1 bp（569/570）；與西班牙擬毛刺線蟲(chóng)P.hispɑnus（AJ439577）的序列相似性為98.95%，序列差異為6 bp（564/570）；與胼胝擬毛刺線蟲(chóng)P. porosus（DQ345524）的序列相似性為96.49%，序列差異為20 bp（550/570）。

毛刺科線蟲(chóng)是世界性分布的一類植物寄生線蟲(chóng)，在歐洲和北美的分布最為廣泛［2，6］，其傳播病毒造成的損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于線蟲(chóng)本身取食造成的危害，因此其作為傳毒線蟲(chóng)引起了多國(guó)的重點(diǎn)關(guān)注。自1960年報(bào)道厚皮擬毛刺線蟲(chóng)可以傳播煙草脆裂病毒以來(lái)，已證實(shí)毛刺屬5種及擬毛刺屬10種線蟲(chóng)為傳毒種類［2］。

近年來(lái)，隨著國(guó)際間貿(mào)易往來(lái)的日益頻繁，進(jìn)出境種苗及其植物繁殖材料越來(lái)越多，各種植物病害尤其是線蟲(chóng)病害傳播的機(jī)會(huì)大大增加。如1989年發(fā)現(xiàn)于美國(guó)弗羅里達(dá)州櫟屬植物根圍的Trichodorus velɑtus是隨人事操作從歐洲傳入本土的，中美和南美報(bào)道的毛刺科線蟲(chóng)是隨外來(lái)植物的引進(jìn)而帶入本土的，其中較多種屬于擬毛刺屬［2］。一旦檢疫性傳毒線蟲(chóng)隨進(jìn)境種苗傳入我國(guó)，將給我國(guó)農(nóng)林生產(chǎn)部門帶來(lái)嚴(yán)重威脅。

目前，擬毛刺屬的形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)Decraemer等［12-13］的多歧檢索表初步確認(rèn)到種，再結(jié)合具體形態(tài)學(xué)特征進(jìn)一步確定，要求鑒定人員具有良好的分類學(xué)基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)在植物線蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用愈來(lái)愈多，線蟲(chóng)學(xué)家已開(kāi)始嘗試采用分子方法來(lái)研究該類線蟲(chóng)。本研究詳細(xì)描述了厚皮擬毛刺線蟲(chóng)形態(tài)特征和分子檢測(cè)技術(shù)，旨在為該種類線蟲(chóng)的檢疫鑒定提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Identification of Paratrichodorus pachydermus in the rhizosphere of cherry-app le tree im ported from Germany

SONG Shao-yi，LIU Jing-yuan，XU Shen-yu，QILong-jun，YU Cui，YIJian-ping*
（Shɑnghɑi Entry-Exit Inspectionɑnd Quɑrɑntine Bureɑu，Shɑnghɑi200135，Chinɑ）

One species of Pɑrɑtrichodorus nematode was isolated from rhizosphere of cherry-apple tree imported from Germany at Shanghai Port.Female nematode was didelphic，lack of spermatheca.Its sperm was dispersed throughout the uterus and pore-like vulva rounded triangular or oval，with small vaginal sclerotized pieces.Male nematode had one ventromedian cervical papillae in front of excretory pore，large sperm cells with large sausage-shaped nucleus，distal end of spicule nearly straight，spicules shaft with striation，arrow bursa and three ventromedian precloacal supplements.PCR amplification was positive with specific primers for P. pɑchydermus.Sequence analysis revealed that its 18S-sequence had 99.30%—100%identity with P. pɑchydermus in GenBank.Phylogenetic tree of the 18S sequences showed this species clustered with P. pɑchydermus.Based on the morphological characteristics，PCR detection and sequence analysis，this kind of nematode was identified as P.pɑchydermus.This is the first report of interception of P.pɑchydermus in China.

Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus；Virus-vector；Phylogeny；Identification

S41；S685

A

1000-3924（2017）01-079-05

2015-09-29

上海出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目（HK004-2014）；上海市綠化和市容管理局攻關(guān)項(xiàng)目（G152427）

宋紹祎（1971—），女，本科，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事檢疫性線蟲(chóng)的檢測(cè)鑒定。E-mail：songsy＠shciq.gov.cn

*通信作者，Tel：021-38620575，E-mail：yijp＠shciq.gov.cn