陸地棉m iR397b的生化功能驗(yàn)證

丁 妍，王燕美，劉進(jìn)元

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物學(xué)研究中心植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084）

陸地棉m iR397b的生化功能驗(yàn)證

丁 妍，王燕美，劉進(jìn)元*

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物學(xué)研究中心植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084）

植物中的漆酶（LAC）作為藍(lán)銅氧化酶家族的一個(gè)分支，可以聚合木質(zhì)素單體形成木質(zhì)素。擬南芥、番茄中miR397b可以調(diào)控LAC蛋白家族的表達(dá)，但驗(yàn)證棉花中miR397b生化功能的相關(guān)報(bào)道目前尚無。選取開花后25 d的陸地棉纖維材料，通過RLM-5’RACE試驗(yàn)，驗(yàn)證了對GhLAC4 mRNA的切割發(fā)生在miR397b和GhLAC4的互補(bǔ)區(qū)域，即證明了GhLAC4是miR397b的靶基因。本研究預(yù)示著GhmiR397b可能參與棉花纖維中木質(zhì)素的形成過程，為研究GhLAC4在棉花纖維發(fā)育過程中的調(diào)控作用提供了基礎(chǔ)。

陸地棉；纖維發(fā)育；miR397b；GhLAC4；靶基因；生化功能；降解

漆酶（laccase enzymes，LAC）是一種能夠結(jié)合多個(gè)銅離子的酚氧化酶［1］，可以把苯二酚氧化成苯醌，同時(shí)生成水；在生物體內(nèi)，一些漆酶可以聚合木質(zhì)素單體形成木質(zhì)素［2］。漆酶最先在漆樹中被發(fā)現(xiàn)［3］，因?yàn)閱误w被它催化聚合形成的木質(zhì)素屬于維管系統(tǒng)［4-5］，所以在高等植物中廣泛表達(dá)［6］。此外，在昆蟲、微生物等多種生物中也發(fā)現(xiàn)了漆酶［2，5，7］。在擬南芥中有17種漆酶家族蛋白［7］，其中LAC4、LAC11、LAC15、LAC17共4種漆酶蛋白參與木質(zhì)素的合成［8-10］。雖然植物中漆酶參與木質(zhì)素生物合成有據(jù)可查，但是與漆酶調(diào)控有關(guān)的生理功能有待探究。

MicroRNA是一類由21—24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈小分子RNA［11］，可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控目的基因表達(dá)［12］，是植物對其生長發(fā)育及生理代謝調(diào)控的一種重要方式［13-15］。在現(xiàn)在已知的miRNA中，擬南芥中miR397、miR408、miR857，水稻中miR528已被證實(shí)可以調(diào)控漆酶的表達(dá)［16-17］，說明植物中木質(zhì)素在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平上受miRNA調(diào)控。

MicroRNA中的miR397家族是漆酶的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，但是具體靶向作用未得到證實(shí)。楊樹中miR397a是LAC的負(fù)調(diào)控因子，預(yù)示著在木質(zhì)形成過程中miRNA對木質(zhì)素的形成有調(diào)控作用［10］。水稻中miR397通過負(fù)調(diào)控LAC基因的表達(dá)，影響對植株油菜素甾醇的敏感性，從而影響種子顆粒大小［18］，這說明由miRNA調(diào)控的漆酶表達(dá)可能在木質(zhì)素合成以外的其他生物過程中起作用［19］，增加了研究miRNA對LAC家族基因表達(dá)調(diào)控的重要性。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測［17，20］，擬南芥中miR397可能直接切割LAC2、LAC4、LAC17 mRNA［1，7，21］，但是并未得到證實(shí)。

棉花屬于經(jīng)濟(jì)作物，不僅是天然纖維的最重要來源，也是一種重要的模式生物，在植物研究尤其是單子葉植物研究中占有重要的地位［22］。棉纖維的發(fā)育過程中已有深入研究［23-25］，雖然木質(zhì)化程度高，但是其中關(guān)于miRNA切割LACmRNA的研究甚少。為了研究棉花纖維中LAC是否是miR397b的靶基因，本研究以陸地棉（Gossypium hirsutum）開花后第25天纖維為材料，利用RLM-5’RACE試驗(yàn)方法，在體外檢測GhmiR397b能否切割降解GhLAC4 mRNA。結(jié)果表明：GhLAC4 mRNA在與miR397b的配對區(qū)域的5’端第10個(gè)核苷酸處被降解，說明GhLAC4是GhmiR397b的靶基因，揭示了GhmiR397b對GhLAC4基因的切割作用。本研究的結(jié)果可為研究miRNA調(diào)控棉花纖維細(xì)胞生長發(fā)育提供有力線索。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花品種為陸地棉‘中棉35’（Gossypium hirsutum.cv CRI35），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供；克隆載體pEasy Blunt Simple、感受態(tài)細(xì)菌Trans1-T1、Ex Taq、DNase、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶以及Real-time試劑盒購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit（AMV）購于上海生物工程公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、植物總RNA提取試劑盒、DNA marker購自北京Tiangen公司；RLM-5’RACE試劑盒First Choice?RLM-RACE Kit購自Ambion公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純以上。引物合成以及克隆載體測序在上海生工生物技術(shù)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉花纖維細(xì)胞總RNA提取

摘取棉花開花后25 d棉桃，迅速置于液氮中冷凍，在液氮中充分研磨纖維，提取總RNA。確?？俁NA不降解是本試驗(yàn)可靠性和成功率的關(guān)鍵所在，由于空氣中含有RNA降解酶，提取總RNA、富集mRNA和反轉(zhuǎn)錄形成cDNA的試驗(yàn)中幾乎所有器具都要保證RNase-free。

1.2.2 mRNA的富集

mRNA富集的原理是Oligo（dT）纖維素（以下簡稱纖維素）含有的多聚dT可以與mRNA 3’末端的polyA尾結(jié)合，從而吸附并富集mRNA。

1.2.3 植物RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit（AMV）反轉(zhuǎn)錄富集后的mRNA，按照說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：50℃30 h；95℃5 min。

1.2.4 RLM-5’RACE試驗(yàn)

用Tdt酶向cDNA 5’端連接dATP，條件為37℃30 min。然后用PCR法把5’RACE接頭（5’-GCTGATGGCGATGAATGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATGATTTTTTTTTTTTT-3’）與poly dATP連接，該連接反應(yīng)的條件：95℃5 min，40℃30 s，72℃10 min，1個(gè)循環(huán)。接著以cDNA第一條鏈作模板，以5’端外側(cè)引物和3’端外側(cè)引物（表1）進(jìn)行第一輪巢式PCR擴(kuò)增。以第一輪巢式PCR產(chǎn)物為模板，以5’端內(nèi)側(cè)引物和3’端內(nèi)側(cè)引物（表1）進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增。

表1 RLM-5’RACE試驗(yàn)引物序列Table 1 Prim er sequence for RLM-5’RACE

1.2.5 電泳檢測及PCR產(chǎn)物回收

為了更好區(qū)分目的片段，用2%瓊脂糖凝膠和DL2000 DNAmarker檢測PCR結(jié)果，如果DNA條帶大小符合預(yù)期，則可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用2%濃度的瓊脂糖凝膠和DL2000 DNAmarker對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用120 V電壓40 min，用成像系統(tǒng)保存圖像，切取目標(biāo)條帶進(jìn)行回收PCR產(chǎn)物回收。

1.2.6 連接克隆載體

把回收得到的靶標(biāo)基因DNA連接到克隆載體pEASY-Blunt Simple上。按照說明書構(gòu)建連接體系，連接條件為25℃，反應(yīng)時(shí)間30 min。

1.2.7 轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒

將連接產(chǎn)物加入30μL Trans-T1感受態(tài)中，冰上靜置30 min。42℃熱激90 s，立即放于冰上3 min。然后加1 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃搖動培養(yǎng)1 h。把8μL 500 mM IPTG溶液與40μL 20 mg/mL X-gal溶液混合后，均勻地涂在含氨芐青霉素和卡納青霉素抗性的平板上培養(yǎng)基上。待IPTG、X-gal被吸收后，1 mL LB液體培養(yǎng)基（含轉(zhuǎn)化菌）4 000 r/min離心1 min，棄置部分上清液。保留200μL上清用來懸浮菌體，取150μL全部菌液涂板，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.8 陽性菌落篩選

挑取單菌落，各自加入1 mL含氨芐青霉素和卡納青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)1 h。用菌落PCR法篩選陽性菌，即在普通PCR體系的基礎(chǔ)上，DNA來源為少量菌液。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落PCR產(chǎn)物，如果條帶大小符合預(yù)期，則可以過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。

1.2.9 提取質(zhì)粒并測序

用堿裂解法提取菌液的質(zhì)粒，進(jìn)行測序。如果測序結(jié)果表明GhLAC4 mRNA被切割的位點(diǎn)在與GhmiR397b互補(bǔ)序列的3’端第10個(gè)核苷酸附近，則說明GhLAC4是GhmiR397b的靶基因。

1.2.10 小RNA文庫的構(gòu)建和Illumina測序

以陸地棉開花后第5天、第10天、第15天、第20天、第25天纖維的RNA為材料，各自用10μg來構(gòu)建小RNA文庫。操作流程為：（1）用15%的變性PAGE分離純化18—30個(gè)核苷酸的小RNA；（2）連接5’RNA接頭（5’GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC）；（3）連接3’RNA接頭（5’UCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGU）；（4）根據(jù)3’RNA接頭序列設(shè)計(jì)引物（5’CAAGCAGAAGACGGC-ATACGA）反轉(zhuǎn)錄小RNA，合成cDNA鏈；（5）再根據(jù)5’和3’RNA接頭序列設(shè)計(jì)引物（5’AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，5’CAAGCAGAAGACGGCATACGA），以上述步驟的cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后純化PCR產(chǎn)物，構(gòu)建測序庫；（6）通過接頭序列將測序庫中的片段連接到光學(xué)透明的玻璃表面上，橋式PCR擴(kuò)增形成數(shù)以億計(jì)的簇，每個(gè)簇都具有數(shù)千份相同模板；（7）利用Illumina Hiseq 2000測序儀，通過四種熒光標(biāo)記染，通過可終止性的邊合成邊測序技術(shù)進(jìn)行測序（測序引物5’CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC），通過CCD采集熒光信號，合成一個(gè)堿基的同時(shí)即將生成光信號轉(zhuǎn)換為核酸信息。

1.2.11 測序結(jié)果的初步處理及miR397b豐度檢測

通過高通量測序得到的小RNA序列在獲得高質(zhì)量讀數(shù)之前，需要先去掉低質(zhì)量讀數(shù)。所謂高質(zhì)量讀數(shù)，一般認(rèn)為1—30個(gè)堿基中不含N（無法辨別堿基種類時(shí)，用N表示）、質(zhì)量值低于10的位點(diǎn)不超過4個(gè)且質(zhì)量值低于13的位點(diǎn)不超過6個(gè)的片段為高質(zhì)量序列。獲得高質(zhì)量序列之后，去掉小于18個(gè)核苷酸的小片段、接頭序列、polyA序列，剩余的序列就是清潔讀數(shù)（Lean reads）。

把清潔讀數(shù)和miRBase中所有的miRNA序列進(jìn)行比對，如果miRNA序列庫中的序列與已知的GhmiRNA397b的序列的錯配數(shù)小于等于2個(gè)，則認(rèn)為該序列即為GhmiRNA397b。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhLAC4 mRNA 5’端殘余片段的電泳檢測

如前所述，植物中miR397b可以調(diào)控LAC4的表達(dá)，且陸地棉中GhLAC4 mRNA與GhmiR397b存在互補(bǔ)序列，由此預(yù)測GhmiR397b可能通過與GhLAC4 mRNA的互補(bǔ)序列相互識別，GhmiR397b對GhLAC4 mRNA進(jìn)行切割。

在植物中，miRNA對靶基因mRNA的進(jìn)行切割的位點(diǎn)具有一定的規(guī)律。這個(gè)切割位點(diǎn)通常位于mRNA與miRNA的互補(bǔ)區(qū)域，具體在miRNA 5’端第10個(gè)和第11個(gè)核苷酸之間。通過RLM-5’RACE試驗(yàn)，把GhLAC4 mRNA被降解后的殘余片段在體外逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過巢式PCR擴(kuò)增得到電泳條帶。瓊脂糖電泳結(jié)果（圖1）顯示，通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得的片段大小約為430 bp，說明GhLAC4 mRNA被切割的位點(diǎn)在GhmiR397b與GhLAC4 mRNA互補(bǔ)區(qū)域附近，符合本研究的預(yù)期。這符合miRNA降解規(guī)律，說明GhLAC4是miRNA的靶基因。

2.2 GhLAC4 m RNA 5’端殘余片段擴(kuò)增后的測序結(jié)果

把上述帶有約為430 bp擴(kuò)增條帶的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果（圖2）顯示，GhLAC4 mRNA的切割位點(diǎn)在與GhmiR397b互補(bǔ)序列的3’端第10個(gè)核苷酸處。箭頭表示發(fā)生降解的位點(diǎn)，數(shù)值表示該處發(fā)生降解的克隆數(shù)與測序的克隆總數(shù)的比值。實(shí)線表示TC279559（GhLAC4）mRNA與GhmiR397b序列堿基互補(bǔ)配對完全正確，虛線表示堿基互補(bǔ)配對有誤。

在RLM-5’RACE試驗(yàn)中，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期，且測序結(jié)果表明擴(kuò)增的GhLAC4殘余片段的被降解位點(diǎn)在與miR397b互補(bǔ)序列的5’端第10個(gè)核苷酸處，符合miRNA降解規(guī)律，為GhLAC4是GhmiR397b的靶基因提供了有力證據(jù)。

圖1 GhLAC4 mRNA 5’端殘余片段的瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of GhLAC4 mRNA 5’cleavage fragm ents

圖2 Ghm iR397b對TC279559（GhLAC4）mRNA靶向降解作用示意圖Fig.2 The cleavage site of TC279559（GhLAC4）mRNA targeted by GhmiR397b

2.3 棉花纖維發(fā)育過程中Ghm iR397b的豐度變化

miRNA歸一化讀?。≧eads per ten million，RPTM）是每一千萬個(gè)清潔讀數(shù)中目標(biāo)miRNA的個(gè)數(shù)，被用來評估每個(gè)miRNA的相對豐度。實(shí)際計(jì)算和比較中，由于miRNA的歸一化讀數(shù)數(shù)字較大，常用log2RPTM表示miRNA的豐度。

由圖3可見，棉花纖維發(fā)育過程中，隨著開花后天數(shù)增加，GhmiR397b的豐度存在變化。開花后第5天、第10天棉花纖維細(xì)胞中GhmiR397b豐度較高，第15天、第20天、第25天時(shí)GhmiR397b豐度較高逐漸下降。

在棉花纖維發(fā)育過程中，開花后第0—5天胚珠表皮細(xì)胞發(fā)育成纖維，即第5天時(shí)所需LAC4表達(dá)量較少，這與GhmiR397b較高的豐度相符合；第5—25天纖維細(xì)胞快速伸長，木質(zhì)素越到后期越需大量合成［26］，即需要LAC4表達(dá)量越來越多，這與GhmiR397b較豐度逐漸減少相符合。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，水稻中miR397可以通過負(fù)調(diào)控LAC基因表達(dá)，影響對植株油菜素甾醇的敏感性，過表達(dá)OsmiR397能夠增加種子大小、促進(jìn)圓錐花序分枝和增加主穗粒數(shù)，從而使得田間試驗(yàn)中谷?？偖a(chǎn)量增加25%［18］，這些研究增加了miR397調(diào)控LAC基因表達(dá)的重要性。另外，生物信息學(xué)的方法預(yù)測出擬南芥中miR397可能切割LAC2、LAC17 mRNA，miR397調(diào)控LAC基因表達(dá)的研究仍然需要進(jìn)一步深入。

在RLM-5’RACE試驗(yàn)中，靶基因mRNA被降解后的殘余片段很少，很多情況下即使有殘余片段也很難檢測出來，造成假陰性結(jié)果，這也是RLM-5’RACE試驗(yàn)雖然能直接證明靶向降解作用，但是并未被廣泛使用的重要原因。本試驗(yàn)對RLM-5’RACE試驗(yàn)做出了重要改進(jìn)，即在提取總RNA之后，通過富集mRNA增加mRNA的純度，從而增加靶基因mRNA被降解后的殘余片段被正確擴(kuò)增的可能性。RLM-5’RACE試驗(yàn)技術(shù)如果被進(jìn)一步改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)miRNA在靶基因上的降解位點(diǎn)的批量、快速、準(zhǔn)確檢測，會是miRNA的功能研究的一個(gè)強(qiáng)有力的助力。

圖3 陸地棉纖維細(xì)胞發(fā)育過程中m iR397b的豐度變化Fig.3 Content variation ofm iR397b at different fiber developm ental stages

3 結(jié)論

本研究以陸地棉‘中棉35’纖維為材料，提取中RNA后在體外把GhLAC4被割的殘余片段逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用RLM-5’RACE方法進(jìn)行擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期，且測序結(jié)果表明GhLAC4 mRNA的切割位點(diǎn)在與GhmiR397b互補(bǔ)序列的5’端第10個(gè)核苷酸處，且GhmiR397b的豐度變化與木質(zhì)素含量變化有一定負(fù)相關(guān)關(guān)系，這些分析結(jié)果都為GhLAC4是GhmiR397b的靶基因提供了有力證據(jù)，預(yù)示著miR397b在棉花纖維中木質(zhì)素的形成過程中起調(diào)控作用。本研究的結(jié)果可為miRNA調(diào)控棉花纖維細(xì)胞生長發(fā)育的分子機(jī)制研究提供了有力線索。

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（責(zé)任編輯：張睿）

Identification of the biochemical function of miR397b in Gossypium hirsutum

DING Yan1*，WANG Yan-mei1，LIU Jin-yuan1
（Lɑborɑtory of Plɑnt Moleculɑr Biology，Center for Plɑnt Biology，School of Life Sciences，TsinghuɑUniversity，Beijing 100084，Chinɑ）

It is reported that plant laccase enzymes（LAC），amember of the blue copper oxidase family，can polymerize lignin monomers into lignin.miR397b plays a role in the expression of LAC protein family in Arɑbidopsis and Lycopersicon.However，there is no report about biochemical identification ofmiR397b function.In this study，RLM-5’RACE experiment was carried out on the cotton fiber sampled at 25 days post-anthesis in vitro，and itwas validated that cleavage of GhLAC4 transcripts wasmediated by miR397b via a complementary region between them，and GhLAC4 was the targeted gene of GhmiR397b.These results suggested thatGhmiR397b might be involved in the lignin formation in cotton fiber，and provided an evidence for studies on the regulation role of GhmiR397b during cotton fiber development.

Gossypium hirsutum；Fiberdevelopment；miR397b；GhLAC4；Target gene；Biochemical function；Cleavage

S562

A

1000-3924（2017）01-010-05

2016-05-14

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2010CB126003）；國家轉(zhuǎn)基因動植物研究項(xiàng)目（2011ZX08005-003，2011ZX08009-003）作者簡介：丁妍（1989—），女，碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)。E-mail：dingyan101＠163.com

*通信作者，E-mail：liujy＠m(xù)ail.tsinghua.edu.cn