MALDI-TOF MS技術在病原菌檢測與鑒定中的應用研究

王海花 ， 張曉峰 ， 苗 麗

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院河南鄭州450046 ; 2.河南出入境檢驗檢疫局河南鄭州450003)

MALDI-TOF MS技術在病原菌檢測與鑒定中的應用研究

王海花1， 張曉峰1， 苗 麗2

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院河南鄭州450046 ; 2.河南出入境檢驗檢疫局河南鄭州450003)

病原微生物引起的動物疾病不僅嚴重影響到動物的經(jīng)濟價值也威脅著人類健康， 隨著近年來抗菌藥物的濫用導致多種細菌耐藥以及部分新型細菌的出現(xiàn)使形勢更加嚴峻。傳統(tǒng)的微生物鑒定方法主要有表型的檢測，包括革蘭染色、微生物分離培養(yǎng)和生化試驗等，因時間較長、鑒定范圍窄，影響了病原微生物鑒定的速度和準確性，在一定程度上影響了疾病的控制。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的應用于微生物快速檢測的一項技術。基于繪制微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜與已知標準微生物的蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫進行比較達到鑒定的目的。不同的細菌經(jīng)MALDI-TOF MS檢測可以形成特異性的指紋圖譜，建立這些細菌的圖譜庫，將待測細菌的質(zhì)譜圖與已有質(zhì)譜圖庫進行比較，即可確定細菌種屬。由于所得到的蛋白質(zhì)圖譜中主要的分子離子峰為菌體內(nèi)高豐度、表達穩(wěn)定且進化保守的核糖體蛋白，因此其鑒定結果穩(wěn)定、可靠。

1 MALDI-TOF-MS技術的原理

將微生物樣品和基質(zhì)溶液以一定比例混合，取數(shù)微升上述混合溶液點在靶板上，溶劑揮發(fā)后形成樣品與基質(zhì)的共結晶體，利用激光作為能量來源輻射共結晶體，基質(zhì)從激光中獲取能量躍遷成為激發(fā)態(tài)使樣品發(fā)生解析離子化，離子在電場作用下加速飛過飛行管道，飛行時間與離子的質(zhì)荷比(m/z)成正比，分子量較小的分子，飛行的較快，以離子質(zhì)荷比(m/z)為橫坐標，離子峰強度為縱坐標，形成質(zhì)量圖譜，將質(zhì)量圖譜與已知質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫中的特征性質(zhì)譜圖比對，篩選并確定出特異性圖譜，從而實現(xiàn)對目標微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定。

2 MALDI-TOF-MS在食源性致病菌檢測中的應用

根據(jù)國家食源性致病菌監(jiān)測要求,微生物檢測項目主要是沙門菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、彎曲菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌等。目前對食源性致病菌的病原學檢測依賴細菌的生化代謝和血清學反應結果來判定，耗時較長。基于基因型鑒定方法，細菌核糖體基因序列分析、熒光定量PCR檢測特定的基因等易出現(xiàn)假陽性結果的想象，而MALDI-TOF-MS方法從首次報道用于微生物的鑒定以來，一直被許多國內(nèi)外研究學者應用，收到很好的效果。

戰(zhàn)曉微等[1]從牛肉骨粉中分離出甲型副傷寒沙門菌的野生分離株，用傳統(tǒng)方法與MALDI-TOF-MS方法進行檢測比較，MALDI-TOF-MS檢測的可信度分值為2.372，檢測結果與傳統(tǒng)方法一致且準確性較高。Karen L等[2]用MALDI-TOF MS方法對致瀉性大腸埃希菌、宋內(nèi)志賀菌、金黃色葡萄球菌、腸炎耶爾森菌等31株常見食源性致病菌進行成功鑒定，進一步驗證了該技術在微生物鑒定方面的可靠性。Barbuddhe S B[3]等應用Maldi-TOF MS方法測試了不同血清型的李斯特菌，不同血清型李斯特菌的特征性峰值不同。該方法與PFGE對不同血清型的李斯特菌比較，表明MALDI-TOF MS可以有效鑒別李斯特菌及其亞型，甚至可以鑒定到種水平。通過對單增李斯特菌標準菌株進行驗證，表明鑒定結果的可信度很高。R.Dieckmann等[4]對12個屬456致病菌株成功進行了鑒定。資料顯示，有很多研究學者采用MALDI-TOF MS方法在宋內(nèi)志賀菌、克羅諾桿菌、大腸埃希菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、沙門菌等食源性致病菌的快速檢測方面進行應用，效果良好。

龔艷清等[5]從冷凍保存的羅非魚、鰻魚、大菱鲆、鯉魚、牛蛙及甲魚等水生動物中分離的20 株遲緩愛德華菌用MALDI-TOF MS和全自動微生物鑒定儀VITEK方法進行鑒定比較，結果表明，MALDI-TOF-MS方法檢測的20株遲緩愛德華菌與數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜圖匹配比較，分值均在2.35以上，準確性較高。而全自動微生物鑒定儀VITEK檢測的遲緩愛德華菌的鑒定值只有85%，說明MALDI-TOF MS方法在重復性、穩(wěn)定性、準確性等方面總體優(yōu)于傳統(tǒng)生化鑒定方法。戰(zhàn)曉微等[6]分別從養(yǎng)殖生豬、動物源性食品以及從食物中毒患者及食品加工人員中分離的47株大腸桿菌分離株，經(jīng)MALDI-TOF MS方法檢測收集菌株的蛋白指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對分析，結果表明，該47株菌株均為大腸桿菌且可信度分值分布于1.9～2.5之間，與常規(guī)方法分離大腸桿菌的鑒定結果一致。可信度分值的差異說明該47株大腸桿菌存在顯著差異。

Wang Y等[7]從樣品中分離的37株單增李斯特菌，應用MALDI—TOF MS方法采集蛋白質(zhì)指紋圖譜，匯集成單增李斯特菌圖譜數(shù)據(jù)庫與標準菌進行驗證，并在此基礎上對37株單增李斯特菌分離株進行聚類分析，結果表明,MALDI-TOF MS方法將37株單增李斯特菌分離株分成9個型，以此建立了MALDI-TOF MS快速鑒定與分型方法。Bao C M[8]等分別使用直接涂抹法和提取法處理，對200株宋內(nèi)志賀菌野生株及致瀉性大腸埃菌進行鑒定驗證，結果表明，宋內(nèi)志賀菌經(jīng)涂抹法鑒定準確率為71.5%，而經(jīng)提取法鑒定準確率為100%，并以此建立了鑒定宋內(nèi)志賀菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，通過對比分析宋內(nèi)志賀菌的離子峰可鑒別到亞種，為鑒定宋內(nèi)志賀菌提供了一種高效快速的方法。Zheng Q Y等[9]人通過MALDI-TOF MS方法主成分分析及聚類分析，對不同血清型、不同地區(qū)來源及不同宿主的74株沙門菌進行溯源分析，結果如表1所示，表明74株沙門菌中宿主及來源地相同或相似的沙門菌蛋白質(zhì)指紋圖譜相似性較好，而宿主及來源不同或較遠的沙門氏菌指紋圖譜數(shù)據(jù)差異較大，表明宿主及來源地相似或較遠的菌株在菌體蛋白表達上存在差異。

表1 不同菌株來源及數(shù)量

Zhao G M[10]等，對32株克羅諾桿菌(28株分離株，4株參考菌株)與相近菌株陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌應用MALDI-TOF MS與API方法分別進行鑒定，結果顯示，MALDI-TOF MS能將32株克羅諾桿菌鑒定到種、屬水平的分別為56.2%和37.5%，而API的方法則為75%和21.9%，并且3株菌未獲得鑒定結果，其余29株菌的鑒定結果一致。在此試驗的基礎上利用采集的8種參考菌株的蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)構建克羅諾桿菌的MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫，再用相近腸桿菌及該屬分離株驗證數(shù)據(jù)庫的準確性。結果顯示，應用建立的克羅諾桿菌的MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫對135株克羅諾桿菌分離株進行分析，可信度分值均大于2.0，達到了種水平鑒定要求，通過聚類分析，可進一步分型。這對克羅諾桿菌鑒定與分型提供了一種新的手段。對克羅諾桿菌的快速溯源具有重要參考價值，進一步說明通過自建數(shù)據(jù)庫是提高鑒定結果準確性的方法之一。Zhao H Y[11]等解決了傳統(tǒng)方法對克羅諾桿菌的鑒定存在一定的假陽性和假陰性的問題，彌補了現(xiàn)有方法的不足，對克羅諾桿菌(阪崎腸桿菌)的進一步研究提供豐富的科學依據(jù)。

3 MALDI-TOF MS在醫(yī)學微生物檢測中的應用

在疾病診斷與研究過程中，質(zhì)譜技術在病原微生物的鑒定和分型[15],靶蛋白的組織定位[16]等方面取得初步成果。在這些成果中最早報道MALDI-TOF MS方法對病原菌鑒定的研究與應用[17-18]，尤其對于感染性疾病病原臨床分離株的鑒定與分型。目前，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)在感染性疾病病原的診斷與應用研究中主要有以下幾方面：(1)菌落純培養(yǎng)的鑒定；(2)樣本中無菌部位細菌的直接鑒定；(3)細菌耐藥性檢測；(4)病毒的檢測。

嚴立等[12]將重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院送檢的臨床123株菌株用MALDI-TOF-MS和傳統(tǒng)方法進行鑒定比較，123株菌株中大多數(shù)是常見的臨床相關病原菌(包括葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、腸桿菌、革蘭陽性桿菌等能較全面反映其在臨床常規(guī)微生物實驗室中的表現(xiàn))。結果表明,MALDI-TOF MS方法可將122株菌株鑒定至種，鑒定可信度為60%～99.9%，尤其對常見菌如金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腸球菌及大多數(shù)腸桿菌科細菌，非發(fā)酵菌及酵母菌的鑒定能力很好，鑒定準確率可達95%。Wang Y R[13]等利用MALDI-TOF MS方法從門診腹瀉患者糞便分離的88株沙門菌進行分型，88株沙門菌被分為15個型，親緣關系的差異水平值為100。MALDI-TOF MS方法結合耐藥表型分型88株沙門菌分成44個亞型；結合血清學分型88株菌分成46個亞型；結合PFGE分型88株菌分成64個亞型。盡管MALDI-TOF MS方法在血清分型中具有一定的分型能力，然其分型結果與傳統(tǒng)結果還存在一定的差異。目前國內(nèi)外在這方面的研究性文章很少，尚無法斷定MALDI-TOF MS在血清分型方面的能力。Sun Z K等[14]用MALDI-TOF MS方法對臨床分離的40株葡萄球菌進行耐藥性、聚類分析和API Staph系統(tǒng)、Kirby-bauer耐藥性鑒定分析對比，40株葡萄球菌的分離株中有34株為金黃色葡萄球菌，6株為其他葡萄球菌，結果與API Staph系統(tǒng)鑒定一致。Kirby-bauer法耐藥性檢測顯示，34株金黃色葡萄球菌其中11株為耐藥性金黃色葡萄球菌，23株為敏感性金黃色葡萄球菌，用MALDI-TOF MS方法聚類分析結果與耐藥性檢測結果一致，試驗表明，MALDI-TOF MS方法不僅可區(qū)分MRSA(耐藥)和MSSA(敏感)，甚至能區(qū)分不同類型耐藥性，這對快速提供治療方案和控制感染具有重要的作用。

4 展望

微生物的鑒定分類主要有表型鑒定和基因型鑒定兩種方法。表型鑒定屬于傳統(tǒng)分類鑒定方法，包括分離培養(yǎng)，形態(tài)特征，生化反應，血清學，耐藥性等分型，鑒定周期較長，一般需要3～5 d?；蛐丸b定方法包括(G+C)mol%、DNA雜交、PFGE，16S rDNA序列等，從遺傳學及種系角度對病原菌進行鑒定分類。MALDI-TOF MS方法鑒定不是基于微生物的生理生化指標和基因，而是取決于特異性蛋白圖譜的比較來進行的，因此MALDI-TOF MS方法是對微生物鑒定分類的一種補充而不是替代。不同的分型方法可以相互借鑒，互相補充。蛋白指紋圖譜與基因水平分型結合起來能擴大對亞種水平的分型鑒定能力。

目前MALDI-TOF MS方法具有敏感度高、穩(wěn)定性好、特異性強、圖譜簡明，而且操作簡單、快捷等特點，越來越多的用于病原性微生物的快速鑒定與分型方面。盡管如此，國內(nèi)對MALDI-TOF MS方法的研究和應用還處于探索階段，微生物蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)大多數(shù)來源于國外資料，雖然我國的研究學者也建立了一些數(shù)據(jù)庫，但一些新型細菌的圖譜和罕見菌種尚未被數(shù)據(jù)庫收錄，從而導致鑒定困難；而且不同國家和地區(qū)的同種菌株也存在一定的地理差異，只有不斷的增加不同來源和地區(qū)數(shù)據(jù)庫的菌株種類和數(shù)量，才能保證鑒定的準確性。另外，MALDI-TOF MS方法對不同菌株的樣品處理、質(zhì)譜圖采集和分析、多血清型細菌的分型鑒別準確性等方面還有許多問題需要研究改進和完善。

隨著MALDI-TOF MS技術的不斷完善和提高，盡管該技術在微生物分類研究、食源性致病菌，感染性疾病病原的鑒定與分類方面取得一定的成果，但在畜牧獸醫(yī)行業(yè)的檢測方面仍然是一個空白，隨著蛋白質(zhì)譜技術的提高，相信一定能填補這方面的空白。

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2016-08-10

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技項目(2015IK113)

王海花(1977- )女，講師，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物學教學研究工作，E-mail:whh9023@sina.com

苗麗，E-mail:ml5628@163.com

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0529-6005(2017)02-0062-03