氣陰兩虛型心衰病證結(jié)合小鼠模型的構(gòu)建與評價*

楊　鳴　王達(dá)洋　龔嬡媛　雷　暢　王延雷　郭淑貞

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029）

·研究報(bào)告·

氣陰兩虛型心衰病證結(jié)合小鼠模型的構(gòu)建與評價*

楊鳴王達(dá)洋龔嬡媛雷暢王延雷郭淑貞△

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029）

目的探究“氣陰兩虛型心衰病證結(jié)合模型”的構(gòu)建與評價。方法首先探究過量異丙腎上腺素（ISO）造成心衰小鼠模型的方案，以超聲心動、臟器指數(shù)、病理切片等明確ISO劑量；在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合剝奪睡眠的方式，構(gòu)建氣陰兩虛型心衰病證結(jié)合小鼠模型，并通過觀察宏觀體征、圖像處理量化分析、曠場實(shí)驗(yàn)等評價模型。結(jié)果遞減劑量組（第1天20 mg/kg，第2天10 mg/kg，第3～14天5 mg/kg）相比恒定劑量組（ISO 5 mg/kg連續(xù)30 d）心衰更顯著；剝奪睡眠組相比單純注射ISO組氣陰兩虛程度更明顯。結(jié)論聯(lián)合皮下注射異丙腎上腺素和小站臺水環(huán)境法剝奪睡眠可構(gòu)建氣陰兩虛型心衰病證結(jié)合小鼠模型。

病證結(jié)合氣陰兩虛心衰動物模型小鼠

慢性心力衰竭（CHF）是各種心臟病的嚴(yán)重階段。近年來心衰發(fā)病率持續(xù)增長，正成為21世紀(jì)最重要的心血管病癥。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，我國心衰患病率約為0.9%，并且發(fā)病率逐年上升［1］。根據(jù)中醫(yī)辨證，在眾多CHF患者中，出現(xiàn)心悸，胸悶，氣短，活動后加重，胸脅滿悶，舌質(zhì)淡紅、脈沉細(xì)或沉澀等氣陰兩虛證的癥狀者較多［2］，故在《實(shí)用中醫(yī)心病學(xué)》《中藥新藥治療充血性心力衰竭的臨床研究指導(dǎo)原則》等文獻(xiàn)研究中，氣陰兩虛型屬于其中較常見之一。研究表明，在心衰發(fā)展的前期，患者往往呈現(xiàn)氣陰兩虛證的表現(xiàn)，故復(fù)制該模型在對心衰的早期干預(yù)較有意義［3-4］?，F(xiàn)在與CHF相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)中，氣陰兩虛型心衰的動物模型復(fù)制方法尚不明確。在中醫(yī)科研中，動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑u價方法多樣，如方證相關(guān)［5］，然而常忽略模型外在的宏觀體征，不符合中醫(yī)辨證的整體觀念。本實(shí)驗(yàn)擬采用過量異丙腎上腺素（ISO）可復(fù)制心衰模型的方法［6-12］，聯(lián)合剝奪睡眠的病因造模方式［13］，探索氣陰兩虛型心衰小鼠模型的構(gòu)建與評價?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級健康的雄昆明小鼠，體質(zhì)量18～20 g。合格證編號：11400700019190。自由飲水和攝食，光照24 h，室溫（21±1）℃，濕度（50±1）%。

1.2試劑與儀器異丙腎上腺素（ISO）（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司提供）。VisualSonics Vevo2100超聲儀配有30 MHz探頭。

1.3分組與造模動物造模實(shí)驗(yàn)，根據(jù)體質(zhì)量將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為3組：對照組、遞減劑量組（第1日20 mg/kg，第2日10 mg/kg，第3～14日5 mg/kg）、恒定劑量組（ISO 5 mg/kg連續(xù)30 d），每組7只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組動物數(shù)分別為對照組7只、遞減劑量組6只、恒定劑量組6只。心衰模型制備，分組當(dāng)天皮下注射Iso，對照組皮下注射生理鹽水，每日1次，連續(xù)30 d。參考實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果確定心衰造模方法，另一組實(shí)驗(yàn)分為對照組、模型組（遞減給予ISO）、（遞減給予ISO）+剝奪睡眠組，每組10只小鼠，觀察聯(lián)合睡眠干預(yù)對模型小鼠的影響，增加剝奪睡眠干預(yù)的實(shí)驗(yàn)，從第31日開始，ISO聯(lián)合剝奪睡眠組采用小站臺水環(huán)境法［14-15］剝奪睡眠，時間為48 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組動物數(shù)分別為對照組10只、模型組8只、ISO加睡眠剝奪組9只。

1.4觀察指標(biāo)心衰小鼠模型的評價，超聲心動檢測應(yīng)用VisualSonics Vevo2100超聲儀及30MHz探頭于造模結(jié)束后第12周對小鼠做超聲檢查。臟器指數(shù)，小鼠取血后，游離心臟、肝、肺，肉眼觀察，在4℃的0.9%氯化鈉溶液中洗凈血液，濾紙吸干，用分析天平稱取心、肝、肺質(zhì)量，測量小鼠脛骨長度，分別計(jì)算心肝肺與體重和脛骨長的比值。病理組織學(xué)，心肌組織取材，常規(guī)石蠟包埋、HE染色，光鏡下觀察組織病理變化。另一組實(shí)驗(yàn)心衰的氣陰兩虛證型的評價，宏觀體征觀察依據(jù)自創(chuàng)的宏觀體征采集量表，定期收集整理小鼠宏觀體征，包括精神、活動、毛發(fā)、口鼻、耳、爪和尾的情況。為減少主觀性，制定了小鼠觀察標(biāo)準(zhǔn)，并保證觀察記錄人員固定。曠場試驗(yàn)，剝奪睡眠后，測定小鼠曠場中1 min水平移動距離及抬頭次數(shù)。曠場大小為50 cm×50 cm，其底部為1 cm×1 cm方格。每只測量結(jié)束后清理曠場，以免氣味干擾。根據(jù)方肇勤等［16］方法計(jì)算氣虛程度。氣盛衰度=各動物水平/正常組均數(shù)×0.6+各動物直立/正常組均數(shù)×0.4。圖像處理量化分析宏觀體征，戊巴比妥鈉將小鼠麻醉，參考林志健等［17］的方法，運(yùn)用Photoshop7.0軟件提取小鼠耳、口唇、舌、爪、尾的R、G、B值，并計(jì)算上述各部分紅色度r=R/（R+G+ B），綠色度g=G/（R+G+B），藍(lán)色度b=B/（R+G+B）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊者改用秩和檢驗(yàn)的Kruskal-Wallish方法進(jìn)行多個樣本比較及兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組心衰模型動物心臟結(jié)構(gòu)與心功能結(jié)果比較見表1。12周末，實(shí)驗(yàn)組小鼠左室舒張期內(nèi)徑（LVID；d）、左室收縮期內(nèi)徑（LVID；s）較對照組有所增大，左室射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室短軸縮短率（FS）較對照組有所降低（P＜0.05）。

表1　各組小鼠12周末二維超聲心動圖比較（）

表1　各組小鼠12周末二維超聲心動圖比較（）

與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n LVID；d（mm）LVID；s（mm）EF（%）FS（%）對照組7遞減劑量組6 4.578±0.1472.898±0.31666.075±8.59836.702±6.645 5.238±0.538△3.949±0.729△△48.834±10.371△△25.109±6.390△△恒定劑量組64.556±0.6423.510±0.626△46.475±8.757△△23.285±5.040△△

2.2各組心衰模型動物臟器指數(shù)比較見表2，表3。遞減劑量組與對照組相比，心重/脛骨長、肺重/脛骨長均有顯著增加（P＜0.05），肺淤血相對肝淤血更明顯，顯示此模型引起的心力衰竭可能為左心衰。

表2　各組心、肝、肺質(zhì)量指數(shù)比較（）

表2　各組心、肝、肺質(zhì)量指數(shù)比較（）

組別n 心質(zhì)量指數(shù)肝質(zhì)量指數(shù)肺質(zhì)量指數(shù)對照組7遞減劑量組6 0.0046±0.00040.0369±0.00320.0046±0.0004 0.0053±0.00070.0381±0.00180.0053±0.0006恒定劑量組60.0045±0.00050.0344±0.00350.0045±0.0007

表3　各組心、肝、肺質(zhì)量/脛骨長比較（g/mm，）

表3　各組心、肝、肺質(zhì)量/脛骨長比較（g/mm，）

組別n 心質(zhì)量/脛骨長肝質(zhì)量/脛骨長肺質(zhì)量/脛骨長對照組7遞減劑量組6 0.0093±0.00080.0746±0.0086 0.0093±0.0005 0.0111±0.0016△0.0809±0.0062 0.0112±0.0019△恒定劑量組60.0090±0.00110.0688±0.0087 0.0090±0.0019

2.3心衰模型動物病理結(jié)果見圖1。光鏡下可見實(shí)驗(yàn)組均有不同程度的纖維化、淋巴細(xì)胞聚集。

圖1　光鏡下HE染色

2.4心衰模型動物聯(lián)合睡眠剝奪干預(yù)宏觀體征觀察見表4。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，漸進(jìn)性出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛色略有干枯、發(fā)黃，口鼻暗紅，耳部血管充盈明顯，爪、尾均有不同程度的變暗，少光澤。結(jié)果顯示ISO+剝奪睡眠組耳部g值、尾部r值、吻部r值偏小，舌g值、吻部b值偏大，ISO組舌g值偏小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。r值愈大愈紅，愈小則愈淡。g值愈大則愈暗，愈小則相反。b值愈大則愈青紫，愈小則相反。故剝奪睡眠組尾部與吻部r值偏小，表明氣虛；舌g值與吻部b值偏大，表明有陰虛血瘀的傾向?？梢妱儕Z睡眠的造模因素對于體征的影響比單純ISO注射組更顯著。

表4　兩組小鼠耳、爪顏色色度、舌、吻部顏色色度及尾色色度分析結(jié)果比較（%，±s）

表4　兩組小鼠耳、爪顏色色度、舌、吻部顏色色度及尾色色度分析結(jié)果比較（%，±s）

吻部尾46.39±3.4138.15±1.11 28.30±3.5732.39±0.99 25.32±1.2829.47±1.56 ISO+剝奪睡眠組r36.99±1.5242.72±1.4943.10±1.4543.09±2.62△36.73±1.27△（n＝8）g32.65±0.4028.61±0.7228.29±1.13△29.43±3.0232.69±0.21 b30.36±1.4928.67±0.8328.61±0.6527.48±2.89△30.59±1.24 ISO組r37.54±0.4242.85±4.6342.99±4.4146.70±1.4137.63±0.61（n＝9）g32.90±0.35*28.54±2.1928.79±2.23△27.23±0.8132.05±0.95 b29.56±0.2728.61±2.4928.21±3.1826.06±0.7930.31±1.31組別對照組r（n＝10）g b耳爪舌37.11±1.1545.05±1.7447.29±7.48 32.96±0.4627.77±0.6824.62±3.67 29.64±0.9327.18±1.0728.09±3.99

2.5各組實(shí)驗(yàn)動物曠場試驗(yàn)結(jié)果見圖2。ISO聯(lián)合剝奪睡眠組在剝奪睡眠后，運(yùn)動能力明顯下降，ISO組與對照組相比，氣盛衰度稍有下降。

圖2　氣盛衰度

3　討論

3.1模型構(gòu)建模擬心力衰竭模型的方法有很多，在目前的研究中大致分為手術(shù)法和藥物注射法兩大類。其中藥物注射法中常用的藥物有ISO、阿霉素、戊巴比妥鈉等。其中ISO能夠增強(qiáng)心肌收縮力，模擬壓力超負(fù)荷型心力衰竭心肌細(xì)胞代償與失代償?shù)倪^程，具有無創(chuàng)，安全性高，動物均一性好的特點(diǎn)，在目前的心里衰竭動物模型中較廣泛使用。目前國內(nèi)外已經(jīng)有許多相關(guān)的研究，注射方法大多為皮下注射，腹腔注射，此外也有靜脈持續(xù)點(diǎn)滴ISO造模成功的研究。但是具體的造模劑量各不相同且差異較大，為進(jìn)一步確定合適的造模劑量，并探索在心衰發(fā)病過程中各中醫(yī)證型出現(xiàn)的時間窗，本實(shí)驗(yàn)以連續(xù)30 d，5 mg/kg（小劑量）和第1日20 mg/kg，第2日10 mg/kg，第3～14日5 mg/kg（遞減劑量）兩種方法給予小鼠皮下注射ISO。從中醫(yī)病因的角度分析，睡眠剝奪會打破機(jī)體原有的平衡，導(dǎo)致營衛(wèi)失調(diào)、臟腑功能紊亂，衛(wèi)陽不得入于陰分，從而灼傷營血，進(jìn)而出現(xiàn)氣陰兩虛的癥狀及體征。目前剝奪睡眠的方法較多，其中小站臺水環(huán)境法是用于剝奪睡眠較為流行的方法，簡單易行，可作為中醫(yī)病因的造模因素，復(fù)制氣陰兩虛狀態(tài)的小鼠模型。因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)上述原理，使用注射ISO結(jié)合剝奪睡眠方法，成功復(fù)制出氣陰兩虛證小鼠心力衰竭模型，并且探究出具體注射劑量以及剝奪睡眠的方法，具有較高可行性和可復(fù)制性。

3.2模型評價在對于心力衰竭模型的評價中，常用的評價方法為超聲心動、臟器指數(shù)及病理，本實(shí)驗(yàn)在臟器指數(shù)的評價中采用較為創(chuàng)新的臟器重量/脛骨長作為臟器指數(shù)的方法，有效避免了小鼠個體營養(yǎng)差異造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差，優(yōu)于傳統(tǒng)的臟器重量/體重的評價方法。同時，對于中醫(yī)證候動物模型評價的探索是基礎(chǔ)研究及中藥新藥研發(fā)的重要工具。本實(shí)驗(yàn)基于臨床，結(jié)合圖像技術(shù)挖掘小鼠體征的細(xì)微變化，并引入曠場試驗(yàn)等方法動態(tài)評價氣與陰的盛衰程度，模擬臨床辨證方法，從正面對小鼠進(jìn)行辨證。此法本于中醫(yī)理論，更符合中醫(yī)“整體觀念”“司外揣內(nèi)”的辨證思維模式。圖像處理的方法是“望診”的延伸，將其精確量化，分辨細(xì)微的差別，故更需要保證光源、角度、相機(jī)參數(shù)等其他要素的一致性。剝奪睡眠組尾、吻部紅色度偏淡，提示氣虛；兩實(shí)驗(yàn)組小鼠舌色與對照組相比，均有不同程度偏暗，剝奪睡眠組吻部藍(lán)色度偏高，提示陰虛榮養(yǎng)不足，并有血瘀傾向。故各組小鼠耳、爪、尾、舌、吻部的色度分析結(jié)果基本符合氣陰兩虛的特點(diǎn)。曠場試驗(yàn)是衡量小鼠活躍程度的重要參考，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)剝奪睡眠后的小鼠活躍程度明顯降低，氣虛較重，而未剝奪睡眠的實(shí)驗(yàn)組與對照組差異較小，且符合統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故可證明該方法在評價氣陰兩虛程度中起到關(guān)鍵作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用的評價方法彌補(bǔ)傳統(tǒng)評價方法的不足，并做到中西醫(yī)結(jié)合評價心衰程度及氣陰兩虛程度，具有創(chuàng)新性及客觀性。

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The Construction and Evaluation of the Qi and Yin Deficiency Pattern of Hart Failure Mouse Model

YANG Ming，WANG Dayang，GONG Aiyuan，et al.
School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Objective：To explore the construction and evaluation of the Qi and Yin deficiency pattern of heart failure mouse model.Methods：The programme of excess isoproterenol mouse model with heart failure was explored，valued by ultrasonic cardiography，organ index and pathology.On the basis of the heart failure mouse model，sleep deprivation way was combined to build the Qi and Yin deficiency pattern of heart failure rat model and the model was evaluated by observing macroscopic signs，open-field test，and image processing quantification analysis.Results：The dose decreasing group（the 1st day 20 mg/kg，the 2nd day 10 mg/kg，from 3rd to 14th day 5 mg/kg）had a severer heart failure compared with the dose constant group，（ISO 5 mg/kg for 30 days）and the group of sleep deprivation had a higher degree on Qi and Yin deficiency.Conclusion：Subcutaneous injection of isoproterenol combined with small platform water environment to perform sleep deprivation can build Qi and Yin Deficiency type of mouse model with heart failure disease and syndrome.

The combination of disease and syndrome；Qi and Yin deficiency；Heart failure；Animal model；Mice

R285，5

A

1004-745X（2015）12-2076-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.003

2015-08-03）

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-13-0692）；北京中醫(yī)藥大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310026046）

（電子郵箱：guoshz@bucm.edu.cn）