劉豨湯抗大鼠肝纖維化作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

劉新軍　王慧凱　姜學(xué)連△

（1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東濱州256603；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603）

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

劉豨湯抗大鼠肝纖維化作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

劉新軍1王慧凱2姜學(xué)連2△

（1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東濱州256603；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603）

目的觀察中藥復(fù)方劉豨湯對(duì)肝纖維化血清學(xué)和免疫組織化學(xué)方面的作用。方法用豬血清腹腔注射法制作肝纖維化模型，通過(guò)運(yùn)用劉豨湯做預(yù)防和治療，研究記錄治療前后血清學(xué)肝功能、肝纖維化以及免疫組織化學(xué)指標(biāo)，制作標(biāo)本，最后用圖像分析儀定量分析、統(tǒng)計(jì)及處理。結(jié)果劉豨湯治療后，大鼠肝纖維化程度明顯減輕，能夠顯著降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、肝纖維化指標(biāo)Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（C-Ⅳ）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸酶（HA）也受到抑制，并能抑制Ⅳ型膠原及LN合成、降低TGF-β1的表達(dá)。結(jié)論劉豨湯能夠預(yù)防和治療肝纖維化，證明其具有保護(hù)肝細(xì)胞、抑制膠原增生并促進(jìn)降解、抑制TGF-β1的表達(dá)的作用。

肝纖維化作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究免疫組織化學(xué)劉豨湯

劉豨湯具有活血化瘀、健脾、祛濕、解毒及消癥散結(jié)等作用，在臨床上已證實(shí)能夠較好地治療肝炎及肝硬化早期患者，有效阻抑肝纖維化的發(fā)展進(jìn)度［1］。目前該方主要用于臨床治療，未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，目前尚不明確劉豨湯治療肝纖維化的機(jī)制。故我們做了以下實(shí)驗(yàn)，以探討其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物98只Wistar大鼠，雄性，清潔級(jí)，大鼠體質(zhì)量95～105 g，購(gòu)于山東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.2試劑與藥物中藥復(fù)方劉豨湯：劉寄奴20 g，豨薟草30 g，柴胡6 g，郁金10 g，赤芍30 g，丹參20 g，茜草20 g，蒼術(shù)10 g，土茯苓15 g，茵陳15 g，莪術(shù)10 g，澤瀉10 g。中藥購(gòu)于廣東一方制藥有限公司，由專(zhuān)業(yè)人員煎煮、濃縮成含生藥3 g/mL的藥液；西藥秋水仙堿，訂購(gòu)于廣東彼迪藥業(yè)有限公司，配制0.02 mg/mL濃度的灌胃藥液。

1.3分組與造模將98只大鼠隨機(jī)分為7組，每組14只，即正常對(duì)照組、模型1組、模型2組、中藥預(yù)防組、中藥治療組、西藥預(yù)防組、西藥治療組。建模與取材：參照于世瀛等［2］制作模型的方法，采集豬血清，注入大鼠腹腔，建造模型。正常對(duì)照組中，每只大鼠給予0.5 mL 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。其余大鼠給藥方式為：取豬血清0.5 mL，注入大鼠腹腔，每隔7 d給藥2次，在第35日，取7只正常對(duì)照組大鼠，模型1組、兩預(yù)防組所有大鼠，共49只，采用乙醚吸入的麻醉方式，分離大鼠股動(dòng)脈，取血，分離血清，-80℃保存，留作檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)的標(biāo)本；將以上大鼠處死后解剖，暴露肝臟，在距左葉邊緣3mm處取肝臟組織，放入福爾馬林液中固定肝組織，制作光鏡標(biāo)本及免疫組織化學(xué)標(biāo)本，每次處死大鼠取材前，測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量并仔細(xì)記錄。第70日，取7只正常對(duì)照組大鼠，模型2組、兩治療組所有大鼠，共49只，取血清及肝臟組織標(biāo)本，方法參照第1次取材操作。給藥方法，正常對(duì)照組及模型組按1.0 mL/100 g體質(zhì)量給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，兩預(yù)防組于給以藥液灌胃，每日于下午5點(diǎn)灌胃1次，連續(xù)35 d，其中中藥預(yù)防組按照3 g生藥/100 g體質(zhì)量的藥物劑量灌胃給藥，西藥預(yù)防組按0.02 mg/ 100 g體質(zhì)量的藥物劑量灌胃給藥，連續(xù)35 d。中藥治療組、西藥治療組于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的第36日開(kāi)始給藥，劑量、方式、時(shí)間同前。每7日測(cè)量1次大鼠的體質(zhì)量，然后根據(jù)大鼠體質(zhì)量的變化按時(shí)調(diào)整灌胃用藥的劑量。

1.4觀察指標(biāo)1）血清肝功能指標(biāo)應(yīng)用生化分析儀檢測(cè)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）、白蛋白/球蛋白（A/G）；2）采取放免法檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)、透明質(zhì)酸酶（HA）、Ⅲ型前膠原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型膠原蛋白（C-Ⅳ）、層粘連蛋白（LN）；3）采用SABC法檢測(cè)免疫組織化學(xué)指標(biāo)：Ⅳ型膠原、層粘連蛋白（LN）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）。4）光鏡標(biāo)本，取大鼠肝臟左葉距邊緣3 mm處，大小約0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm的小塊肝臟組織2～3塊，取肝組織，10%福爾馬林液固定，24 h后，依次進(jìn)行脫水、包埋、切片、HE染色及Masson染色等實(shí)驗(yàn)操作，制作標(biāo)本。采用圖像分析儀檢測(cè)、記錄膠原含量。反應(yīng)產(chǎn)物為棕褐色。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS19.0數(shù)據(jù)分析軟件，血清肝功能及肝纖維化指標(biāo)各組間用χ2檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，免疫組織化學(xué)結(jié)果采用圖像分析儀測(cè)量，根據(jù)需要結(jié)果取均值，各組間采用t檢驗(yàn)處理統(tǒng)計(jì)比較差異性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠一般情況大鼠生長(zhǎng)無(wú)異常變化，試驗(yàn)結(jié)束后，大鼠未出現(xiàn)死亡。制作模型及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠體質(zhì)量的變化各組間無(wú)明顯差別，大鼠外觀正常，毛發(fā)無(wú)異常變化，大鼠可活動(dòng)自如，食欲好，每周檢測(cè)大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)明顯異常。各組大鼠性情平和，無(wú)攻擊性，各組之間無(wú)明顯異常。

2.2各組動(dòng)物肝功能指標(biāo)比較見(jiàn)表1。制作模型后，大鼠血清指標(biāo)包括ALT、AST、TBIL、ALP均出現(xiàn)了大幅度的升高，ALB、A/G的水平則明顯下降，說(shuō)明正常對(duì)照組與模型組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在經(jīng)過(guò)藥物的預(yù)防和治療之后，預(yù)防及治療組大鼠血清學(xué)肝功能指標(biāo)出現(xiàn)了明顯的恢復(fù)，結(jié)果證實(shí)，中藥、西藥治療組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1　各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較（）

表1　各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較（）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與西藥治療組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，下同。

組別n正常對(duì)照組14模型組28中藥預(yù)防組14 ALB（g/L）A/G 36.5±2.81.12±0.04 27.26±1.6**0.68±0.21**36.7±1.2△△1.15±0.05△△中藥治療組14 43.25±6.37△△##174.34±21.43△△##7.±1.49△△##286.5±38.58△△##38.3±1.5△△##1.0±0.06△△##西藥預(yù)防組14 78.84±10.49**△△194.38±32.26**△△9.87±1.72**△445.38±44.48**△△29.4±2.2**1.03±0.07△△西藥治療組14 81.54±12.30**213.42±32.16**10.42±1.69**526.34±41.68**28.6±2.1**0.84±0.11**ALT（IU/L）AST（IU/L）TBIL（mol/L）51.22±5.34136.57±46.326.54±1.40 96.31±14.62**241.11±51.16**10.46±3.25**43.37±7.18△△146.25±34.27△△7.81±3.02△△ALP（IU/L）246.87±56.79 597.36±84.30**256.38±21.65△△

表2　各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)結(jié)果（）

表2　各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)結(jié)果（）

組別n正常對(duì)照組14模型組28中藥預(yù)防組14 HA（μg/mL）PCⅢ（μg/mL）C-Ⅳ（ng/mL）LN（ng/mL）105.47±13.4664.23±11.2576.38±18.27124.47±14.09 256.10±34.40**126.27±14.31**112.16±9.34**229.72±23.35**113.25±16.21△△78.28±10.56△△81.35±12.27△△132.78±32.03△△中藥治療組14136.32±23.41△△##86.32±12.53△△##89.24±15.25△△##143.42±21.53△△##西藥預(yù)防組14124.35±11.39△△90.32±8.76△△89.38±1.72△△156.23±32.64△△西藥治療組14163.15±22.17△△98.38±14.35△△95.43±13.02△△176.31±42.37△△

2.3各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)比較見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)比PCⅢ、C-Ⅳ、LN和HA含量，模型組血清中各指標(biāo)含量明顯增多，正常對(duì)照組中各指標(biāo)水平則相對(duì)較低，證明兩組之間的差異高度顯著（P＜0.01）；相較于模型組，兩治療組及兩預(yù)防組中各肝纖維化指標(biāo)的水平均較低，肝纖維化指標(biāo)的下降變化程度中，中藥治療組與西藥物治療之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4各組大鼠IV型膠原、LN和TGFβ1表達(dá)比較見(jiàn)表3。1）Ⅳ型膠原：正常對(duì)照組中，Ⅳ型膠原于血管、膽管基膜內(nèi)分布較多，其分布雖然比較連續(xù)，但形態(tài)則顯得非常不規(guī)則，以沿血竇方向分布的膠原含量居多；模型組中，發(fā)現(xiàn)有Ⅳ型膠原陽(yáng)性細(xì)胞，大處多在細(xì)胞外基質(zhì)，Ⅳ型膠原大量分布，以纖維間隔內(nèi)為主；兩預(yù)防組中無(wú)大量的Ⅳ型膠原；西藥預(yù)防組中，發(fā)現(xiàn)少量增生的Ⅳ型膠原，但尚未形成纖維間隔；西藥治療組中的Ⅳ膠原增生比較多見(jiàn)，還發(fā)現(xiàn)有纖維間隔，較模型組含量少。標(biāo)本采用圖像分析儀測(cè)量，通過(guò)比較兩治療組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中、西藥治療組Ⅳ型膠原水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。2）LN：在正常組中，中央靜脈周?chē)R管區(qū)血管和膽管周?chē)l(fā)現(xiàn)有LN，多數(shù)分布于基膜，排布均勻，沿肝竇外方向分布；模型組中，發(fā)現(xiàn)大量增生的LN，主要位于基膜以及纖維間隔，在血管壁也有大量的LN；中藥預(yù)防組和中藥治療組中，LN增生受到抑制程度最為明顯，西藥預(yù)防組及治療組比中藥組的增加量也很明顯。標(biāo)本采用圖像分析儀測(cè)量，兩治療組比較后發(fā)現(xiàn)，中藥與西藥治療組LN結(jié)果之間的差異高度顯著（P＜0.01）。3）TGF-β1：正常對(duì)照組有TGF-β1表達(dá)，但TGF-β1的含量極少，模型組則發(fā)現(xiàn)了大量的TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞，且分布范圍具有集中于匯管區(qū)、肝血竇及纖維間隔周?chē)奶攸c(diǎn)，經(jīng)藥物預(yù)防治療后，TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞含量明顯減少，應(yīng)用圖像分析儀測(cè)量，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組和西藥治療組比正常組具有更高含量的TGF-β1，較中藥治療組中的TGF-β1含量則顯著增高，通過(guò)比較各組之間的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩治療組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3　各組大鼠免疫組織化學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果（）

表3　各組大鼠免疫組織化學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果（）

組別n正常對(duì)照組14模型組28中藥預(yù)防組14Ⅳ型膠原LNTGF-β131.25±5.4634.27±4.4912.38±2.23 263.10±34.43**316.49±38.37**142.76±21.69**35.58±6.21△△38.36±4.19△△13.74±5.49△△中藥治療組1436.42±6.48△△##73.28±23.25△△##17.21±6.48△△##西藥預(yù)防組1464.49±10.17**△△190.36±35.39**△△35.431±0.27**△△西藥治療組14150.25±28.28**△△98.38±14.35**△△95.43±19.52**△△

3　討論

肝纖維化是肝小葉的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的過(guò)程［3］。在肝小葉受損初期，各種不同的損傷因素（包括化學(xué)及物理因素）發(fā)生后，肝星狀細(xì)胞功能受到異常的影響，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）持續(xù)不斷的沉積在肝組織細(xì)胞周?chē)?，隨著ECM大量異常的產(chǎn)生與沉積，肝小葉的功能與結(jié)構(gòu)逐步發(fā)生了異常的變化，導(dǎo)致形成了肝纖維化［4］。本文通信作者姜學(xué)連教授從事在臨床工作數(shù)十年，在辨證治療肝纖維化方面，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，在應(yīng)用劉豨湯治療肝纖維化的過(guò)程中取得了明顯效果。劉豨湯方中以劉寄奴、豨薟草為君藥，其配伍之中兼具寒熱同用、氣血雙治，既能發(fā)揮活血解毒、平肝、化瘀之功，又能起到散結(jié)、消癥、退黃利膽的功效。方中應(yīng)用柴胡、郁金疏肝解郁，配以赤芍、丹參、莪術(shù)活血、養(yǎng)血，茜草化瘀止血，佐以茵陳清肝利膽、退黃，加澤瀉以疏利三焦，土茯苓、蒼術(shù)共同發(fā)揮健脾祛濕的功效，方中各種藥物相互配伍，發(fā)揮活血化瘀、健脾、祛濕、解毒及消癥散結(jié)的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，劉寄奴［5］濃縮煎液可使大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯下降，有較好的利膽作用，豨簽草［6］經(jīng)水提取后，其成分具有抑制乙型肝炎病毒表面抗原增長(zhǎng)的作用，柴胡［7-8］中含有大量的柴胡皂苷，研究表明其能夠抑制肝星狀細(xì)胞，同時(shí)還能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成。另?yè)?jù)研究發(fā)現(xiàn)，郁金［9］揮發(fā)油能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，尤其對(duì)于中毒性肝炎小鼠效果更明顯。研究發(fā)現(xiàn)赤芍［10-12］具有抗炎細(xì)胞浸潤(rùn)、抗肝纖維化以及降低轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)茵陳［13-15］具有保護(hù)細(xì)胞膜、改善微循環(huán)、降酶等重要的作用。丹參［16］能夠有效地降低轉(zhuǎn)氨酶水平修復(fù)受損的肝組織，茜草［17-18］能夠有效的抗炎、抗血小板聚集，蒼術(shù)［19］則有保護(hù)肝細(xì)胞、抗炎的作用。土茯苓［20］則有預(yù)防肝癌的價(jià)值，澤瀉［21］則具有較好的降脂作用，莪術(shù)［22］則具有抗凝和抑制血栓形成的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，劉豨湯能夠明顯降低血清ALT、AST、TBIL、ALP水平，并能顯著升高ALB、A/G水平，同時(shí)能夠有效抑制血清PCⅢ、C-Ⅳ、LN和HA的生成，并能明顯抑制Ⅳ型膠原、LN、TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，劉豨湯具有抗肝纖維化的作用，其機(jī)制主要是阻抑肝細(xì)胞變性、壞死，減輕肝細(xì)胞遭到破壞的程度，加快促進(jìn)合成糖原以保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，并能阻抑TGF-β1的表達(dá)，從基因水平阻抑膠原及非膠原糖蛋白的合成過(guò)程，其抗肝纖維化效果明顯優(yōu)于秋水仙堿，為這一經(jīng)驗(yàn)方的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

［1］姜學(xué)連，張國(guó)棟，孫云廷，等.劉豨逍遙五苓湯治療慢性重度肝內(nèi)淤膽型肝炎臨床研究［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2008，17（9）：1217-1218.

［2］于世瀛，賁長(zhǎng)恩，楊美娟，等.免疫性和化學(xué)性損傷肝纖維化動(dòng)物模型的比較研究［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，1995，12（4）：5-11.

［3］向芹，李紅，李娜，等.ADC值評(píng)估肝纖維化的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用放射學(xué)雜志，2010，26（4）：581-583.

［4］Ordered McGuire A，Dietrich CG，et al.Cytokine blockade inhibits hepatic tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression and up-regulates matrix metalloproteinase-9 in toxic liver injury［J］.Liver Int，2006，26（5）：579-586.

［5］孫文忠，潘穎宜，郭忻，等.南北劉寄奴活血化瘀藥理作用的比較研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，20（3）：51-53.

［6］王發(fā)輝，馮起校，黃超文.豨薟草藥理研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（10）：102-104.

［7］沈霞，張崗，陳瑩.柴胡防治乙型肝炎的網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)理初探［J］.陜西中醫(yī)，2015，36（1）：113-114.

［8］王斌，張騰霄，馬松艷.等.柴胡的臨床應(yīng)用及配伍規(guī)律研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（1）：225-227.

［9］韓向北，許多，郭亞雄，等.郁金對(duì)CCl4急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞bcl-2及bax表達(dá)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（11）：1715-1718.

［10］朱慧民，牟華明.赤芍對(duì)球囊損傷術(shù)后血管內(nèi)膜單核細(xì)胞趨化蛋白-1基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008，15（3）：138-141.

［11］呂躍山，邢杰，陳英利，等.黃芪赤芍抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（14）：1997-1998.

［12］羅琳，竇志華，吳鋒，等.赤芍總苷退黃降酶的作用及機(jī)制研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（4）：285-288.

［13］蘭紹陽(yáng)，佘世鋒，張達(dá)坤.茵陳蒿湯對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積濕熱證大鼠肝組織NTCP表達(dá)的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2012，23（3）：279-283.

［14］王喜軍，王萍，孫暉，等.茵陳蒿湯對(duì)ANIT誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007，35（4）：17-21.

［15］洪敏，吳祥瑞，華永慶，等.綿茵陳與茵陳蒿保肝作用比較研究［J］.中藥藥理與臨床，2009，25（6）：73-75.

［16］鐘邱，全冰，高翔，等.丹參與三七對(duì)四氯化碳致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用［J］.右江醫(yī)學(xué)，2004，32（4）：306-308.

［17］單鳴秋，陳星，李娟，等.茜草與茜草炭對(duì)大鼠急性血瘀模型的影響比較研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2014，39（3）：493-496.

［18］許蘭芝，陳維寧，張薇，等.茜草醇提物的抗炎免疫作用［J］.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24（1）：1-3.

［19］趙愛(ài)梅.蒼術(shù)的藥理作用研究［J］.光明中醫(yī)，2009，24（1）：181-182.

［20］鄧勤智，夏邦恩，王世和，等.土茯苓組方在乙型肝炎病毒慢加急性肝衰竭中的應(yīng)用及療效分析［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（3）：739-742.

［21］張曉峰，王立福，白云峰，等.澤瀉聯(lián)合熊去氧膽酸膠囊治療非酒精性單純性脂肪肝療效觀察［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（2）：274-276.

［22］王秀，夏泉，許杜娟，等.莪術(shù)中莪術(shù)二酮抗凝血和抗血栓作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中成藥，2012，34（3）：550-553.

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2141-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.024

2015-08-07）

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