RNA提取、定量及RT—PCR綜合性實(shí)驗(yàn)在分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中的實(shí)施

李江濱+巫媛+李育超+侯敢

摘 要 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)重要的專業(yè)課程，實(shí)驗(yàn)教學(xué)尤其是綜合性實(shí)驗(yàn)的教學(xué)對(duì)學(xué)生綜合技能的培養(yǎng)至關(guān)重要。本文從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路、 組織實(shí)施、 實(shí)施效果、 教學(xué)體會(huì)等方面闡述RNA提取、定量及RT-PCR綜合性實(shí)驗(yàn)在分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中的實(shí)施，并分析教學(xué)中存在的問題，提出相應(yīng)的解決對(duì)策，為有關(guān)院校開設(shè)相關(guān)綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。

關(guān)鍵詞 RNA 綜合性實(shí)驗(yàn) 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 教學(xué)

中圖分類號(hào)：G424 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkx.2016.12.042

Abstract Molecular Biology Diagnostic Technique is an important professional course in laboratory Medicine. Experimental teaching， especially the teaching of comprehensive experiment is very important to the cultivation of students' comprehensive skills. This paper expound the teaching implementation of comprehensive experiment “extraction and quantification of RNA and RT-PCR” in molecular biology diagnostic technique from the experimental design ideas， organization， implementation， implementation effect， teaching experience and so on. Analyze the problems existing in the teaching， and put forward the corresponding countermeasures. Provide a reference of teaching on experiment of “extraction and quantification of RNA and RT-PCR” for some colleges.

Keywords RNA； comprehensive experiment； Molecular Biology Diagnostic Technique； teaching

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

RNA提取、定量及RT-PCR綜合性實(shí)驗(yàn)主要由RNA提取、RNA定量和RT-PCR這三個(gè)部分組成。在本校的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，目標(biāo)基因采用常用 -actin基因片段。實(shí)驗(yàn)首先用TRizol試劑提取小鼠肝臟總RNA，然后用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測所提取RNA的純度和含量，最后利用引物oligo（dT）在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下制備cDNA模板，通過小鼠 -actin基因的特異引物擴(kuò)增出 -actin基因片段，并用瓊脂糖凝膠電泳法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及RNA的分離與純化技術(shù)、紫外比色技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)、RT-PCR技術(shù)等研究技術(shù)與方法，具有較好的實(shí)用性和先進(jìn)性。

2 實(shí)驗(yàn)組織實(shí)施

RNA提取、定量及RT-PCR綜合性實(shí)驗(yàn)所涵蓋的知識(shí)面非常廣，整個(gè)實(shí)驗(yàn)歷時(shí)長，對(duì)學(xué)生的細(xì)心程度和實(shí)驗(yàn)技能要求較高，在實(shí)驗(yàn)過程中，有些試劑（比如TRizol試劑和氯仿）有強(qiáng)烈的刺激性氣味且伴有毒性，而且任何一個(gè)環(huán)節(jié)的微小錯(cuò)誤，都有可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)最終失敗，故實(shí)驗(yàn)需要在特殊環(huán)境下（如通風(fēng)櫥）進(jìn)行。為了使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中能夠?qū)W到更多的知識(shí)，并且順利地完成實(shí)驗(yàn)，首先，學(xué)生應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)課前通過實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書和互聯(lián)網(wǎng)了解實(shí)驗(yàn)的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行預(yù)習(xí)，熟悉實(shí)驗(yàn)的原理、儀器的使用方法、試劑的作用、操作步驟和注意事項(xiàng)，并與其他學(xué)生討論預(yù)習(xí)過程中遇到的問題，若仍不能解決，則在老師講解實(shí)驗(yàn)時(shí)邊聽邊思考，務(wù)必在做實(shí)驗(yàn)之前弄懂實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)和每個(gè)步驟的目的，盡量避免盲目操作和錯(cuò)誤操作；其次，實(shí)驗(yàn)施教時(shí)，教師通過PPT展示和現(xiàn)場演示進(jìn)行講解，同時(shí)提出問題讓學(xué)生回答，加深學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)的理解，并解答學(xué)生在預(yù)習(xí)過程中遇到的疑惑；再次，學(xué)生了解清楚每個(gè)步驟的操作、目的和注意事項(xiàng)后，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的說明來進(jìn)行操作，在通風(fēng)廚中進(jìn)行加樣，且要注意戴好口罩和手套，防止酶等因素影響實(shí)驗(yàn)，教師應(yīng)督促和提醒學(xué)生是否有不當(dāng)?shù)牟僮?，輔助學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)；最后，教師對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行引導(dǎo)性的講解，布置學(xué)生寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并要求學(xué)生在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析討論，寫明實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)和實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)，提出一些具有探究性的問題，以此啟發(fā)學(xué)生的邏輯思維和創(chuàng)新思維，加深學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的了解，并在一定程度上激發(fā)學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)的興趣。

3 實(shí)驗(yàn)實(shí)施效果

3.1 鞏固理論知識(shí)，提高運(yùn)用知識(shí)能力

由于分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)這門學(xué)科的理論知識(shí)較為抽象、復(fù)雜難懂，學(xué)生在預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)的過程中，需要查閱書本、上網(wǎng)觀看實(shí)驗(yàn)視頻或者在網(wǎng)上查找資料以便更好地理解實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟和注意事項(xiàng)，等等。同時(shí)，學(xué)生也對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)所涉及的知識(shí)點(diǎn)有了更好的掌握。學(xué)生在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的過程中，復(fù)雜、抽象的理論知識(shí)轉(zhuǎn)化成實(shí)物（比如凝膠電泳結(jié)果、測量吸光度的結(jié)果等等），可以幫助學(xué)生對(duì)課本中的知識(shí)點(diǎn)有更清晰的認(rèn)識(shí)，這正是每個(gè)實(shí)驗(yàn)所要達(dá)到的目的。

3.2 提高獨(dú)立解決問題的能力和自主學(xué)習(xí)能力

在學(xué)生預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)的過程中，通過網(wǎng)絡(luò)資源觀看與此實(shí)驗(yàn)有關(guān)的Flash動(dòng)畫、視頻，瀏覽一些圖片和文字解說，或者是學(xué)生之間的交流，都有益于解答實(shí)驗(yàn)前的各種疑惑，這樣既鍛煉了學(xué)生在網(wǎng)絡(luò)上查找資料的能力，同時(shí)也提高了學(xué)生獨(dú)立解決問題的能力，而不會(huì)在實(shí)驗(yàn)課時(shí)依賴?yán)蠋煹闹v解或者盲目地照著實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書做實(shí)驗(yàn)。

3.3 提高實(shí)驗(yàn)操作技能

分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)的特色之一就是微量，在此綜合性實(shí)驗(yàn)中，加入氯仿離心后，需要在一個(gè)較為復(fù)雜的體系中吸取水相中的RNA，此過程伴有少許刺激性氣味，再加上吸取的量非常少，很容易吸到有機(jī)相中的蛋白質(zhì)或漂浮在液面上層的苯酚，因此，在這個(gè)步驟中，學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能可以得到很好的鍛煉；另外，在逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA和PCR擴(kuò)增 -actin基因片段這兩個(gè)步驟中，整個(gè)體系都是只有20 L，其中的模板、引物、酶、dNTP和緩沖液都不超過5 L，學(xué)生們加樣時(shí)需要格外小心，比如加樣之前觀察槍頭，預(yù)測所吸的溶液量是否達(dá)標(biāo)，加樣時(shí)全神貫注，片刻的分心都有可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，學(xué)生對(duì)于微量加樣的操作能力可以在此過程中得到極大的提高。

3.4 增強(qiáng)主觀能動(dòng)性，提高興趣

實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生全程獨(dú)立完成，從微量加樣到啟動(dòng)離心機(jī)，從瓊脂糖凝膠制備到啟動(dòng)電泳儀，教師只起到督促和提醒的作用，這樣學(xué)生可以全身投入，積極性很快就被調(diào)動(dòng)起來，并對(duì)這門學(xué)科產(chǎn)生濃厚的興趣，在這種情況下，一個(gè)良好的綜合性實(shí)驗(yàn)可能成為學(xué)生學(xué)習(xí)分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的動(dòng)力源泉和啟蒙點(diǎn)。

3.5 增強(qiáng)團(tuán)隊(duì)意識(shí)

隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，科學(xué)研究越來越重視團(tuán)隊(duì)合作，單靠一個(gè)人的力量很難事事通曉、面面俱到，因此，教師應(yīng)該有意識(shí)地培養(yǎng)學(xué)生與他人合作、交流、溝通的能力。在RNA提取、定量及RT-PCR綜合性實(shí)驗(yàn)中，幾乎每一步都牽涉到團(tuán)隊(duì)合作，比如為了高效率地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，需要等齊所有同學(xué)才開啟離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀，還有，瓊脂糖凝膠電泳過程中學(xué)生們的相互協(xié)作是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，因此，這個(gè)實(shí)驗(yàn)有效地提高了學(xué)生的團(tuán)隊(duì)意識(shí)。

4 教學(xué)體會(huì)

RNA提取、定量及RT-PCR綜合性實(shí)驗(yàn)所涉及的知識(shí)面非常廣，耗時(shí)較長，學(xué)生很難掌握每一個(gè)實(shí)驗(yàn)操作步驟和注意事項(xiàng)，也很難從始至終保持注意力的集中，筆者提出對(duì)此實(shí)驗(yàn)存在的問題及相應(yīng)對(duì)策總結(jié)如下：

（1）學(xué)生上實(shí)驗(yàn)課前不預(yù)習(xí)的現(xiàn)象普遍存在，在實(shí)驗(yàn)過程中只是“照單抓藥”機(jī)械性地操作，以致他們對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、操作、結(jié)果等不理解。完全依賴教師在實(shí)驗(yàn)課上的講解來學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，而且實(shí)驗(yàn)課的學(xué)時(shí)有限，教師的講解只是起引導(dǎo)性的作用，需要學(xué)生通過查找資料等課前預(yù)習(xí)的方式才能學(xué)習(xí)得更加細(xì)致和深入。所以，應(yīng)鼓勵(lì)學(xué)生在課前通過課本和網(wǎng)絡(luò)資源預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)，必要時(shí)教師可以在課前對(duì)學(xué)生進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的提問，以提高學(xué)生課前預(yù)習(xí)的積極性。

（2）實(shí)驗(yàn)過程中有些學(xué)生因操作失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的誤差過大甚至實(shí)驗(yàn)失敗，比如在RNA提取過程中的微量加樣和微量吸取，都是容易引起較大誤差的操作，部分學(xué)生因操作失誤使提取的RNA純度過低；有些學(xué)生在制備cDNA和PCR擴(kuò)增 -actin基因片段體系中漏加、多加試劑，導(dǎo)致 -actin基因片段擴(kuò)增失??；還有些學(xué)生在瓊脂糖凝膠電泳加樣時(shí)戳破凝膠，或沒有將樣品準(zhǔn)確加入梳孔中。這些失誤多為學(xué)生操作不熟練或者沒有經(jīng)過課前的預(yù)習(xí)所致，教師在實(shí)驗(yàn)過程中除了做示范，引導(dǎo)學(xué)生之外，還應(yīng)多鼓勵(lì)學(xué)生，告訴他們不必緊張。有條件的實(shí)驗(yàn)室還可以在周末開放實(shí)驗(yàn)室，讓學(xué)生吸取失敗的教訓(xùn)之后第二次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，彌補(bǔ)第一次實(shí)驗(yàn)的失誤，同時(shí)也給學(xué)生一個(gè)練習(xí)操作的機(jī)會(huì)。

（3）實(shí)驗(yàn)課結(jié)束后，有部分學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的態(tài)度不認(rèn)真，只是照抄實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書的目的、原理、操作步驟，再加上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這樣會(huì)大幅度降低了實(shí)驗(yàn)的預(yù)期效果，達(dá)不到完整的教學(xué)目的。對(duì)于這種情況，教師可以引導(dǎo)學(xué)生重視實(shí)驗(yàn)報(bào)告的討論部分，比如，各個(gè)操作步驟的目的，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)和注意事項(xiàng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，以及學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中的體會(huì)等等。務(wù)必使學(xué)生將實(shí)驗(yàn)課中所遇到的問題與理論知識(shí)聯(lián)系起來，解答問題并寫在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，達(dá)到實(shí)驗(yàn)課和理論課相互輔助的目的。

（4）RNA提取、定量及RT-PCR綜合性實(shí)驗(yàn)大約需要8個(gè)學(xué)時(shí)，在排課時(shí)有兩種可行方案。第一，可以將此綜合性實(shí)驗(yàn)分為兩次完成，第一次在完成RNA定量后結(jié)束，將另一部分提取好的RNA置于-20 ℃保存，第二次實(shí)驗(yàn)時(shí)取出RNA繼續(xù)完成RT-PCR部分。分兩次課做完這個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)。第二，課時(shí)安排允許的情況下，也可以在一天內(nèi)，如上午加下午或下午加晚上，一次性完成此綜合性實(shí)驗(yàn)，保證實(shí)驗(yàn)的連貫性，使同學(xué)們做實(shí)驗(yàn)時(shí)有更清晰的思路，更容易理解實(shí)驗(yàn)的前因后果。

*通訊作者：侯敢

基金項(xiàng)目：廣東省高等教育教學(xué)改革項(xiàng)目“基于培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力的分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)綜合改革與實(shí)踐”，廣東省高等教育教學(xué)改革項(xiàng)目“醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)實(shí)施班導(dǎo)師制的探索與實(shí)踐”，廣東省本科高校教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項(xiàng)目、廣東醫(yī)科大學(xué)教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程建設(shè)項(xiàng)目“臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)團(tuán)隊(duì)”。

參考文獻(xiàn)

[1] 李江濱，林錦瓊，李育超，等.“重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、提取及酶切分析”綜合性實(shí)驗(yàn)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)分子診斷學(xué)教學(xué)中的實(shí)施[J].教育教學(xué)論壇，2013.35：272-273.

[2] 褚玉新，王曉春.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的探討[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（社會(huì)科學(xué)版），2009.11（1）：245-246.

[3] 李江濱，譚熒飛，李育超.Western-blot綜合性實(shí)驗(yàn)在分子診斷學(xué)教學(xué)中的實(shí)施[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2012（36）：142.

[4] 姚群峰，黃必勝，薛津若，等.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)分子診斷學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革初探[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007.9（2）：6-7.

[5] 郝峰，郭素紅，王皓，等.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)本科分子診斷學(xué)課程教學(xué)探討[J].中國西部科技，2014.13（12）：66-71.