載紫杉醇PLGA多孔微球的可控制備及其對(duì)A549人肺癌細(xì)胞體外抑制作用的研究

張婉瑩，左 楊，奚菊群

（揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，江蘇 揚(yáng)州 225000）

載紫杉醇PLGA多孔微球的可控制備及其對(duì)A549人肺癌細(xì)胞體外抑制作用的研究

張婉瑩，左 楊，奚菊群

（揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，江蘇 揚(yáng)州 225000）

惡性腫瘤是近代威脅人類健康的重大疾病之一，改變給藥方式是目前抗腫瘤藥研究的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)，多孔微球作為一種藥物新劑型，在藥物新制劑的研發(fā)以及新劑型的改造方面應(yīng)用廣泛.本文以抗腫瘤藥物紫杉醇為模型藥物，聚乳酸羥基乙酸（PLGA）為載體，采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法（W/O/W）法制備載紫杉醇PLGA多孔微球.實(shí)驗(yàn)采用掃描電子顯微鏡、體外釋放等方法評(píng)價(jià)載藥多孔微球的性能；采用MTT法評(píng)價(jià)該載藥微球體外對(duì)A549人肺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性.實(shí)驗(yàn)顯示，載紫杉醇PLGA多孔微球?qū)549人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用.上述結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所得載藥多孔微球具有良好的藥物緩釋特性及抗腫瘤效應(yīng)，是一種具有良好應(yīng)用前景的肺部給藥載體.

紫杉醇；PLGA微球；多孔；A549人肺癌細(xì)胞

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，已成為我國(guó)城市人口惡性腫瘤死亡原因的第1位，而非小細(xì)胞型肺癌約占所有肺癌的80%，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期.臨床上常用紫杉醇[1]注射液輔助化療，但目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)紫杉醇（PTX）制劑在人體降解時(shí)釋放組胺，產(chǎn)生嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)，影響藥物分子向組織間擴(kuò)散.為了提高紫杉醇藥物的穩(wěn)定性，水溶性和生物利用度，減少副作用，改變其傳遞方式以成為一個(gè)新的發(fā)展領(lǐng)域.多孔微球作為一種藥物新劑型，在藥物新制劑的研發(fā)以及新劑型的改造方面應(yīng)用廣泛[2].制備多孔微球的高分子材料有聚多糖類，氨基酸類，聚乙烯醇，聚丙烯酸，聚苯乙烯等，其中常用的為聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid）[3]，簡(jiǎn)稱PLGA.該材料由兩種單體——乳酸（LA）和羥基乙酸（GA）隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無(wú)毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料等領(lǐng)域. PLGA多孔微球在具備普通微球特點(diǎn)的同時(shí)，擁有自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4]，如：由于多孔結(jié)構(gòu)具有大的比表面積和孔體積，藥物可吸附在多孔微球的表面或進(jìn)入孔道內(nèi)部，通過(guò)孔結(jié)構(gòu)的調(diào)整可實(shí)現(xiàn)藥物釋放速度的可控；多孔結(jié)構(gòu)致使微球密度低，可通過(guò)微球粒徑和孔徑獲得較為理想空氣動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，便于吸入給藥，提高藥物在肺部的沉積，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間等.本文采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法[5]（W/O/W）制備載PTX的PLGA多孔微球，考察致孔劑牛血清白蛋白（BSA）[6]的濃度對(duì)多孔微球粒徑和孔徑大小的影響.通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，與游離PTX對(duì)比，觀察其對(duì)A549人肺癌細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng).

1 材料與方法

1.1 主要藥品

紫杉醇，純度98%，購(gòu)自Adamas公司；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA） 購(gòu)自美國(guó) kinalnc-PolyScitech公司；二氯甲烷（DCM，AR），牛乳清蛋白(BSA）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯醇（PVA）購(gòu)自Acros Organics公司；培養(yǎng)基1640購(gòu)自美國(guó)hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；

青霉素/鏈霉素，胰酶細(xì)胞消化液，二甲基亞砜購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.

1.2 載紫杉醇PLGA多孔微球的制備

采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備載藥多孔微球，具體步驟如下：將50mg PLGA和30mg紫杉醇溶于1mL二氯甲烷中.將20mg BSA溶于0.2mL去離子水.將兩種溶液混合后，冰浴條件下超聲20s，并轉(zhuǎn)移至5mL4%PVA溶液中.隨后用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行攪拌（5min，8000r/min），再倒入100mL0.4%PVA溶液.最后室溫下機(jī)械攪拌（800r/min）過(guò)夜.離心得沉淀，并水洗3-5次，取其上清液備用.取少量沉淀滴于載玻片，自然干燥后用掃描電鏡測(cè)定結(jié)果，其余冷凍干燥后稱重，備用.

1.3 載藥微球的形貌

掃描電鏡下觀察載藥微球形貌：取適量載藥微球粉末置于載物臺(tái)上的導(dǎo)電膠上，使其均勻分布，并將載物臺(tái)置于MW-GX-808鍍膜儀上噴金5min后，對(duì)載藥微球的形態(tài)、大小進(jìn)行觀察.

1.4 載藥微球的包封率與載藥率

量取步驟1.2中的上清液10mL，采用紫外-可見分光光度計(jì)在測(cè)其吸收值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出包裹于微球中的藥量.通過(guò)公式計(jì)算載藥微球載藥率和包封率[7].

計(jì)算公式：

1.5 載藥微球的釋放曲線

選取PBS溶液作為溶劑，將載藥微球溶于釋放介質(zhì)中，配制成質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的溶液，分別吸取2mL上述溶液置于透析袋，并放置于30mL PBS釋放介質(zhì)中，于37℃條件下震蕩，轉(zhuǎn)速為100 r/min.定時(shí)吸取透析液5mL，并及時(shí)補(bǔ)充等量新鮮釋放介質(zhì)，過(guò)濾，稀釋后測(cè)定藥物的濃度.

1.6 載藥微球的體外緩釋抑制腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)

在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入8mL1640完全培養(yǎng)基，將復(fù)蘇好的A549細(xì)胞均勻置于其中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至90-100%時(shí)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104/mL.在96孔板接板時(shí)，每孔加100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組（不加細(xì)胞僅加完全培養(yǎng)基）、對(duì)照組（加細(xì)胞與完全培養(yǎng)基但不加藥），置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)24h后，分別加入0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、8.0mg/mL的載藥微球的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h.培養(yǎng)結(jié)束后，每孔避光加入20μL MTT溶液，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)反應(yīng)4h.待反應(yīng)結(jié)束后取出96孔板，除去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基和MTT，加入100μL DMSO，室溫下振搖2min，充分溶解后于492nm處測(cè)定各孔的吸光度A[8].

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA濃度對(duì)多孔微球形貌的影響

制備空白微球過(guò)程中，制孔劑BSA的濃度對(duì)所得PLGA多孔微球形態(tài)和尺寸均有影響.選取PLGA分子量為45 kp，LA/GA為85/15，改變BSA與PLGA質(zhì)量比為0.2，0.4，0.6，0.8，制備空白多孔微球，所得微球室溫下放置穩(wěn)定，加入雙蒸水后呈現(xiàn)為白色乳狀溶液，分散性良好，微球尺寸均一，流動(dòng)性好且無(wú)明顯黏連，掃描電鏡下微球表面光滑、均勻飽滿，如圖1所示.使用IMAGE pro軟件對(duì)所得電鏡圖片進(jìn)行整理比對(duì)，微球直徑范圍為4-9μm，出現(xiàn)最多的是直徑為8μm，微球孔徑分布于0.2-0.5μm，符合正態(tài)分布.此外由圖可見隨著BSA/PLGA比例的提高，多孔微球的粒徑和孔徑也隨之增大，說(shuō)明BSA的含量與多孔PLGA微球的粒徑和孔徑成正比.當(dāng)致孔劑濃度增加時(shí)，在內(nèi)相有機(jī)溶劑的揮發(fā)過(guò)程，更多的致孔劑易穿過(guò)載體形成包膜，從而導(dǎo)致微球孔徑增大，內(nèi)外壓力差導(dǎo)致微球粒徑增大.

圖1 PLGA多孔藥微球的形貌的SEM圖（a，b，c分別代表BSA/PLGA為0.2，0.4，0.6）

2.2 載藥微球包封率和載藥率

考察投藥比對(duì)載藥微球包封率和載藥率的影響，結(jié)果如表1所示.隨著投藥量的增加，載藥微球的載藥率上升，包封率下降.在投藥比為10：3時(shí)，制得的微球包封率和載藥率最佳，且微球具有良好的形態(tài)，粒徑也較為均勻.

表1 不同投藥比條件下載紫杉醇PLGA多孔微球的載藥率與包封率

2.3 載藥微球體外釋放曲線

不同的投藥比條件下，載紫杉醇PLGA多孔微球均具有明顯的緩釋現(xiàn)象，如圖2所示，將載紫杉包裹在PLGA微球里，藥物的釋放時(shí)間可延長(zhǎng)至10天，且釋放曲線平緩，說(shuō)明制備的載藥微球具有緩釋，持久的性質(zhì).

圖2 不同投藥比條件下載紫杉醇PLGA多孔微球的體外釋放曲線

2.4 載藥微球體外抑制A549細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

以不同濃度的載紫杉醇PLGA（PP）微球溶液分別作用于A549細(xì)胞24h，MTT法測(cè)定各組吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力.如圖3所示，處理細(xì)胞24h后，0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、8.0mg/mL對(duì)A549細(xì)胞增殖均有抑制作用（p＜0.001）.相同含量的紫杉醇對(duì)照組也均有抑制作用.根據(jù)結(jié)果表明載紫杉醇PLGA多孔微球在終濃度為4-8mg/mL的范圍內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞有明顯的抑制作用,并且與實(shí)際載藥量乘以釋放速率的紫杉醇對(duì)照組作比較，說(shuō)明緩釋PLGA多孔載藥微球具有一定的藥效.

圖3 MTT法檢測(cè)載紫杉醇PLGA多孔微球?qū)549細(xì)胞的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制得的載紫杉醇PLGA多孔微球具有較高的包封率和載藥量，粒徑為2-6微米左右，顯微鏡下照片顯示微球形態(tài)圓整，無(wú)粘連.體外釋放試驗(yàn)表明，藥物在10天左右釋放完全.在體外實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)不同濃度的載藥微球?qū)549抗腫瘤抑制作用，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加而作用增強(qiáng)，與游離PTX比較，結(jié)果顯示PLGA能夠增加PTX的藥效及其緩釋功能.

〔1〕陸紅霞,徐叢劍,李斌.紫杉醇劑型,臨床用藥方式及聯(lián)合用藥的進(jìn)展 [J].國(guó)外醫(yī)學(xué)-藥學(xué)分冊(cè), 2005,32(2):73-77.

〔2〕Meenach SA,Kim YJ,Kauffman KJ,et al. Synthesis,optimization,and characterization of camptothecin-loaded acetalated dextran porous microparticles for pulmonary delivery [J].Mol Pharm,2012,9(2):290-298.

〔3〕陳斌.斑蝥素PLGA緩釋微球的制備及其緩釋作用的研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2010,45(7):532-533.

〔4〕Lee J,Oh YJ,Lee SK,Lee KY.Facile control of porous structures of polymer microspheres using an osmoticagent for pulmonary delivery [J].J Control Release,2010,146(1):61-67.

〔5〕An T,Choi J,Kim A,et al.Sustained release of risperidone from biodegradable microspheres prepared by in-situ suspension-evaporation process [J].Int J Pharm,2016,503(1-2):8-15.

〔6〕Feng T,Tian H,Xu C,et al.Synergistic codelivery of doxorubicin and paclitaxel by porous PLGA microspheres for pulmonary inhalation treatment [J].Eur J Pharm Biopharm, 2014,88(3):1086-1093.

〔7〕Cui Y,Xu Q,Chow PK,et al.Transferrin-conjugated magnetic silica PLGA nanoparticles loaded with doxorubicin and paclitaxelfor brain glioma treatment [J].Biomaterials,2013, 34(33):8511-8520.

〔8〕楊方,張碩,鄭思維,等.無(wú)穩(wěn)定劑修飾的漢防己甲素PLGA納米粒制備及體外評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)院藥雜志,2015,35(15):1375-1380.

R285

A

1673-260X（2017）02-0069-03

2016-12-17

江蘇省自然科學(xué)基金(No.BK20130437 and BK20130439)