張良,陳文靜,郭剛強(qiáng),孫祥威,葉璐璐,胡暢遠(yuǎn),金勁激,沈賢,薛向陽(yáng)
(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 分子病毒與免疫研究所 熱帶醫(yī)學(xué)研究所,浙江 溫州 325035;3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科,浙江 溫州 325027)
?論 著?
誘導(dǎo)性表達(dá)人巨細(xì)胞病毒UL138蛋白的胃癌細(xì)胞株構(gòu)建及其效應(yīng)評(píng)價(jià)
張良1,陳文靜1,郭剛強(qiáng)2,孫祥威1,葉璐璐2,胡暢遠(yuǎn)1,金勁激1,沈賢3,薛向陽(yáng)2
(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 分子病毒與免疫研究所 熱帶醫(yī)學(xué)研究所,浙江 溫州 325035;3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科,浙江 溫州 325027)
目的:構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)人巨細(xì)胞病毒(HCMV)UL138蛋白的穩(wěn)定遺傳胃癌細(xì)胞系,并評(píng)價(jià)UL138對(duì)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。方法:將pCMV-tet3G質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞,通過(guò)G418及熒光素酶活性檢測(cè)篩選BGCTet-on細(xì)胞株。再將含有UL138外源基因的pTRE3G-UL138質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定BGCTet-on細(xì)胞株,通過(guò)G418及潮霉素雙抗篩選,獲得誘導(dǎo)性表達(dá)UL138基因的胃癌細(xì)胞(BGC-UL138Tet-on)。強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)后,采用Western blot驗(yàn)證UL138蛋白表達(dá),采用流式細(xì)胞術(shù)及CCK8試劑盒檢測(cè)UL138蛋白表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期及增殖的影響。構(gòu)建荷瘤裸鼠模型,體內(nèi)驗(yàn)證UL138蛋白表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:成功構(gòu)建了DOX誘導(dǎo)性表達(dá)的、攜帶UL138基因的BGC-UL138Tet-on穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。UL138蛋白表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示UL138蛋白表達(dá)阻滯BGC-823細(xì)胞周期在G1期。荷瘤裸鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DOX腹腔注射誘導(dǎo)UL138蛋白表達(dá)后,BGC-UL138Tet-on移植瘤體積縮小甚至消失。結(jié)論:成功構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)UL138蛋白的胃癌細(xì)胞株,進(jìn)一步證實(shí)HCMV基因UL138的表達(dá)可在體內(nèi)和體外抑制胃癌細(xì)胞的增殖,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞周期阻斷在G1期。
巨細(xì)胞病毒;UL138;Tet-on系統(tǒng);胃腫瘤;基因,腫瘤抑制
人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)屬于β皰疹病毒科,是人類皰疹病毒中最大的一種病毒,人群普遍感染,其在人群中感染率達(dá)到70%~100%[1]。HCMV基因組約230 kb,約含200個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼至少22條microRNA[2-5]及一些長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,LncRNA)[6]。UL138是HCMV潛伏感染相關(guān)的基因,定位于UL/b’區(qū)的UL133-UL138基因簇[7]。我們前期研究顯示,UL138表達(dá)于胃癌及癌旁正常組織[8],但胃癌組織中表達(dá)明顯下調(diào),尤其在低分化胃癌組織[9]。采用真核質(zhì)粒過(guò)表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示,UL138是具有抑癌效應(yīng)的HCMV基因。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)UL138在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng),本研究利用Tet-on系統(tǒng),構(gòu)建誘導(dǎo)性表達(dá)UL138基因的胃癌細(xì)胞系,進(jìn)一步明確UL138基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞基本生物學(xué)特征的影響。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞株:人胃癌細(xì)胞株BGC-823購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。
1.1.2 質(zhì)粒:含UL138基因的重組pcDNA3.1-UL138質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建;pCMV-tet3G質(zhì)粒和pTRE3GLuc質(zhì)粒均購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。
1.1.3 細(xì)菌:大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.4 動(dòng)物:BALB/c裸鼠,雌性,4~5周齡,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證編號(hào): SCXK(滬)2012-0002。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.1.5 試劑:UL138特異性抗體由本實(shí)驗(yàn)室前期制備[10];1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;trizol試劑及Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;E.Z.N.A.Endo-free Plasmid Mini Kit購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司;強(qiáng)力霉素(doxycycline,DOX)和G418(遺傳霉素)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;Taq Mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)BioRad公司;FITC標(biāo)記的二抗購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;流式凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司;CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司。
1.2 方法
1.2.1 可誘導(dǎo)表達(dá)UL138蛋白的BGCTet-on3G細(xì)胞系(BGC-UL138Tet-on)構(gòu)建及鑒定:以pcDNA3.1-UL138為模板,前引物為5’-CCGGATATCGCCACCATGGACGAT CTGCCGCT-3’,后引物為5’-CGCGGATCCTTATCACG TGTATTCTTGATGATAA-3’,通過(guò)PCR方法獲得UL138片段,通過(guò)EcoRV和BamHI限制性內(nèi)切酶插入到pTRE3G(3 431 bp)質(zhì)粒中,獲得TRE-UL138重組質(zhì)粒。BGC-823細(xì)胞在含5% CO2、飽和濕度、37 ℃條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)Clontech公司的Tet-On?Advanced Inducible Gene Expression Systems操作步驟,最終通過(guò)G418篩選以及有限稀釋法獲得轉(zhuǎn)染成功的單克隆BGCTet-on細(xì)胞株。將單克隆株轉(zhuǎn)染pTRE3G-Luc質(zhì)粒,利用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光,選擇熒光表達(dá)最強(qiáng)的克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染TREUL138質(zhì)粒到BGCTet-on細(xì)胞,在G418和潮霉素的聯(lián)合篩選下,獲得BGC-UL138Tet-on細(xì)胞株克隆。將細(xì)胞克隆消化鋪6孔板,每個(gè)克隆鋪2個(gè)孔,其中1個(gè)孔加入DOX 2 μmol,另外1個(gè)孔作為對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng)48 h以后,提取細(xì)胞RNA,利用UL138特異前向引物(5’-GGCACGACACCTTCAAAC-3’)和特異反向引物(5’-AGACACTTCCTCCCAACG-3’),RT-PCR檢測(cè)UL138基因轉(zhuǎn)錄。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增為200 bp。
1.2.2 DOX最佳誘導(dǎo)濃度篩選:通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)獲取誘導(dǎo)效率最高的克隆株培養(yǎng)在6孔板內(nèi),每個(gè)孔約105個(gè)細(xì)胞,按照0、100、200、500、1 000 ng/mL的濃度加入DOX,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞蛋白質(zhì),并采用Western blot方法驗(yàn)證UL138蛋白表達(dá)量。
1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄:將細(xì)胞消化離心,加入1 mL trizol試劑,充分吹打,置冰上10 min后,加入200 μL的氯仿,充分震蕩混勻,置冰上15 min,在12 000×g 4 ℃下離心20 min,吸取上清,加入等體積的異丙醇,來(lái)回震蕩混勻,在冰上沉淀20 min,在12 000×g 4 ℃下離心15 min,棄上清,加入1 mL 80%的乙醇,再次沉淀5 min,然后在10 000×g 4 ℃下離心10 min,棄乙醇,在冰上晾干5 min左右,加入無(wú)酶水溶解。采用去DNA試劑盒,將RNA中DNA除去,最后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書,將1 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,準(zhǔn)備PCR鑒定。
1.2.4 Western blot檢測(cè):將細(xì)胞裂解從而獲取細(xì)胞總蛋白,在12%的SDS-PAGE中電泳分離,再在轉(zhuǎn)膜緩沖液中將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,在37 ℃含5%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h,再孵育一抗,UL138兔抗(1∶10 000,實(shí)驗(yàn)室制備)和GAPDH兔抗(1∶1 000,杭州賢至生物科技有限公司),4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜,HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗在室溫結(jié)合1.5 h后,用ECL發(fā)光液標(biāo)記。
1.2.5 免疫熒光檢測(cè):細(xì)胞消化爬片,6 h以后加入調(diào)整DOX濃度至200 ng/mL,誘導(dǎo)48 h后,細(xì)胞爬片用PBS洗3次,用4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗3次,再用0.3%的曲拉通打孔10 min,PBS洗3次,然后用含10% FBS的培養(yǎng)基37 ℃下封閉2 h,更換培養(yǎng)基,加UL138兔抗(1∶1 000)孵育1 h。PBS洗3次,用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗在37 ℃下避光孵育1 h。再用PBS洗3次,加入DAPI染核,37 ℃孵育10 min,PBS洗3次,最后滴加抗熒光淬滅劑封片。
1.2.6 流式細(xì)胞術(shù):將細(xì)胞消化鋪至6孔板,待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為2組,No DOX組,即不加DOX;DOX組,加入DOX 400 ng/mL,48 h后將細(xì)胞用PBS洗2次,消化,控制細(xì)胞濃度在1×106/mL左右,1 000 r/min離心3 min,PBS洗1次,然后將細(xì)胞用0.4%多聚甲醛固定10 min,再用PBS洗1次,動(dòng)作輕柔,再根據(jù)FITC凋亡試劑盒說(shuō)明書,加入PI染料,染色,上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。
1.2.7 細(xì)胞相對(duì)存活率檢測(cè):將BGC-823細(xì)胞和BGC-UL138Tet-on細(xì)胞消化,分別鋪在96孔板內(nèi),每孔2×104個(gè)細(xì)胞,分別設(shè)置DOX組和No DOX組,其中BGC-UL138Tet-on細(xì)胞設(shè)置400 ng/mL和200 ng/mL的2個(gè)DOX誘導(dǎo)濃度,BGC-823細(xì)胞200 ng/mL的DOX誘導(dǎo)濃度,設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,6 h后按組加入相應(yīng)的DOX,48 h后,換無(wú)血清培養(yǎng)基,并加入CCK8試劑,檢測(cè)細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度。根據(jù)說(shuō)明書計(jì)算相對(duì)存活率。
1.2.8 荷瘤裸鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn):取生長(zhǎng)狀態(tài)相似的健康BALB/c裸鼠共15只,將裸鼠隨機(jī)分成A、B、C 3組,每組5只。其中A組裸鼠接種BGCTet-on細(xì)胞,B組和C組接種BGC-UL138Tet-on細(xì)胞株。接種方法為:在裸鼠右背部皮下接種細(xì)胞,濃度為2×107個(gè)/mL,接種0.1 mL。從接種時(shí)間開始算起,第7天測(cè)腫瘤大小,第10天開始A組和B組裸鼠腹腔注射500 μg/mL的DOX,連續(xù)注射3 d,并在水中加入1 mg/mL DOX喂養(yǎng),3 d測(cè)1次腫瘤大小,用卡尺測(cè)量其長(zhǎng)(a)和寬(b),并計(jì)算體積V(mm3)=ab2/2。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用±s表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 BGC-UL138Tet-on細(xì)胞的篩選及UL138蛋白表達(dá)驗(yàn)證 熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),經(jīng)DOX誘導(dǎo)后,BGCTet-on細(xì)胞克隆株的熒光素酶活性為2.6×105~5.2× 105,見圖1A。為此,進(jìn)一步將pTRE-UL138重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BGCTet-on細(xì)胞克隆株,并在潮霉素和G418篩選下,篩選可誘導(dǎo)表達(dá)UL138蛋白的BGC-UL138Tet-on細(xì)胞株。RT-PCR結(jié)果顯示,BGC-UL138Tet-on細(xì)胞克隆株均可檢測(cè)到UL138 RNA,見圖1B。DOX濃度梯度誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)隨著DOX濃度增加,UL138蛋白的表達(dá)量也隨之上升。當(dāng)沒(méi)有DOX時(shí),UL138蛋白沒(méi)有表達(dá),見圖1C。進(jìn)一步利用免疫熒光檢測(cè),發(fā)現(xiàn)BGCUL138Tet-on細(xì)胞在DOX誘導(dǎo)的情況下,UL138蛋白的表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),其單視野內(nèi)細(xì)胞的表達(dá)陽(yáng)性率約為70%。顯微鏡下UL138蛋白表達(dá)情況,見圖1D。在DOX使用情況下,BGC-UL138Tet-on細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)UL138蛋白,而沒(méi)有DOX時(shí),不表達(dá)UL138蛋白。
2.2 BGC-UL138Tet-on細(xì)胞UL138基因穩(wěn)定性分析 為了驗(yàn)證BGC-UL138Tet-on細(xì)胞在傳代過(guò)程中仍然保存有可被DOX誘導(dǎo)UL138表達(dá)的能力,我們通過(guò)連續(xù)傳代細(xì)胞3次,并在每1代細(xì)胞設(shè)置DOX組和No DOX組。結(jié)果顯示,在每次連續(xù)傳代中,細(xì)胞能穩(wěn)定保持這種可誘導(dǎo)表達(dá)能力,見圖2。
2.3 UL138蛋白表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響 DOX誘導(dǎo)48 h后,BGC-UL138Tet-on細(xì)胞出現(xiàn)死亡,而BGCTet-on細(xì)胞克隆株以及無(wú)DOX誘導(dǎo)下BGCUL138Tet-on細(xì)胞生長(zhǎng)未見影響,見圖3A。CCK8實(shí)驗(yàn)顯示,DOX誘導(dǎo)48 h之后,BGC-UL138Tet-on細(xì)胞的相對(duì)生存率顯著下降,DOX為200 ng/mL時(shí),BGC-UL138Tet-on相對(duì)生存率為(44.97±1.44)%,而BGC-823的相對(duì)生存率為(87.95±2.04)%;DOX為400 ng/mL時(shí),相對(duì)生存率為(32.36±2.50)%,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖3B。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),No DOX組細(xì)胞周期G0/G1、S、G2/M期的細(xì)胞數(shù)量百分比分別為(55.96±1.50)%、(36.97±1.59)%、(7.26±0.08)%,而DOX組細(xì)胞周期G0/G1、S、G2/M期的細(xì)胞數(shù)量百分比為(64.07± 0.97)%、(27.19±1.01)%、(8.71±0.22)%。當(dāng)DOX誘導(dǎo)時(shí),BGC-823細(xì)胞更多地存在于G1期,見圖3C-D。
圖1 BGC-UL138Tet-on細(xì)胞的篩選及UL138蛋白表達(dá)驗(yàn)證
圖2 DOX誘導(dǎo)不同代數(shù)BGC-UL138Tet-on細(xì)胞UL138蛋白表達(dá)情況
圖3 UL138蛋白表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖的影響
2.4 荷瘤裸鼠模型實(shí)驗(yàn) 成功構(gòu)建了裸鼠的荷瘤模型,并且發(fā)現(xiàn)了在DOX的誘導(dǎo)下BGC-UL138Tet-on細(xì)胞株的移植瘤逐漸減少,而其他2組則沒(méi)有,DOX是在第10天開始干預(yù),見圖4A。在DOX誘導(dǎo)后第21天(接種后第31天),B組BGC-UL138Tet-on的移植瘤裸鼠腫瘤幾乎消失。然而,作為對(duì)照的A組和C組細(xì)胞移植瘤持續(xù)增大,見圖4B。
圖4 荷瘤裸鼠模型實(shí)驗(yàn)
自從CRAIG等[11]第1次分離出HCMV距今已經(jīng)60年左右,既往HCMV感染主要危害集中在單核細(xì)胞增多癥、先天感染引起胎兒畸形,以及艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)和器官移植患者體內(nèi)HCMV感染[12],另外HCMV的感染也與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)等自身免疫系統(tǒng)疾病存在相關(guān)性[13-14]。近年來(lái)的研究顯示,HCMV與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞[15]、乳腺癌[16]、前列腺癌[17]、結(jié)直腸癌[18]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)HCMV潛伏感染與胃癌相關(guān)[19]。
UL138基因位于HCMV基因組UL/b’區(qū)的UL133-138基因座內(nèi),在臨床病毒株中十分保守[20]。UL138作為HCMV對(duì)抗宿主細(xì)胞防御的病毒基因,能夠幫助HCMV順利進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)[21]。HCMV感染細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)誘導(dǎo)UL138蛋白表達(dá)[22]。HCMV潛伏過(guò)程表達(dá)的UL138蛋白定位于高爾基體[23],可上調(diào)細(xì)胞TNF受體表達(dá)[24],并能與細(xì)胞內(nèi)MRP1蛋白結(jié)合,影響細(xì)胞的耐藥機(jī)制[25]。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞中,UL138可能具有抑癌基因的功能,能封閉HSP70的作用,引起胃癌細(xì)胞凋亡[9]?;谶@種效應(yīng),我們利用Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)UL138蛋白的BGC-823細(xì)胞株,進(jìn)一步評(píng)價(jià)UL138蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,并在裸鼠體內(nèi)驗(yàn)證。結(jié)果顯示,與前期質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果一致,DOX誘導(dǎo)BGCUL138Tet-on細(xì)胞UL138蛋白表達(dá),在體內(nèi)和體外均可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖,使細(xì)胞周期阻滯在G1期。
Tet-on系統(tǒng)是真核生物體內(nèi)可控制誘導(dǎo)表達(dá)外源性基因的系統(tǒng),具有穩(wěn)定、可調(diào)控、低噪點(diǎn)、高表達(dá)的特點(diǎn),被廣泛使用[26]。白志強(qiáng)等[27]利用Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建了可誘導(dǎo)表達(dá)HCMV IE2基因的肝癌細(xì)胞系,驗(yàn)證了IE2基因抗凋亡的作用。YAO等[28]基于Tet-on改建的可誘導(dǎo)表達(dá)DRD1蛋白細(xì)胞株,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究提供了重要工具。本研究首次構(gòu)建了可誘導(dǎo)表達(dá)HCMV UL138蛋白的胃癌BGC-823細(xì)胞株,具有穩(wěn)定的遺傳特性。在DOX誘導(dǎo)下,UL138蛋白表達(dá)量高;在無(wú)DOX存在下,UL138幾乎不表達(dá)。我們能通過(guò)調(diào)節(jié)DOX濃度,從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)UL138蛋白表達(dá)濃度的目的,相比于瞬轉(zhuǎn)UL138的真核表達(dá)質(zhì)粒,Tet-on系統(tǒng)是一種更可靠的實(shí)驗(yàn)工具,而且只要低劑量的DOX便可以誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)UL138蛋白。因此,在研究UL138蛋白功能時(shí),可明顯減少其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。但是,免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),DOX誘導(dǎo)下,并非全部的細(xì)胞均可高表達(dá)目的基因,這提示Tet-on系統(tǒng)用于外源基因功能的研究亦存在一定不足。
關(guān)于腫瘤與感染主流的觀點(diǎn)是,病原體感染是腫瘤的病因或可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。少數(shù)研究也發(fā)現(xiàn),有些病原體可溶瘤或抑制腫瘤細(xì)胞增殖[29-30],但迄今尚未見報(bào)道有殺瘤或抑瘤效應(yīng)的病毒基因。本研究證實(shí)HCMV的UL138是具有抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的病毒基因,將是一種潛在胃癌藥物開發(fā)的切入點(diǎn)。
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(本文編輯:吳昔昔)
Establishment and its impact evaluation of a gastric cancer cell line with inducible expression of human
cytomegalovirus UL138 protein
ZHANG Liang1, CHEN Wenjing1, GUO Gangqiang2, SUN Xiangwei1, YE Lu-
lu2, HU Changyuan1, JIN Jinji1, SHEN Xian3, XUE Xiangyang2. 1.Department of Gastrointestinal Surgery, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Microbiology and Immunology, Institute of Molecular Virology and Immunology, Institute of Tropical Medicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 3.Department of Gastrointestinal Surgery, the Second Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027
Objective:To establish a stably inherited gastric cell line with inducible expression of human cytomegalovirus UL138 protein and then to evaluate the biological effect of UL138 protein on gastric cancers (GCs), which will offer a convincing tool for researching the specif c function of UL138 protein impact on GCs.Methods:Transfect pCMV-tet3G plasmids into BGC-823 and then screen for stablely transfected clones BGCTet-onby G418 and luciferase assay. Then transfect the recombinant plasmid pTRE3G-UL138 into the selected clone and screen for stably transfected clones BGC-UL138Tet-onby G418 and hygromycin. Validate the expression of UL138 induced by doxycycline (DOX) by western blot. Besides, detect the growth impact of UL138 protein on GCs by f ow cytometry and CCK8 test. Establish GC xenograft nude mice models and verify the GC inhibition function of UL138 protein in vivo.Results:Gastric cancer cell line BGC-UL138Tet-onwith DOX inducible expression of human cytomegalovirus UL138 protein was successfully established. Expression of UL138 protein inhibited proliferation of GC cells distinctly. Flow cytometry test indicated UL138 protein could block GC cell cycle at G1phase. The data of GC xenograft nude mice models further demonstrated that the BGC-UL138Tet-onxenografts were decreased, and evendisappeared, when UL138 expression was induced by DOX intraperitoneal injection.Conclusion:We successfully established a specif c GC cell line with inducible expression of human cytomegalovirus UL138 protein and then we found HCMV UL138 gene could inhibit proliferation of GC cells in vitro and in vivo and block its cell cycle.
cytomegalovirus; UL138; Tet-on system; gastric neoplasms; genes, tumor suppressor
R373.9
A
10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.001
2016-05-31
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81472308,81001343,31470891);溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目(Y2015 0054,Y20150057)。
張良(1991-),男,浙江溫州人,碩士生。
薛向陽(yáng),副教授,Email:wzxxy001@163.com。