溶血對酮胺氧化酶法測定糖化清蛋白結(jié)果的影響與校正*

張世昌，楊璐，李云飛，陳曉婷，石晶，汪琪，張炳峰

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗學部，南京 210029)

·臨床檢驗技術研究·

溶血對酮胺氧化酶法測定糖化清蛋白結(jié)果的影響與校正*

張世昌，楊璐，李云飛，陳曉婷，石晶，汪琪，張炳峰

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗學部，南京 210029)

目的 評價標本溶血對酮胺氧化酶法測定糖化清蛋白(GA)的影響，并建立有效的校正方法。方法 酮胺氧化酶法測定無溶血血清GA濃度及其對應人工溶血血清GA濃度、溶血指數(shù)；分析溶血對GA檢測結(jié)果的影響及二者的相關性；利用多元回歸分析建立糾正公式，用于臨床溶血標本的GA測定值的數(shù)學糾正。結(jié)果 溶血降低酮胺氧化酶法GA測定結(jié)果(P<0.01)，溶血程度與GA濃度呈負相關(R2=0.943 4)；以無溶血血清GA濃度為Y，其對應人工溶血血清GA濃度為Z，溶血吸光度值為X，經(jīng)多元回歸分析，糾正公式為Y=2.468X+Z-0.015 73；溶血標本GA濃度經(jīng)公式糾正后GA濃度偏移均小于10%。結(jié)論 標本溶血可導致酮胺氧化酶法GA檢測結(jié)果降低，運用糾正公式可有效校正溶血對GA測定的干擾，符合臨床要求。

溶血；糖化清蛋白；干擾；校正

糖尿病是一種可引起多系統(tǒng)病變和并發(fā)癥的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]，嚴格控制血糖水平是治療糖尿病及預防其各種并發(fā)癥的有效手段[2-3]。糖化清蛋白(glycated albumin，GA)是葡萄糖與血漿清蛋白發(fā)生非酶促糖化反應的產(chǎn)物，能反映近2～3周內(nèi)的血糖水平，作為糖尿病輔助診斷、治療和預防監(jiān)測的重要指標已廣泛應用于臨床[4-5]。酮胺氧化酶法是目前臨床檢測GA應用最多的方法，而溶血是臨床檢驗血標本中常出現(xiàn)的一種現(xiàn)象，但溶血對GA濃度檢測的影響尚不明確[4-6]。本研究觀察溶血對酮胺氧化酶法測定GA濃度的影響，并探討利用AU5800自動生化分析儀的溶血指數(shù)對溶血標本GA值糾正的可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 酮胺氧化酶法GA試劑盒(Lucica GA-L，批號1503A，含溴甲酚紫法測定清蛋白的配套試劑)及配套標準品(批號1501A)、質(zhì)控品(批號150810)購自日本旭化成制藥株式會社；奧林巴斯AU5800全自動生化分析儀。

1.2 樣本收集與處理 收集本院門診或住院患者無溶血、黃疸、脂血血清和對應患者EDTA-K2抗凝全血。

1.2.1 人工溶血液制備 將EDTA-K2抗凝血2 mL以3 000 r/min離心5 min，收集紅細胞，用生理鹽水洗滌紅細胞3次，將標本于-80 ℃反復凍融3次，加生理鹽水至總體積2 mL，以雅培1700血液分析儀檢測Hb濃度。根據(jù)Hb濃度用生理鹽水配成Hb濃度為5、10、20、40、80 g/L的溶血液。

1.2.2 人工溶血標本制備 分別取20 μL上述溶

血液與對應患者血清180 μL混合，制備成Hb濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L的血清標本；將20 μL生理鹽水加入180 μL血清中，作為對應患者的無溶血血清。

1.3 項目儀器參數(shù)設置與檢測

1.3.1 GA濃度 終點法，主波長540 nm，副波長700 nm，樣本3.0 μL，試劑1(R1)120 μL，試劑2(R2) 30 μL，反應時間為5 min。

1.3.2 清蛋白濃度 終點法，主波長600 nm，副波長660 nm，樣本1.5 μL，R1 110 μL，R2 55 μL，反應時間為5 min。

1.3.3 檢測 在AU5800自動生化分析儀上分別檢測清蛋白、GA、血清信息指數(shù)(LIH)等指標。以LIH檢測信息中溶血信息的吸光度(A)值作為標本溶血指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行。溶血與對應無溶血標本結(jié)果的比較用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；相關分析用Pearson相關性分析；糾正公式通過多元回歸分析，擬合計算回歸曲線。

2 實驗與結(jié)果

2.1 Hb濃度與A值的關系 以Hb濃度為X，A值為Y，對變量X、Y進行回歸分析，決定系數(shù)(R2)=0.999 7，A值與溶血標本的Hb濃度呈線性正相關，見圖1。AU5800分析儀LIH檢測標本溶血指數(shù)A值可有效代替標本溶血程度。

圖1 溶血標本Hb濃度與檢測A值相關性分析結(jié)果

2.2 不同程度溶血對不同濃度GA檢測結(jié)果的影響 將11份患者血清(GA濃度9.60%～41.47%)分別用溶血液配置成含8、4、2、1、0.5、0 g/L Hb的溶血標本，獲得不同溶血程度的標本，分別檢測溶血與無溶血標本GA濃度和溶血程度。同一患者標本隨溶血程度增加，GA逐漸降低；以無溶血標本GA濃度作為原值，計算溶血標本GA檢測結(jié)果偏移，GA濃度越低，溶血導致GA檢測結(jié)果偏移越大；將溶血標本與對應無溶血標本GA濃度進行配對t檢驗，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，標本溶血對GA檢測結(jié)果存在嚴重影響。以代表溶血程度的A值為X，測定GA濃度為Y，對不同患者標本的變量X、Y分別進行回歸分析，R2均>0.970，將所有患者標本的變量X、Y進行回歸分析，R2=0.943 4，GA濃度與標本溶血A值呈密切負相關。見圖2。

注：A～D,GA初始濃度為9.6%、15.4%、29.3%、41.6%。

圖2 不同GA濃度標本溶血對GA檢測結(jié)果的影響

2.3 回歸糾正公式的建立 設溶血時GA值為Z，標本溶血A值為X，無溶血時GA值為Y。對變量Z與因變量X、Y進行回歸分析，計算得多元回歸式：Y=2.468X+Z-0.015 73。

2.4 臨床溶血標本糾正試驗 測定6份不同溶血程度的溶血血清GA與溶血A值，運用回歸公式Y(jié)=2.468X+Z-0.015 73糾正，得GA糾正值，結(jié)果見表1。與相應無溶血血清所測得的GA值比較，用美國CLIA′88能力比對檢驗的分析質(zhì)量要求，GA測定的可接受范圍為10%，以此作為糾正值可接受性的檢驗。糾正前GA值偏移最高達48.82%，糾正后GA值偏移最高為8.03%，糾正后GA值的偏移平均值為0.61%，遠小于糾正前GA值偏移平均值11.79%。見表1。

表1 溶血標本GA檢測結(jié)果糾正前后的變化

3 討論

血糖水平監(jiān)測是糖尿病防治的關鍵。GA是一種可反映血糖近期變化的優(yōu)良指標，可作為HbA1c臨床應用的有效補充，用于糖尿病輔助診斷和治療監(jiān)測[4]。溶血是臨床檢驗血標本經(jīng)常遇到的問題，對多種檢驗結(jié)果有明顯的干擾，以往未見研究報道溶血對GA檢測結(jié)果的影響[7]。本研究結(jié)果表明，不同程度溶血均降低酮胺氧化酶法GA測定結(jié)果。賈珂珂等[8]研究酮胺氧化酶法測定GA的干擾，結(jié)果顯示溶血對GA檢測結(jié)果為負影響，與本研究結(jié)果基本一致。

GA是監(jiān)控短期血糖波動的重要指標，GA檢測結(jié)果輕微變化可影響對糖尿病輔助診斷、治療效果和預后的判斷[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，溶血對GA濃度影響較大，特別是GA濃度越低，溶血導致GA檢測結(jié)果偏移越大。在實際工作中輕度溶血往往不容易發(fā)現(xiàn)，應采取有效措施糾正或降低溶血對GA檢測準確性的影響。運用本研究建立的糾正公式對GA檢測結(jié)果糾正，能有效糾正溶血對GA檢測結(jié)果的影響，將糾正前GA濃度平均偏移從11.79%降低到0.61%。美國CLIA′88能力比對檢驗的分析質(zhì)量要求，GA測定的可接受范圍為10%，本研究糾正后所有結(jié)果偏移均小于10%，完全符合臨床檢驗的要求。

溶血干擾臨床生化檢驗結(jié)果的機制可能通過以下幾方面[11]：(1)血細胞高濃度的組分逸出使血清中分析物的濃度增高；反之，細胞內(nèi)濃度極低的物質(zhì)因溶血而對血清稀釋；(2)Hb對比色分析的干擾；(3)化學物質(zhì)的干擾。本研究制備溶血標本時，對照組亦加入同體積的生理鹽水，避免了細胞內(nèi)濃度極低的物質(zhì)因溶血對血清的稀釋作用；AU5800雙波長終點法能夠避免Hb顏色對比色分析的干擾。因此，溶血產(chǎn)生的化學物質(zhì)對酮胺氧化酶法的干擾作用是溶血影響GA檢測結(jié)果的可能機制[12]。我們推測：Hb中Fe2+易在測定過程中被氧化成Fe3+，此過程可能消耗部分酮胺氧化酶產(chǎn)生的H2O2，從而造成溶血標本GA檢測結(jié)果的降低。但該機制尚需通過下一步實驗來驗證。

本研究初步明確了溶血對酮胺氧化酶法檢測GA結(jié)果的干擾作用，并建立可有效糾正溶血標本GA測定結(jié)果的糾正公式。但該研究是建立在小樣本量研究的基礎之上，需進一步擴大樣本量對糾正公式進行校正和驗證，并研究溶血干擾酶法測定GA結(jié)果的可能機制，探討從方法學上校正溶血的干擾作用。

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(本文編輯：王海燕)

Interference of hemolysis on glycated albumin determined by ketoamine oxidase method and its correction

ZHANGShi-chang,YANGLu,LIYun-fei,CHENXiao-ting,SHIJing,WANGQi,ZHANGBing-feng

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,Jiangsu,China)

Objective To investigate the effects of hemolysis on glycated albumin (GA) determined by ketoamine oxidase method and its correction. Methods GA concentration and hemolytic parameter(optical density, A) in non-hemolytic serum and different degree hemolytic serum samples were measured. The impact of hemolysis on GA and the relationship between hemolysis and GA were analysed. A formula was developed to correct the interference of hemolysis on GA measurement using regressive Multiple analysis. Results Compared with non-hemolytic serum, hemolysis resulted in the significantly decreased concentrations of GA detected by ketoamine oxidase method(P<0.01), which were significantly associated with the degree of hemolysis (R2=0.943 4).YandZrepresented GA concentration of non-hemolytic serum and different degree hemolytic serum, whileXrepresented optical density of hemolytic parameter. Formulas for GA measurement were presented:Y=2.468X+Z-0.015 73, GA concentrations of hemolytic samples can be reverted to the values without statistical difference from the GA concentration in corresponding non-hemolytic samples. The bias of corrected GA was less than 10%. Conclusion Our results indicate that the level of GA measured through ketoamine oxidase method is negatively affected by hemolysis. The formula of mathematical correction of GA results in hemolytic samples should be suitable for the requirements of clinical laboratory.

hemolysis; glycated albumin; interference; correction

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.03

國家自然科學基金面上項目(81671836)。

張世昌，1975年生，男，副主任技師，博士，主要從事糖尿病與干細胞再生醫(yī)學研究。

張炳峰，主任技師，副教授，E-mail：bingfengzh2000@163.com。

R446；R587.1

A

2016-12-20)