GSP分析儀篩查新生兒疾病的性能驗(yàn)證和應(yīng)用*

王燕敏，田國力，周卓，郭靜，許洪平，姚靜

(上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心，上海 200040)

·產(chǎn)品應(yīng)用研究·

GSP分析儀篩查新生兒疾病的性能驗(yàn)證和應(yīng)用*

王燕敏，田國力，周卓，郭靜，許洪平，姚靜

(上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心，上海 200040)

目的 用全自動(dòng)熒光免疫分析儀(Genetic Screening Processor，GSP)檢測新生兒先天性甲狀腺功能減低癥(congenital hypothyroidism，CH)和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia,CAH)篩查的指標(biāo)——促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone ，TSH)和17羥基孕酮(17-OH-progesterone ，17-OHP)，評估GSP應(yīng)用于臨床的可行性。方法 檢測美國疾病預(yù)防與控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)的濾紙干血片標(biāo)本和GSP配套試劑盒內(nèi)質(zhì)控品，計(jì)算GSP的正確度、精密度和線性；檢測臨床明確診斷的標(biāo)本，TSH 1 012例(陽性60例，陰性952例)和17-OHP 991例(陽性34例，陰性957例)，ROC曲線統(tǒng)計(jì)確定初始cut-off值，比對與臨床診斷的一致性。結(jié)果 TSH和17OHP的批內(nèi)不精密度分別為6.69%～12.6%和7.52%～9.29%，批間不精密度分別為6.91%～10.96%和6.86%～12.36%；偏移分別為-14.28%～-0.74%和-0.45%～12.54%；檢測結(jié)果線性良好；初始cut-off值為23.43 U/mL(TSH)和21.42 ng/mL(17-OHP)，敏感性為100%，特異性依次為98.11%和99.58%，與臨床診斷結(jié)果一致性好。結(jié)論 GSP作為新生兒疾病篩查領(lǐng)域的首臺全自動(dòng)熒光免疫分析儀，滿足實(shí)驗(yàn)室要求，可作為常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于CH和CAH的篩查。

GSP；新生兒疾病篩查；濾紙干血片；全自動(dòng)檢測

我國每年新生兒疾病篩查數(shù)量逐年增加，可篩查項(xiàng)目和病種不斷更新，實(shí)驗(yàn)室集中化檢測篩查亟需引進(jìn)自動(dòng)化設(shè)備以提高工作效率，確保篩查質(zhì)量。新生兒疾病篩查全自動(dòng)熒光免疫分析儀(Genetic Screening Processor，GSP)具有高通量的特性，實(shí)驗(yàn)過程可實(shí)現(xiàn)信息化和可追溯性。本研究用國內(nèi)首臺GSP檢測我國當(dāng)前仍采用傳統(tǒng)手工操作的促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)和17羥基孕酮(17-OH-progesterone，17-OHP)，并與臨床確診新生兒先天性甲狀腺功能減低癥(congenital hypothyroidism，CH)和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia，CAH)病例比對。

1 材料與方法

1.1 材料 濾紙干血片標(biāo)本，分別來源于美國疾病預(yù)防與控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)、GSP配套試劑盒質(zhì)控品和臨床明確診斷標(biāo)本。每份標(biāo)本取3 mm直徑血斑。

1.2 儀器與試劑 2021型GSP，TSH測定試劑盒及17-OHP測定試劑盒(美國PerkinElmer公司)。

1.3 方法 為固相、雙抗體免疫夾心熒光分析法。將銪示蹤劑和抗血清貯存液等放入GSP試劑模塊；用3 mm專用打孔鉗將校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測標(biāo)本打入96孔微孔板中，微孔板上印有相應(yīng)檢測項(xiàng)目的條形碼，讀取條形碼并將樣本和質(zhì)控品信息輸入 GSP 工作站軟件；將待測微孔板裝載入GSP的進(jìn)板模塊，微孔板條形碼朝外，上機(jī)自動(dòng)檢測；4 h后獲得TSH和17-OHP檢測結(jié)果。

1.4 方法學(xué)評價(jià)[1]

1.4.1 精密度 取CDC提供的高、中、低已知濃度標(biāo)本，每份各測定20次，連續(xù)測定20 d，計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)，1/3總誤差(total error，TEa)為判定標(biāo)準(zhǔn)，TEa取美國CDC的室間質(zhì)量評價(jià)(external quality assessment，EQA)最大允許誤差。

1.4.2 正確度 取CDC提供的已知濃度標(biāo)本，每份檢測2次，重復(fù)測定15 d，計(jì)算平均值與靶值的偏移，以1/2TEa為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3 線性測定 取試劑盒內(nèi)高濃度質(zhì)控品，用打孔鉗取直徑3 mm的血斑，分別取2、1、1/2、1/4、1/8個(gè)血斑制成系列濃度(理論值)標(biāo)本，分析天平校正血斑質(zhì)量，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測2次。以理論值為X，實(shí)測值均值為Y，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。

1.5 臨床應(yīng)用 檢測臨床已明確診斷的標(biāo)本，其中TSH 1 012例(陽性60例，陰性952例)和17-OHP 991例(陽性34例，陰性957例)，計(jì)算診斷敏感性和特異性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Excel 2010以及SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度結(jié)果 TSH批內(nèi)不精密度6.69%～12.6%，批間不精密度6.91%～10.96%；17-OHP批內(nèi)不精密度7.52%～9.29%，批間不精密度6.86%～12.36%。兩項(xiàng)檢測指標(biāo)的批內(nèi)和批間精密度均小于1/3TEa。見表1。

表1 TSH和17-OHP不精密度結(jié)果

2.2 正確度結(jié)果 檢測結(jié)果與CDC提供的目標(biāo)濃度比較，TSH偏移-14.28%～-0.74%；17-OHP偏移-0.45%～12.54%。兩項(xiàng)指標(biāo)的偏移均小于1/2TEa，見表2。

表2 TSH和17-OHP正確度結(jié)果

2.3 線性結(jié)果 以實(shí)測均值為Y，系列理論值為X，在TSH濃度范圍(6.5～101 U/mL)內(nèi)進(jìn)行線性回歸分析，TSH回歸方程為Y= 0.834 9X+0.510 7，r=0.999 5；在17-OHP濃度范圍(17.6～204 ng/mL)內(nèi)進(jìn)行線性回歸，17-OHP回歸方程為Y= 1.021 2X- 0.199 1，r=0.998；P均<0.01。實(shí)測均值與理論值高度相關(guān)，線性良好。

2.4 臨床應(yīng)用 檢測臨床已明確診斷標(biāo)本，分別進(jìn)行ROC曲線分析，獲得初始cut-off值，TSH為23.43 U/mL，17-OHP為21.42 ng/mL。進(jìn)一步臨床判斷，GSP檢出78例TSH陽性結(jié)果，包括60例真陽性和18例假陽性，TSH篩查CH的敏感性為100%(60/60)，特異性為98.11%(934/952)；GSP檢出38例17-OHP陽性結(jié)果，包括34例真陽性和4例假陽性，17-OHP篩查CAH的敏感性為100%(34/34)，特異性為99.58%(953/957)；與手工操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量Kappa值分別為0.86和0.94(P<0.001)。GSP分析結(jié)果與臨床診斷一致性較好。

3 討論

國內(nèi)外新生兒疾病篩查一般采用集中檢測模式。2015年，我國222家篩查實(shí)驗(yàn)室篩查全國1 500多萬新生兒，篩查率超過90%[2]。大規(guī)模標(biāo)本集中化檢測需要建立自動(dòng)化高通量檢測技術(shù)，而目前大部分篩查中心多以手工法為主，實(shí)驗(yàn)操作步驟多，時(shí)間長，易影響篩查質(zhì)量。GSP是新生兒疾病篩查領(lǐng)域的首臺真正的全自動(dòng)熒光免疫分析儀，標(biāo)本打孔至96孔微孔板后，從微孔板裝載至檢測完成的所有步驟，包括加樣、振蕩孵育、移液、檢測、數(shù)據(jù)收集等均實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化。雖然不同檢測項(xiàng)目一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期需要1～4 h，但該儀器在運(yùn)行狀態(tài)下可隨時(shí)加載微孔板，連續(xù)進(jìn)樣[3]。若以國內(nèi)新生兒篩查最多見的4項(xiàng)疾病檢測的4個(gè)指標(biāo)(TSH、17-OHP、苯丙氨酸、葡萄糖6磷酸脫氫酶)檢測為例，每個(gè)指標(biāo)檢測4塊96孔板，單人操作16塊板運(yùn)行時(shí)間僅需6.5 h，相較于現(xiàn)行手工法，減少了實(shí)驗(yàn)人員和操作步驟，節(jié)省了12 h，提高了篩查效率，特別適合新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室大通量檢測。

CH和CAH是小兒內(nèi)分泌常見疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國范圍內(nèi)CH發(fā)病率為1/2 468[4]，CAH發(fā)病率為1/10 000～1/20 000[5]。我國30個(gè)省市均不同程度地開展了新生兒CH和CAH篩查，大多采用時(shí)間分辨熒光免疫法檢測疾病指標(biāo)TSH和17-OHP[6]。該法用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系螯合標(biāo)記物銪，其熒光有很長的衰退時(shí)間和特別大的斯托斯位移(Stock′s)2個(gè)重要特性，可在本底熒光已完全衰退的延遲時(shí)間后被測定，克服了一般熒光免疫法背景太強(qiáng)的缺點(diǎn)，提高檢測敏感性。GSP也是采用該原理檢測臨床已明確診斷標(biāo)本，可檢出所有陽性標(biāo)本，敏感性為100%，特異性分別為98.11%和99.58%，表明采用GSP檢測相關(guān)指標(biāo)可避免漏診患兒，假陽性低。Kappa檢驗(yàn)提示GSP的分析結(jié)果與常規(guī)的手工法檢測結(jié)果具有良好的一致性，ROC曲線統(tǒng)計(jì)得到的cut-off值TSH 23.43 U/mL，17-OHP 21.42 ng/mL與全國篩查實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的cut-off值相似[7-8]。

由于濾紙干血片血液含量少，基質(zhì)成分復(fù)雜，影響檢測的敏感性和特異性[9]，據(jù)美國CDC 2015年統(tǒng)計(jì)[10]，近500家篩查實(shí)驗(yàn)室的TSH干血片檢測不精密度3.41%～45.55%，偏移2.80%～36.4%；17-OHP干血片檢測不精密度8.43%～39.4%，偏移3.2%～27.4%。本研究中GSP檢測TSH和17-OHP，批內(nèi)不精密度分別為6.69%～12.6%和7.52%～9.29%，批間不精密度分別為6.91%～10.96%和6.86%～12.36%，兩項(xiàng)檢測指標(biāo)的批內(nèi)和批間精密度均小于1/3TEa。TSH偏移-14.28%～-0.74%間，17-OHP偏移-0.45%～12.54%，兩項(xiàng)指標(biāo)的偏移均小于1/2TEa。但無論是精密度和偏移，兩個(gè)項(xiàng)目高值均超過10%，而低值(cut-off值附近)不精密度小于7%，偏移小于1%，提示GSP在低濃度的檢測結(jié)果更好，這符合CH和CAH篩查陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，即對高于cut-off值的小兒均需召回，重新采集血清標(biāo)本檢測以明確診斷，而不能以篩查實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果作為最終診斷依據(jù)。

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(本文編輯：王海燕)

Objective To evaluate the feasibility of PerkinElmer Genetic Screening Processor(GSP) in the application of newborn screening for congenital hypothyroidism(CH) and congenital adrenal hyperplasia(CAH) by detecting thyroid-stimulating hormone(TSH) and 17-OH-progesterone(17-OHP). Methods The dried-blood spots specimens from Centers for Disease Control and Prevention(CDC) and the quality control in the reagent kit were detected and the accuracy, precision and linearity were calculated. A total of 1 012 samples of TSH(60 of positive and 952 negative samples) and 991 samples of 17-OHP(34 positive and 957 negative samples) were detected. The initial cut-off value was determined by ROC curve determined. The consistency between the results from GSP and clinical diagnosis was analyzed. Results The average of within-run coefficient of variation(CV) of TSH and 17-OHP were 6.69% to 12.6% and 7.52% to 9.29%, and the average of between-runCVwere 6.91% to 10.96% and 6.86% to 12.36%, respectively. The average of bias of TSH and 17OHP were -14.28% to -0.74% and -0.45% to 12.54%. The linearity of GSP detection was fine. The initial cut-off values were 23.43 U/mL(TSH) and 21.42 ng/mL(17-OHP). The sensitivity of GSP detection was 100% and the specificity of TSH and 17-OHP were 98.11% and 99.58% respectively. The results of GSP detection showed good consistency with clinical diagnosis. Conclusion As the first real automatic fluorescence immunoassay analyzer, GSP could be used in routine clinical diagnosis for CH and CAH.

genetic screening processor(GSP); neonatal screening; dried-blood spot; full automated detection

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.20

上海市第四輪公共衛(wèi)生三年行動(dòng)計(jì)劃重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(15GWZK0401)；上海交通大學(xué)多學(xué)科交叉項(xiàng)目(YG2015QN27)。

王燕敏， 1982年生，女，技師，大學(xué)本科，主要從事新生兒遺傳代謝病篩查工作。

田國力，主任技師，主要從事新生兒遺傳代謝病研究和咨詢工作，E-mail：shscreening@126.com。

R446;R722.11

A

2016-11-04)

Verification and application of genetic screening processor(GSP) for neonatal screening

WANGYan-min,TIANGuo-li,ZHOUZhuo,GUOJing,XUHong-ping,YAOJing(NewbornScreeningCenterofShanghaiChildren′sHospital,Shanghai200040,China)