醫(yī)院就診人群HBsAg與抗HBs雙陽性HBV感染者的流行病學(xué)與分子病毒學(xué)特征*

傅曉春，陳靜，葉愛珠，陳惠娟，荀振，曾勇彬，劉燦，林錦驃，歐啟水

(1.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350004； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福州 350005)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

醫(yī)院就診人群HBsAg與抗HBs雙陽性HBV感染者的流行病學(xué)與分子病毒學(xué)特征*

傅曉春1,2，陳靜2，葉愛珠1,2，陳惠娟2，荀振1,2，曾勇彬2，劉燦2，林錦驃2，歐啟水2

(1.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350004； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福州 350005)

目的 探討乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和抗HBsAg抗體(抗HBs)同時(shí)陽性的HBV感染者的流行病學(xué)及分子病毒學(xué)特征。方法 分析52 070例醫(yī)院就診人群HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測結(jié)果，以HBsAg和抗HBs雙陽性患者為實(shí)驗(yàn)組，HBsAg陽性、抗HBs陰性患者為對照組，比較2組患者的流行病學(xué)特征。半巢氏PCR擴(kuò)增2組患者HBV S蛋白編碼區(qū)并測序，比較2組間在不同基因區(qū)、基因型及臨床診斷時(shí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果 醫(yī)院檢測人群HBsAg陽性率為20.40%(10 621/52 070)，其中HBsAg、抗HBs雙陽性率為2.48%(263/10 621)。HBsAg、抗HBs雙陽性在0～9歲和≥80歲人群流行率較高，而HBsAg陽性、抗HBs陰性則相反。實(shí)驗(yàn)組S蛋白氨基酸突變率顯著高于對照組(1.52% vs 0.81%，P<0.01)，差異主要存在于主要親水區(qū)(MHR)(1.68% vs 0.57%，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組中除肝癌(HCC)患者外(1.97% vs 2.21%，P>0.05)，乙肝攜帶者、慢性乙型肝炎(CHB)患者和肝硬化(LC)患者的S蛋白突變率均顯著高于對照組同疾病患者(分別為1.47% vs 0.65%，1.28% vs 0.84%，2.21% vs 0.44%，P均<0.05)。結(jié)論 HBsAg、抗HBs雙陽性以0～9歲和≥80歲HBsAg陽性人群更多見。HBV感染者血清HBsAg和抗HBs共存可能與S蛋白(主要為MHR)的突變造成的免疫逃逸有關(guān)。HBsAg、抗HBs雙陽性和HBsAg陽性、抗HBs陰性患者之間S蛋白的突變率差異與患者肝臟疾病所處的階段有關(guān)。

乙型肝炎病毒表面抗原；抗乙型肝炎病毒表面抗原抗體；突變；S蛋白

HBV血清學(xué)標(biāo)志物是乙型肝炎(乙肝)防治中最常用的檢測指標(biāo)[1]，對乙肝的治療有重要的預(yù)測價(jià)值。通常認(rèn)為抗HBsAg抗體(抗HBs)是一種保護(hù)性抗體，可特異性中和HBsAg，因此二者無法共存。然而，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)在HBV感染者中HBsAg和抗HBs共存現(xiàn)象確實(shí)存在[2-6]，有關(guān)其發(fā)生機(jī)制尚無定論[2,4,7-8]。有研究認(rèn)為HBsAg和抗HBs共存可能促進(jìn)肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生和發(fā)展[9]。因此，調(diào)查并分析HBsAg和抗HBs同時(shí)陽性患者的流行病學(xué)和分子病毒學(xué)特征對于乙肝的防治具有重要意義。基于醫(yī)院就診人群，尤其是大型綜合性醫(yī)院就診人群開展流行病學(xué)調(diào)查可以較好地反映HBV感染的基本特征[10]。本研究收集醫(yī)院就診人群HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測結(jié)果，分析HBV感染者HBsAg和抗HBs同時(shí)陽性的流行病學(xué)特征并探討該狀態(tài)與肝臟疾病的關(guān)系，為乙肝防治決策提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2015年5月至2016年6月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院及門診定量檢測HBV血清學(xué)標(biāo)志物的52 070例患者數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。收集其中263例HBsAg、抗HBs雙陽性(實(shí)驗(yàn)組)和同期的204例HBsAg陽性、抗HBs陰性(對照組)的患者血清，置于-80 ℃保存。將實(shí)驗(yàn)組與對照組患者按臨床診斷分為HBV攜帶者、慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)和HCC患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》[11]。納入標(biāo)本收集的病例均排除患有其他病毒性肝炎或免疫功能不全性疾病。

1.2 主要試劑與儀器 Architect i2000微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測試劑(美國雅培公司)；ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀及配套丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測試劑(德國西門子公司)；Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀(羅氏公司)；HBV DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(湖南圣湘生物公司)；HBV DNA磁珠吸附法提取試劑盒(北京鑫諾美迪基因公司)；2×Taq PCR Mastermix(北京天根公司)；ABI梯度PCR儀(美國Life Technologies公司)；半巢式PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 HBV血清學(xué)標(biāo)志物、ALT及HBV DNA檢測 HBV血清學(xué)標(biāo)志物采用Architect i2000微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑進(jìn)行檢測(HBsAg>0.05 IU/mL，抗HBs>10 mIU/mL為陽性)；ALT使用ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑進(jìn)行檢測(ALT≥40 IU/L為異常)；用LightCycler 480熒光定量PCR儀和HBV DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測HBV DNA(>500 IU/mL為陽性)。所有檢測均按照試劑盒說明書及儀器操作流程進(jìn)行。

1.4 HBV S基因擴(kuò)增與測序 使用半巢氏PCR(semi-nested PCR)擴(kuò)增HBsAg S蛋白編碼區(qū)(nt 162～842)。參照HBV參考序列(序列號(hào)：AY206380)使用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)引物。第一輪擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL、上游引物DF-1(5′-TTCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3′，nt 56～75)和下游引物DR-S(5′-CAATTACATATCCCATGAAGTTAAGG-3′，nt 894～869)(10 μmol/L)各1 μL、ddH2O 7.5 μL、血清HBV DNA提取的模板3 μL。使用ABI梯度PCR儀擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。第二輪擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系25 μL：上游引物DF-2(5′-CTCTGCCATATCGTCAATCTT-3′，nt 108～128)和下游引物DR-S(10 μmol/L)各1 μL，反應(yīng)模板為第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物1 μL，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30，其余反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同第一輪擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂凝膠電泳鑒定后送上海華大基因進(jìn)行Sanger測序(標(biāo)本HBV DNA濃度≥104IU/mL時(shí)滿足測序要求)。測序結(jié)果以DNAman 5.0軟件進(jìn)行拼接，使用NCBI基因分型工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)對HBV進(jìn)行基因分型。將核酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的參考株序列進(jìn)行比對分析[4-5]。核酸序列翻譯為氨基酸(aa)序列后，為便于統(tǒng)計(jì)分析，將HBsAg分為N端區(qū)(aa1～99)、主要親水區(qū)(MHR，aa100～169，包含a決定簇aa124～147)和C端區(qū)(aa170～226)，對比2組患者的流行病學(xué)及分子病毒學(xué)特征差異。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)與血清學(xué)特征 52 070例就診人群中HBsAg陽性者10 621例(20.40%)，其中HBsAg、抗HBs雙陽性者263例(2.48%)。不同年齡段患者HBsAg陽性、抗HBs陰性和HBsAg、抗HBs雙陽性的流行率分布趨勢存在明顯差異：醫(yī)院就診人群的HBsAg陽性、抗HBs陰性流行率呈現(xiàn)兩端低，中間高，0～9歲時(shí)最低(1.00%)，隨著年齡增大，比例急劇增高，30～39歲時(shí)最高(33.62%)，之后穩(wěn)步降低，在≥80歲人群降至7.92%；而HBV感染者中HBsAg、抗HBs雙陽性的流行率則呈現(xiàn)兩端高，中間低，0～9歲時(shí)最高(10.81%)，10～19歲人群迅速降低至2.08%，之后緩慢降低，在30～39歲時(shí)最低(1.21%)，然后隨著年齡增長反而開始逐漸增高，在≥80歲人群升高到6.71%。見圖1。

2.2 臨床特征 實(shí)驗(yàn)組與對照組患者的性別、HBV DNA>104IU/mL的比例、ALT異常比例、HBeAg陽性率、HBV疫苗接種史、家族性HBV感染史和抗病毒治療史差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。實(shí)驗(yàn)組平均年齡和C型HBV感染者的比例均高于對照組(P<0.05)，而HBsAg濃度≥250 IU/mL的患者比例顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。在臨床診斷構(gòu)成比中，實(shí)驗(yàn)組HBV攜帶者比例高于對照組(73.00% vs 62.25%，P<0.05)，而其他診斷類型的構(gòu)成比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖1 2015年5月至2016年6月HBsAg陽性、抗HBs陰性和HBsAg、抗HBs雙陽性的年齡段分布

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組HBV感染者臨床特征對比

注：P為陽性，N為陰性； Y為有，N為無；*，僅對HBV DNA≥4(log10IU/mL)的樣本進(jìn)行測序與分型，包括實(shí)驗(yàn)組69例，對照組53例。

2.3 S蛋白氨基酸突變分析 實(shí)驗(yàn)組的氨基酸突變率顯著高于對照組(1.52% vs 0.81%，P<0.05)，差異主要存在于MHR(1.68% vs 0.57%，P<0.05)，特別是a決定簇(3.26% vs 0.86%，P<0.05)，而在a決定簇前、后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對不同基因型HBV感染的2組患者進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)后，發(fā)現(xiàn)B型與C型HBV全長S蛋白氨基酸突變率差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但B型的差異僅存在于a決定簇的第二個(gè)莖環(huán)，而C型除a決定簇前、后和第二個(gè)莖環(huán)之外，其他部分差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。按臨床診斷結(jié)果分類統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組與對照組的HBV S蛋白氨基酸突變率，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對照組之間除HCC患者外，HBV攜帶者、CHB患者和LC患者差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為1.47% vs 0.65%、1.28% vs 0.84%和2.21% vs 0.44%，均P<0.05)，見表3。HBV攜帶者的氨基酸突變率差異主要存在于N端區(qū)和MHR，CHB患者則存在于MHR，而LC患者僅在全長S蛋白上存在氨基酸突變率差異，見表3。

在所獲得的HBV序列中，實(shí)驗(yàn)組與對照組間的氨基酸突變位點(diǎn)存在較大差異，2組共有的常見突變位點(diǎn)為s5、s44、s47、s69、s126、s207等；而實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有的常見位點(diǎn)有s129、s131、s145、s168、s190、s220等；除此之外，實(shí)驗(yàn)組還有多個(gè)獨(dú)有的突變位點(diǎn)，主要位于MHR，尤其是a決定簇中。2組患者中B型HBV最常見突變位點(diǎn)為G145R，而C型為I126 N/T/S，并且C型的獨(dú)有突變位點(diǎn)明顯多于B型，見表4。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組HBV S蛋白氨基酸突變率*(%)

注：*，氨基酸突變率=突變氨基酸數(shù)÷總氨基酸數(shù)×100%。

表3 不同臨床診斷中實(shí)驗(yàn)組與對照組HBV S蛋白氨基酸突變率(%)*

注：*，氨基酸突變率=突變氨基酸數(shù)÷總氨基酸數(shù)×100%。

表4 實(shí)驗(yàn)組和對照組HBV S蛋白氨基酸突變位點(diǎn)分析

注：粗體部分為處于S蛋白MHR的氨基酸突變位點(diǎn)；*，為終止突變。

3 討論

HBV感染者血清HBsAg、抗HBs雙陽性是臨床HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測的一個(gè)少見模式，其形成機(jī)制尚不清楚[12]。本研究結(jié)果表明醫(yī)院就診人群中HBsAg陽性患者比例較高(20.40%)，略低于本實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)的2009年1月至2013年1月的檢測結(jié)果(24.8%)[1]，但明顯高于Pu等[13]調(diào)查的兩個(gè)社區(qū)人群(7.31%/5.99%)，HBsAg、抗HBs雙陽性流行率比例略低于社區(qū)人群(2.92%/2.93%)。醫(yī)院就診人群相對于社區(qū)人群一般病情較重且免疫功能較差，這可能是造成結(jié)果差異的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院就診人群中HBsAg陽性、抗HBs陰性流行率隨年齡增長呈兩端低中間高，可能原因?yàn)椋旱湍挲g人群得益于我國自1992年開始逐步推廣的新生兒常規(guī)HBV疫苗接種，極大地降低了新生兒被感染的機(jī)率[14]，而1992年前出生的人群未能受益，導(dǎo)致20～29歲人群流行率驟然增高；此外，隨著年齡增長，社交活動(dòng)增多也使得受感染的機(jī)率增高，逐漸在30～39歲人群達(dá)到峰值，之后隨著被感染者的逐漸死亡，HBsAg陽性率穩(wěn)步降低。而HBsAg、抗HBs雙陽性流行率隨年齡增長呈兩端高中間低的可能原因?yàn)椋旱湍挲g時(shí)機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未成熟，產(chǎn)生特異性較低的抗體無法完全中和HBsAg，導(dǎo)致HBsAg和抗HBs的共存，隨著年齡的增長，免疫功能逐漸完善，抗HBs陽性率逐漸降低；然而，隨著年齡的增大，患者重疊感染不同基因型HBV的機(jī)率和宿主免疫壓力下HBV S蛋白突變率也增高，因此在多種因素共同作用下，抗HBs陽性率逐漸增高。值得思考的是，近年普遍的HBV疫苗接種降低了HBV流行率的同時(shí)[14]，血清抗HBs對HBV的選擇壓力是否也導(dǎo)致較多免疫逃逸株的出現(xiàn)，使得0～9歲的低年齡患者受到感染卻未能被血清抗HBs清除？這是否也是0～9歲人群HBsAg、抗HBs雙陽性流行率最高的原因之一，需要進(jìn)一步研究。

臨床特征分析顯示，實(shí)驗(yàn)組平均年齡高于對照組，并且HBsAg濃度≥250 IU/mL的患者比例明顯低于對照組，與之前的研究結(jié)果相似[13]。實(shí)驗(yàn)組中HBV攜帶者比例高于對照組，而在CHB、LC和HCC患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同于Shiels等[15]的研究結(jié)果。Liu等[6]認(rèn)為患者的抗HBs可能部分中和了HBsAg。因此，HBsAg、抗HBs雙陽性患者血清抗HBs的存在可能仍具有一定的保護(hù)作用。有趣的是，實(shí)驗(yàn)組感染C型HBV的比例顯著高于對照組(65.12% vs 23.81%，P<0.05)，這與我國南方人群以B型感染為主的結(jié)果相反[16]，可能與實(shí)驗(yàn)組C型HBV S蛋白氨基酸突變率較B型高，且獨(dú)有突變位點(diǎn)較多，更容易發(fā)生免疫逃逸有關(guān)。

對實(shí)驗(yàn)組與對照組HBV S基因的測序分析顯示，實(shí)驗(yàn)組具有更高的S蛋白氨基酸突變率，尤其是作為抗HBs結(jié)合位點(diǎn)的a決定簇，這些突變可能改變了HBsAg的空間構(gòu)象和免疫原性，與之前的研究結(jié)果相似[3,4,6,8]。文獻(xiàn)中常見的突變位點(diǎn)如s120、s126、s130、s133、s145等在本次研究中均有發(fā)現(xiàn)[12]，其中以s126和s145突變率最高。此外，本文還發(fā)現(xiàn)不同基因型實(shí)驗(yàn)組和對照組HBV氨基酸突變率存在差異，B型的氨基酸突變率差異僅存在于a決定簇的第二個(gè)莖環(huán)，而C型除a決定簇前、后和第二個(gè)莖環(huán)之外，其他部分差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與實(shí)驗(yàn)組C型感染比例較高有關(guān)。我們在C型HBV中發(fā)現(xiàn)了C69和W182 2種終止突變，均為突變型與少量野生型共存，該類型突變可能對HBsAg的定量產(chǎn)生影響[17-18]。根據(jù)臨床診斷結(jié)果進(jìn)行S蛋白突變率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組和對照組患者之間S蛋白的突變率差異與患者疾病的狀態(tài)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組除HCC患者外，HBV攜帶者、CHB患者和LC患者的突變率均顯著高于對照組，可能因?yàn)楹笕呦鄬τ谇罢呔哂休^好的免疫功能狀態(tài)，在抗HBs的免疫壓力下，產(chǎn)生更多免疫逃逸突變[12]。

本研究結(jié)果表明，醫(yī)院就診人群HBsAg、抗HBs雙陽性的流行率在不同年齡段存在差異，以0～9歲和≥80歲人群更多見。HBV感染者血清HBsAg和抗HBs共存可能與S蛋白(主要為MHR)的突變造成的免疫逃逸有關(guān)。此外，HBsAg、抗HBs雙陽性和HBsAg陽性、抗HBs陰性患者之間S蛋白的突變率差異與患者肝臟疾病所處的階段有關(guān)。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Epidemiological and molecular virological characteristics of HBV infected patients of hospital with simultaneously positive HBsAg and anti-HBs

FUXiao-chun1,2,CHENJing2,YEAi-zhu1,2,CHENHui-juan2,XUZhen1,2,ZENGYong-bin2,LIUCan2,LINJin-piao2,OUQi-shui2

(1.FirstClinicalCollege,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,Fujian,China)

Objective To investigate the epidemiological and molecular virological characteristics in HBV-infected patients with co-positive HBsAg and anti-HBs. Methods HBV serological markers were analyzed in 52 070 specimens. The epidemiological characteristics of HBsAg and anti-HBs simultaneously positive patients (the experimental group) and HBsAg positive and anti-HBs negative patients (the control group) were compared. The S protein of HBV coding region was amplified by semi-nested PCR and sequenced. The statistical differences between the two groups were compared in different gene regions, genotypes and different clinical diagnosis. Results HBsAg was positive in 20.40% (10 621/52 070) of all specimens. In the patients with positive HBsAg, 2.48% (263/10 621) was positive anti-HBs. The prevalence of co-positive HBsAg and anti-HBs was higher in aged 0 to 9 years and greater than or equal to 80 years than that in other age, and the prevalence of positive HBsAg and negative anti-HBs was completely opposite. The mutation rate of S protein in the experimental group was significantly higher than that in the control group (1.52% vs 0.81%,P<0.01) with the mutation in the major hydrophilic region (MHR) (1.68% vs 0.57%,P<0.01). The mutation rates of S protein of HBV carriers, chronic hepatitis B (CHB) patients and patients with liver cirrhosis (LC) in the experimental group were significantly higher than those in the control group (1.47% vs 0.65%, 1.28% vs 0.84%, 2.21% vs 0.44%,P<0.05, respectively), except for the patients with hepatocellular carcinoma (HCC) (1.97% vs 2.21%,P>0.05). Conclusion Co-positive HBsAg and anti-HBs in HBV-infected patients was more common in HBsAg positive patients aged 0 to 9 years and greater than or equal to 80 years than the others. Coexistence of HBsAg and anti-HBs in HBV-infected patients may relate to immune escape caused by mutation of S protein (mainly MHR). The mutation rates of S protein in the two groups of patients, co-positive HBsAg and anti-HBs and the positive HBsAg combined with negative anti-HBs, were associated with the stage of liver disease.

hepatitis B virus surface antigen; anti hepatitis B virus surface antigen antibody; mutation; S protein

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.13

國家自然科學(xué)基金(81572067，81601834)。

傅曉春，1990年生，男，碩士研究生，主要從事基因診斷方面的研究。

歐啟水，主任技師，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：ouqishui@163.com。

R446.6

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2016-10-28)