兩種流式單平臺計數(shù)法測定移植術(shù)后患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的應(yīng)用評價

翁澤兵，王玉飛，郝欽芳，馬雪平，王莉

(武警總醫(yī)院檢驗科，北京 100039)

兩種流式單平臺計數(shù)法測定移植術(shù)后患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的應(yīng)用評價

翁澤兵，王玉飛，郝欽芳，馬雪平，王莉

(武警總醫(yī)院檢驗科，北京 100039)

目的 評價基于流量傳感器的單平臺計數(shù)法(簡稱體積法)與基于Trucount管的單平臺計數(shù)法(簡稱Trucount法)對移植術(shù)后患者外周血T淋巴細(xì)胞計數(shù)的應(yīng)用價值。方法 分別用Trucount法和體積法檢測107例肝/腎移植術(shù)后患者外周血CD4+、CD8+、CD3+淋巴細(xì)胞絕對數(shù)和百分比，并對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗和線性回歸分析。選取5例CD3+低值樣本，考察體積法檢測CD4+、CD8+、CD3+淋巴細(xì)胞絕對數(shù)的精密度。結(jié)果 Trucount法和體積法對移植術(shù)后患者外周血CD4+、CD4+/CD3+、CD8+、CD8+/CD3+、CD4+/CD8+檢測結(jié)果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；線性回歸系數(shù)均在0.9～1.1之間。CD3+T細(xì)胞≥40個/μL時，體積法檢測結(jié)果的變異系數(shù)均<5.5%；當(dāng)CD3+T細(xì)胞為20個/μL時，CD3+、CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的變異系數(shù)分別是5.19%、10.28%和6.48%。結(jié)論 基于流量傳感器的單平臺計數(shù)法對外周血T淋巴細(xì)胞計數(shù)具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可用于對肝/腎移植患者移植術(shù)后機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測。

T淋巴細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)；移植；免疫排斥

通過檢測移植術(shù)后患者T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量，可以客觀、準(zhǔn)確地反映患者的免疫水平，對預(yù)測和防止移植排斥反應(yīng)的發(fā)生以及免疫抑制劑的合理使用都有很好的指導(dǎo)意義[1-3]。外周血T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)主要采用流式細(xì)胞檢測方法。目前臨床上常用的檢測方法有2種。一種為采用血液分析儀和流式細(xì)胞儀雙平臺進(jìn)行計數(shù)，這種方法在樣本T淋巴細(xì)胞數(shù)量低的時候變異系數(shù)較大，因此不能滿足移植患者術(shù)后監(jiān)測的需要。另一種為單平臺計數(shù)法，分為基于Trucount管的單平臺計數(shù)法(簡稱Trucount法)和基于流量傳感器的單平臺計數(shù)法(簡稱體積法)，前者用已知數(shù)量的熒光微粒做內(nèi)參，計算樣本T淋巴細(xì)胞亞群的百分比和絕對數(shù)，但是成本昂貴；后者通過對生物細(xì)胞或顆粒的多種特性進(jìn)行分類、計數(shù)，同時根據(jù)樣本體積計算得到淋巴細(xì)胞亞群的絕對數(shù)[4]。本研究對兩種流式單平臺計數(shù)法檢測移植患者術(shù)后T淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)果進(jìn)行比較分析，并評價基于體積法對外周血T淋巴細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2016年4月至5月在武警總醫(yī)院進(jìn)行肝或腎移植術(shù)后常規(guī)隨訪的患者107例，其中男性92例，女性15例，年齡(47±13)歲。空腹采集EDTA-K2抗凝靜脈血3 mL。

1.2 儀器和試劑 BriCyte E6流式細(xì)胞儀(深圳邁瑞公司)、FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP抗體、Flow-Count標(biāo)準(zhǔn)熒光微粒、FACS溶血素(X10)和含有已知數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)熒光微粒的絕對計數(shù)管(Trucount 管)均為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 流式細(xì)胞分析

1.3.1 質(zhì)控和校準(zhǔn) Trucount法采用BD公司配套質(zhì)控品，嚴(yán)格按照FACSComp軟件進(jìn)行儀器質(zhì)控；體積法采用邁瑞公司提供的專用多色質(zhì)控微球，通過MRFlow軟件自動完成對儀器的質(zhì)量控制。

1.3.2 標(biāo)本處理 分別標(biāo)記好BriCyte E6流式細(xì)胞儀配套流式檢測管(或Trucount管)，各檢測管內(nèi)分別加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP抗體20 μL和靜脈血50 μL，輕微震蕩混勻，室溫避光放置15 min；各檢測管加入10倍稀釋后的溶血素450 μL，輕微震蕩混勻，室溫避光放置15 min，待紅細(xì)胞充分裂解后，渦旋混勻，分別上機(jī)檢測。

1.3.3 計數(shù)方法 Trucount法：應(yīng)用MultiSET軟件自動分析，必要時輔以手動設(shè)門，分別獲得CD4+、CD8+、CD3+淋巴細(xì)胞的絕對數(shù)和百分比。公式如下：T細(xì)胞絕對計數(shù)(個/μL)=(T細(xì)胞獲取數(shù)/微粒獲取數(shù))×(Trucount管的微粒總量/50 μL全血)。體積法：應(yīng)用MRFlow軟件自動分析，必要時輔以手動設(shè)門，分別獲得CD4+、CD8+、CD3+淋巴細(xì)胞的絕對數(shù)和百分比。公式如下：T細(xì)胞絕對計數(shù)(個/μL)=[T細(xì)胞獲取數(shù)/樣本獲取體積(μL)]×(520 μL樣本制備總量/50 μL全血)。

2 結(jié)果

2.1 兩種流式方法檢驗外周血T淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)和比值的比較 對Trucount法和體積法檢測107例移植術(shù)后患者的CD4+、CD4+/CD3+、CD8+、CD8+/CD3+、CD4+/CD8+結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗，結(jié)果顯示各項結(jié)果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 Trucount法和體積法檢測107例患者淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)及比值結(jié)果

2.2 兩種流式方法的線性回歸分析 Trucount法和體積法檢測107例外周血CD4+、CD4+/CD3+、CD8+、CD8+/CD3+、CD4+/CD8+、CD3+所得結(jié)果的線性回歸分析見表1。結(jié)果顯示兩種流式方法的決定系數(shù)R2分別為0.963、0.952、0.973、0.936、0.956、0.971，斜率均在0.9～1.1之間。

表2 體積法檢測Trucount 法CD3+低值樣本T淋巴細(xì)胞亞群絕對計數(shù)的變異系數(shù)(%)

3 討論

T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)是器官移植術(shù)后最主要的免疫排斥反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞亞群檢測是評估肝/腎移植患者機(jī)體免疫狀態(tài)的常用方法[5]。臨床醫(yī)生通過監(jiān)測移植患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量及百分比來尋找免疫抑制的平衡點，避免免疫抑制過度或者免疫抑制不足，從而維持移植患者最合適的免疫狀態(tài)[6]。流式細(xì)胞計數(shù)具有快速、定量以及同時檢測CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞等特點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于臨床的外周血T淋巴細(xì)胞計數(shù)。

本研究分別用Trucount法和體積法對107例肝/腎移植術(shù)后常規(guī)隨訪患者的外周血T淋巴細(xì)胞亞群絕對計數(shù)及百分比進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示兩種流式計數(shù)方法的檢測結(jié)果均有很好的相關(guān)性，決定系數(shù)R2除CD8+/CD3+(R2=0.936)均大于0.95，與王維維等[7]對邁瑞B(yǎng)riCyte E6流式細(xì)胞儀和Beckman Coulter FC500流式細(xì)胞儀之間比較時CD8+T淋巴細(xì)胞百分比發(fā)生明顯偏倚的結(jié)果相符。鑒于在多種流式細(xì)胞儀間發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞百分比偏倚稍大，由此我們推測導(dǎo)致這種情況的原因可能是由抗體種類、抗體制備等檢測前的某種或某些因素引起。

對于肝/腎移植術(shù)后長期大量服用免疫抑制劑的部分患者，其T淋巴細(xì)胞的絕對計數(shù)較低，準(zhǔn)確檢測T淋巴細(xì)胞數(shù)量對于觀察其免疫狀態(tài)非常重要。同時，對于一種新型流式細(xì)胞檢測方法來說，能夠使檢測下限更低且準(zhǔn)確性好、精密度高，更能體現(xiàn)該檢測方法的優(yōu)越性?；谝陨蟽牲c，本研究用體積法對5例Trucount法CD3+T淋巴細(xì)胞低值標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，結(jié)果顯示Trucount法CD3+T淋巴細(xì)胞為20個/μL時，CD3+、CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的變異系數(shù)(分別為5.19%、10.28%和6.48%)均較CD3+T淋巴細(xì)胞≥40個/μL時的變異系數(shù)升高明顯。這是由于隨著細(xì)胞濃度的降低，而總體進(jìn)樣量沒有增加，總收集數(shù)量減少所致。如果希望CD3+T淋巴細(xì)胞在20個/μL檢測水平有更好穩(wěn)定性，可通過增加進(jìn)樣量進(jìn)行改善。

總之，我們的研究結(jié)果表明，基于流量傳感器的單平臺計數(shù)法對外周血T淋巴細(xì)胞計數(shù)具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可用于監(jiān)測肝/腎移植患者移植術(shù)后機(jī)體的免疫狀態(tài)。

[1]顧鳳娟, 劉新華, 熱衣汗·西里普, 等.腎移植患者急性排斥反應(yīng)中T淋巴細(xì)胞亞群的作用研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志,2015,9(21):3880-3882.

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[3]高鈺,肖漓,何秀云,等. 腎移植術(shù)后淋巴細(xì)胞亞群的變化與移植腎功能恢復(fù)狀況分析[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2015,27(7):6-9.

[4]Sack U, Tárnok A, Rothe G,etal. Cellular diagnostics: basic principles, methods and clinical applications of flow cytometry[M]. Basel: Karger, 2009.

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[7]王維維, 奚迪, 袁向亮,等. 不同流式細(xì)胞分析儀檢測淋巴細(xì)胞亞群的比較研究[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2016, 39(5): 361-365.

(本文編輯：劉群)

Application evaluation of the determination of T-lymphocyte subsets in peripheral blood of patients after transplantation by two kinds of single-platform flow cytometric methods

WENGZe-bing,WANGYu-fei,HAOQin-fang,MAXue-ping,WANGLi

(DepartmentofLaboratoryMedicine,GeneralHospitalofChinesePeople'sArmedPoliceForces,Beijing100039,China)

Objective To evaluate the application values of two kinds of single-platform flow cytometric methods, the Volumetric method based on flow sensor and the Trucount method based on Trucount beads, in the counts of T-lymphocyte subsets in peripheral blood of patients after transplantation. Methods The absolute number and percentage of CD4+, CD8+, and CD3+T cells in peripheral blood samples from 107 patients after liver or renal transplantation were determined by the Trucount method and the Volumetric method, respectively, and their results were compared using paired t-test and linear regression analysis. Five samples with low CD3+counts were selected and the precisions of the absolute number of CD4+, CD8+and CD3+T cells detected by the Volumetric method were evaluated. Results There was no significant difference in the levels of CD4+, CD4+/CD3+, CD8+, CD8+/CD3+, and CD4+/CD8+in peripheral blood between the Trucount method and the Volumetric method (P>0.05), and the linear regression coefficients between them were from 0.9 to 1.1. When the concentration of CD3+was equal or more than 40/μL, the coefficients of variation (CVs) were below 5.5% for the Volumetric method. When the concentration of CD3+was 20/μL, theCVs of CD3+, CD4+, and CD8+were 5.19%, 10.28% and 6.48%, respectively. Conclusion The single-platform method based on flow sensor is accurate and reproducible for counting T-lymphocyte subsets in peripheral blood, which may be used to monitor the immune state of the patients after liver or renal transplantation.

T-lymphocyte; flow cytometry; transplantation; immunologic rejection

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.10

翁澤兵，1982年生，男，主管技師，大學(xué)本科，主要從事免疫及分子生物學(xué)研究。

王莉，副主任技師，大學(xué)本科，E-mail：wanglilsl@163.com。

R446.6

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2016-11-23)