大白菜抗/感干燒心材料CNGCs編碼基因的差異解析

劉栓桃+張志剛+李巧云+王曉+王立華+趙智中+王淑芬+徐文玲+劉賢嫻+劉辰

摘要：在植物中，環(huán)腺苷酸門通道（CNGCs）蛋白由一個(gè)大的基因家族編碼，其參與K+、Na+ 和Ca2+等陽離子的非選擇性吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，其中鈣離子（Ca2+）是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素和信號調(diào)節(jié)因子。在大白菜中，Ca2+缺乏易造成干燒心的發(fā)生，不同大白菜品種對干燒心的易感程度存在顯著差異。本研究以極端抗/感干燒心大白菜自交系He102與06-247為試材，采用全基因組重測序的方法篩選到了6個(gè)編碼CNGCs的結(jié)構(gòu)變異基因，分別是Bra003081、Bra022702、Bra032132、Bra024067、Bra021265、Bra031529，其分別與擬南芥CNGCs成員1、4、6、9、19、20同源。對6個(gè)大白菜CNGCs的潛在跨膜區(qū)進(jìn)行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這些CNGCs包含5～8個(gè)跨膜區(qū)域，C-端均位于胞質(zhì)一側(cè)。對編碼蛋白氨基酸序列進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，來自06-247的Bra003081和 Bra031529的C-端分別缺失389個(gè)氨基酸殘基和多出43個(gè)氨基酸殘基；Bra032132和Bra024067的變異也發(fā)生在06-247中，它們的C-端發(fā)生了2～3個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失；Bra021265和Bra022702的變異發(fā)生在He102中，前者是可變剪切，后者在N-端第31和第49氨基酸殘基處分別缺失和插入一個(gè)氨基酸殘基。易感干燒心材料06-247中四個(gè)突變CNGCs的突變位點(diǎn)都在編碼蛋白的C-端，這有可能影響CNGCs的功能。該試驗(yàn)結(jié)果為下一步研究CNGCs基因功能、開發(fā)特異性標(biāo)記、鑒定大白菜干燒心與CNGCs突變的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜；干燒心；環(huán)腺苷酸門通道；基因突變

中圖分類號：S634.101文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）03-0010-06

AbstractIn plants， cyclic-nucleotide gated channels （CNGCs） are non-selective cation channels encoded by a large gene family. They can uptake and transport most cations such as Na+， K+ and Ca2+， among which， Ca2+ plays pivotal roles in the physiology and biochemistry of all plants. Calcium deficiency often causes tip-burn in Chinese cabbage. Different genotypes of Chinese cabbage have obvious differences in the sensitivity to tip-burn. In this study， re-sequencing was conducted in two genotypes of Chinese cabbage inbred lines， He102 and 06-247， which showed significant differences in tip-burn reaction. Six genes coding for CNGCs were screened out and showed coding-region differences between two lines. They were Bra003081， Bra022702， Bra032132， Bra024067， Bra021265 and Bra031529， which showed homologous to Arabidopsis CNGC1， 4， 6， 9， 19， 20 respectively. The potential transmembrane domains were predicted. These CNGCs contained 5～8 transmembrane domains and their C-terminals were all located in the inside of cell membrane. Amino acid sequence alignment showed that， Bra003081 and Bra031529， which mutated in 06-247， showed C-terminal large fragment deletion and small fragment elongation respectively； Bra032132 and Bra024067， also mutated in 06-247， showed only 2 to 3 amino acid insertion or deletion in C-terminal region； the mutation of Bra021265 and Bra022702 appeared in He102， in which， Bra021265 was alternative-splicing mutation while Bra022702 was single amino acid insertion/deletion mutation in N-terminal region. All the mutations of CNGCs in 06-247 appeared in the C-terminal region， which might influence their functions. The results provided clues for studying gene function of CNGCs， developing site-specific markers and exploring their relations to tip-burn in Chinese cabbage.

KeywordsChinese cabbage； Tip-burn； Cyclic-nucleotide gated channels （CNGCs）； Gene mutation

鈣是植物必需的營養(yǎng)元素，其在細(xì)胞內(nèi)以二價(jià)陽離子即Ca2+的形式存在，不僅對維持植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要，也是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫的第二信使成分。Ca2+主要由植物的根系從土壤吸收，即主要經(jīng)根尖及成熟區(qū)根毛的表皮穿越根的外皮層細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮層，最后進(jìn)入中柱，經(jīng)質(zhì)外體或共質(zhì)體途徑運(yùn)輸至地上部分?？梢娭参飳a2+的吸收是個(gè)復(fù)雜過程，導(dǎo)致植物缺鈣的原因不僅有環(huán)境因素如土壤酸化、環(huán)境溫度等，更有植物自身的原因。唐文浩等[1]研究發(fā)現(xiàn)，不同辣椒品種對營養(yǎng)液中Ca2+濃度變化敏感程度有顯著差異，不敏感型品種在一定供Ca2+條件下，外界環(huán)境Ca2+營養(yǎng)水平的高低對辣椒果實(shí)Ca2+累積量無顯著影響，說明不敏感型品種對Ca2+營養(yǎng)環(huán)境變化耐性較高，自身調(diào)控能力強(qiáng)，推測與品種自身的Ca2+吸收特性有關(guān)。本課題組在多年大白菜品種比較試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，同地塊不同大白菜品種，其干燒心程度存在顯著差異，有的品種在各種地塊上種植從不發(fā)生干燒心現(xiàn)象，而有的品種則在相同條件下年年出現(xiàn)干燒心。由此推測，不同干燒心易感程度的大白菜材料在鈣吸收和運(yùn)輸系統(tǒng)中可能存在差異。在鈣的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，作為非選擇性陽離子通道（non-selective cation channels，NSCCs）重要組成的環(huán)腺苷酸門通道 （cyclic-nucleotide gated channels，CNGCs） 蛋白起重要的作用[2-5]。我們以兩個(gè)極端抗/感干燒心大白菜自交系為試材，采用全基因組重測序方法篩選編碼CNGC的差異基因，并對其進(jìn)行詳細(xì)解析，旨在為下一步鑒定基因功能、開發(fā)功能性標(biāo)記、采用QTL定位技術(shù)篩選與抗/感干燒心緊密連鎖的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用材料為極端易感干燒心大白菜材料06-247，從日本大白菜一代雜交種健春的自交后代中分離；極端抗干燒心大白菜材料He102為地方品種河南二包頭后代的分離自交系。

1.2CNGCs結(jié)構(gòu)差異基因的篩選

全基因組重測序委托百邁客公司進(jìn)行，將兩材料間的差異基因按swissprot_annotation和GO_annotation功能注釋分別排序，篩選兩項(xiàng)內(nèi)容中包含cyclic nucleotide-gated ion channel的變異位點(diǎn)，獲得變異基因的基因ID信息。

1.3CNGCs差異基因的電子克隆及序列比對

從網(wǎng)站 http：//brassicadb.org/brad/[6]下載大白菜全基因組序列信息，利用網(wǎng)站的search gene 功能獲得變異基因的物理位置，從大白菜基因組序列信息中將對應(yīng)的基因序列拷貝到記事本文檔即完成對變異基因參考序列的電子化克隆。對應(yīng)基因的編碼區(qū)參考序列直接從BRAD數(shù)據(jù)庫中下載獲得。變異基因的突變序列則根據(jù)重測序提供的變異信息手動(dòng)修改完成。各種類型的序列比對均用DNAMAN軟件運(yùn)行。

1.4CNGCs跨膜區(qū)預(yù)測

跨膜區(qū)預(yù)測在網(wǎng)站http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html上進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1環(huán)腺苷酸門通道差異基因的篩選

按功能注釋排序后，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)差異位點(diǎn)的注釋信息含cyclic nucleotide-gated channel或putative cyclic nucleotide-gated channel，對應(yīng)6個(gè)基因，它們是Bra021265、Bra031529、Bra022702、Bra024067、Bra032132和Bra003081，分別位于A01、A02、A03、A04和A10五條染色體上。Bra022702是雙位點(diǎn)變異，Bra003081有四處變異位點(diǎn)，其余四個(gè)基因是單位點(diǎn)變異。變異類型有移碼突變、可變剪切、密碼子插入/刪除等。Bra021265和Bra022702的突變發(fā)生在He102中，其余4個(gè)基因的突變發(fā)生在06-247中（表1）。

2.2差異基因在抗/感干燒心材料間的序列比較

Bra021265是一個(gè)可變剪切類的變異基因，該基因編碼區(qū)參考序列全長2 229 bp，包含11個(gè)外顯子，編碼743個(gè)氨基酸殘基，與擬南芥CNGC19同源。He102的Bra021265在第六內(nèi)含子與第七外顯子之間插入了一個(gè)堿基，該堿基位于第六內(nèi)含子剪切受體位點(diǎn)，有可能影響基因的正常剪切。06-247與He102的Bra021265序列差異如圖1所示。

Bra031529基因編碼區(qū)參考序列長2 274 bp，包括11個(gè)外顯子，編碼758個(gè)氨基酸殘基，與擬南芥CNGC20同源。在06-247中，該基因編碼區(qū)第11個(gè)外顯子中插入了一個(gè)堿基A（圖2A），導(dǎo)致06-247的編碼產(chǎn)物發(fā)生移碼突變而不能正常終止。經(jīng)軟件預(yù)測，變異后的基因在3′端非翻譯區(qū)126～128 bp之間有一個(gè)終止密碼子，致使突變基因編碼區(qū)長2 406 bp，編碼產(chǎn)物比參考基因長43個(gè)氨基酸殘基，差異主要在蛋白的C-端（圖2B）。

Bra022702包含8個(gè)外顯子，與擬南芥CNGC4同源。測序結(jié)果表明He102的Bra022702在第一外顯子處有兩處突變，在不足50 bp的范圍內(nèi)同時(shí)缺失一個(gè)密碼子和插入一個(gè)密碼子（圖3A），而06-247沒有發(fā)生突變。二者編碼產(chǎn)物總氨基酸數(shù)目不變，都包含695個(gè)氨基酸殘基，變異區(qū)域介于第31～50個(gè)氨基酸殘基之間（圖3B），變異位于編碼蛋白的N端。

Bra024067的編碼區(qū)參考序列長2 136 bp，包括5個(gè)外顯子，與擬南芥CNGC9同源。基因變異發(fā)生在06-247中，在編碼區(qū)第658個(gè)密碼子后插入了3個(gè)密碼子（圖4A），導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物比He102多3個(gè)氨基酸殘基（圖4B）。

Bra032132參考基因編碼區(qū)長2 238 bp，包含7個(gè)外顯子，編碼746個(gè)氨基酸殘基，與擬南芥CNGC6同源。突變發(fā)生在06-247中，在第680個(gè)密碼子后缺失了兩個(gè)密碼子（圖5A），導(dǎo)致變異基因少兩個(gè)氨基酸殘基（圖5B）。

Bra003081的參考基因編碼區(qū)長2 274 bp，包括6個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)物長758個(gè)氨基酸殘基，與擬南芥CNGC1同源。四處變異均發(fā)生在06-247中，在不足20 bp的范圍內(nèi)有四處移碼突變（圖6A），導(dǎo)致突變基因的編碼區(qū)長2 275 bp。移碼突變使翻譯產(chǎn)物提前終止，C-端缺失389個(gè)氨基酸殘基，只編碼產(chǎn)生含369個(gè)氨基酸殘基的蛋白（圖6B）。

2.3差異基因跨膜區(qū)預(yù)測

CNGCs屬于跨膜蛋白，本研究用在線軟件對差異基因的跨膜區(qū)進(jìn)行了預(yù)測，這些基因分別有5～8個(gè)跨膜區(qū)不等，C-端位于胞質(zhì)一側(cè)，長短不等。具有5～6個(gè)跨膜區(qū)的CNGC其膜內(nèi)側(cè)區(qū)域較長，而具有8個(gè)跨膜區(qū)的CNGC則C-端較短。詳細(xì)結(jié)果見表2。

3討論與結(jié)論

植物對鈣的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是個(gè)復(fù)雜的過程，一方面，植物對鈣的吸收受環(huán)境的影響，如土壤干旱、鹽堿化；另一方面，不同基因型的植物由于鈣吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因的變異導(dǎo)致在相同環(huán)境下對鈣的吸收存在差異。后者在育種工作中意義較大。參與鈣吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的基因眾多，其中CNGCs是一類重要的非選擇性陽離子通道蛋白，參與植物Ca2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，也參與Na+、K+等一價(jià)陽離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。在植物中，人們已從大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等物種中克隆到CNGCs基因[7]。模式植物擬南芥CNGCs家族有20個(gè)基因（CNGC1～CNGC20）。CNGCs是一類跨膜的通道蛋白，C-端是調(diào)控區(qū)，位于膜內(nèi)胞質(zhì)一側(cè)，此區(qū)域既可被環(huán)核苷酸結(jié)合后激活，又可被鈣調(diào)素競爭結(jié)合后失活[8]。本研究從大白菜兩材料中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)CNGCs變異基因，其中4個(gè)（Bra031529、Bra024067、Bra032132和Bra003081）的變異均造成C端結(jié)構(gòu)變異，有可能影響其功能。尤其是Bra003081，與擬南芥CNGC1同源性最高，其C端有大段的缺失，這有可能導(dǎo)致其調(diào)控區(qū)完全喪失，從而影響其對Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)。因?yàn)橛醒芯勘砻?，擬南芥CNGC1在根部高水平表達(dá)，其功能缺失突變

造成地上部分Ca2+含量顯著少于野生型[9]。Bra022702、Bra032132、Bra024067分別與AtCNGC4、AtCNGC6和AtCNGC9同源，其中，AtCNGC4與AtCNGC6都有參與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的報(bào)道[10，11]，AtCNGC9的功能研究未見報(bào)道。Bra021265和Bra031529分別與AtCNGC19和AtCNGC20具有較高的同源性，AtCNGC19在根部表達(dá)，而AtCNGC20則主要在葉脈周圍高水平表達(dá)[12]。

本研究篩選到的大白菜CNGCs結(jié)構(gòu)變異基因，均可以根據(jù)其核酸序列的差異特點(diǎn)開發(fā)成一定類型的分子標(biāo)記，用于研究雙親衍生群體中干燒心性狀的QTL定位，為下一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]唐文浩， 陳雪華， 鄺春蘭， 等.辣椒果實(shí)鈣吸收累積的基因型差異及其生理特征[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 2002， 8（3）：349-354.

[2]Demidchik V， Maathuis F J M. Physiological roles of nonselective cation channels in plants： from salt stress to signalling and development[J]. New Phytol.， 2007， 175： 387-404.

[3]Pinto E， Ferreira I M P L V O. Cation transporters/channels in plants： tools for nutrient biofortification[J]. Journal of Plant Physiology， 2015， 179： 64-82.

[4]吳巨友，薛亞男，張紹鈴. 植物環(huán)核苷酸門控離子通道基因的功能及其調(diào)控[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2010， 30（8）：1716-1720.

[5]周衛(wèi)， 汪洪.植物鈣吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的生理和分子機(jī)制[J].植物學(xué)通報(bào)， 2007， 24 （6）： 762-778.

[6]Cheng F， Liu S， Wu J， et al. BRAD， the genetics and genomics database for Brassica plants[J]. BMC Plant Biol.， 2011， 11：136.

[7]Talke I N， Blaudez D， Maathuis F J， et al. CNGCs：prime targets of plant cyclic nucleotide signaling[J]. Trends of Plant Science， 2003，8（6）：286-293.

[8]Kaplan B， Sherman T， Fromm H. Cyclic nucleotide-gated channels in plants[J].FEBS Letters， 2007， 581（12）： 237-246.

[9]Kaupp U B， Seifert R. Cyclic nucleotide-gated ion channels[J].Physiol. Rev.， 2002， 82：769-824.

[10]Kimberley C， Thomas A D， Moeder W， et al. The Arabidopsis cyclic nucleotide-gated ion channels AtCNGC2 and AtCNGC4 work in the same signaling pathway to regulate pathogen defense and floral transition[J]. Plant Physiol.， 2013， 163（2）：611-624.

[11]Wang Y F， Munemasa S， Nishimura N， et al. Identification of cyclic GMP-activated nonselective Ca2+-permeable cation channels and associated CNGC5 and CNGC6 genes in Arabidopsis guard cells[J]. Plant Physiol.， 2013，163（2）：578-590.

[12]Kugler A， Khler B， Palme K， et al. Salt-dependent regulation of a CNG channel subfamily in Arabidopsis[J]. BMC Plant Biol.，2009， 9：140.