尖孢鐮刀菌拮抗菌SN06的分離、鑒定及其對棉花枯萎病的防治效果

李玉洋+辛寒曉+范學明+劉麗英+孫中濤

摘要：采用平板稀釋法從棉花根際土壤中分離獲得菌株，以尖孢鐮刀菌為指示菌采用平板對峙法篩選拮抗菌，通過形態(tài)特征、生理生化特征、16S rRNA序列分析對篩選出的拮抗菌進行鑒定，采用平板對峙法研究其抗菌譜，研究其粗提液對溫度、pH值和蛋白酶的拮抗穩(wěn)定性，通過種子萌發(fā)及盆栽試驗探究其對棉花枯萎病的防治效果。結(jié)果表明，分離獲得一株對尖孢鐮刀菌拮抗作用較強的菌株SN06，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌；菌株SN06抗菌譜廣，對多種病原真菌均有一定拮抗作用，且其拮抗作用具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性與蛋白酶穩(wěn)定性；接種解淀粉芽孢桿菌SN06可顯著降低枯萎病的發(fā)病指數(shù)，平均防效高達65.19%。解淀粉芽孢桿菌SN06在棉花枯萎病的生物防治方面具有一定的應用價值。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；棉花枯萎?。患怄哏牭毒?；生物防治

中圖分類號：S435.621文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）03-0117-06

AbstractThe strains were isolated from the rhizosphere soil of cotton by agar plate dilution method. Taking Fusarium oxysporum as the indicator strain， the antagonistic strain was selected by plate confrontation method. Then the antagonistic strain was identified by morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. The antibacterial spectrum was studied by the plate dilution method. The antagonism stability to temperature， pH value and protease was verified. The control effect on cotton Fusarium wilt was explored by seed germination and pot experiments. The results showed that strain SN06 exhibited an stronger antagonistic effect on Fusarium oxysporum. It was identified as Bacillus amyloliquefaciens. Strain SN06 could inhibit the growth of a variety of pathogens and had a broad antimicrobial spectrum. The strain had good antagonism stability to temperature， pH value and protease. Bacillus amyloliquefaciens SN06 could significantly reduce the disease index of cotton Fusarium wilt with the average control efficiency of 65.19%. Bacillus amyloliquefaciens SN06 had certain application value in the biological control of cotton Fusarium wilt.

KeywordsBacillus amyloliquefaciens； Cotton Fusarium wilt； Fusarium oxysporum； Biological control

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的真菌性病害，在世界各地普遍發(fā)生，嚴重危害棉花生產(chǎn)[1]。該病的致病機制是病原菌侵染棉花維管束等部位，堵塞導管，阻滯水分和養(yǎng)分運輸，并產(chǎn)生毒素，影響棉花的新陳代謝，導致死苗、枯葉、落蕾、減產(chǎn)、纖維品質(zhì)劣變等危害[2]。 目前，棉花枯萎病的防治以化學防治為主，常用藥物主要是多菌靈、甲基托布津、百菌清、克黃枯等?；瘜W防治不僅污染環(huán)境、危害人畜安全，而且還會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，降低防治效果[3]。與化學防治相比，生物防治具有專一性強、安全性高、環(huán)境友好等優(yōu)點。因此，篩選對尖孢鐮刀菌拮抗作用強的微生物用于棉花枯萎病的生物防治，具有重要意義。很多微生物都對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用，包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等細菌，木霉屬真菌（Trichoderma）、叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhize）等真菌，以及細黃鏈霉菌（Streptomyces microflavus）等放線菌，其中以木霉對棉花枯萎病的防治效果最好，在生產(chǎn)中應用較多，而芽孢桿菌的應用相對較少[4-9]。但與木霉相比，芽孢桿菌生長快，生產(chǎn)成本低，抗逆性強。因此，篩選高防效芽孢桿菌，用于抗病性生物肥料的生產(chǎn)，對棉花枯萎病的生物防治具有重要意義。本試驗從棉花根際土壤中篩選對尖孢鐮刀菌拮抗作用強的芽孢桿菌，并對其抗菌譜、拮抗作用穩(wěn)定性及對棉花枯萎病的防治效果進行研究，以期為抗病性生物肥料的生產(chǎn)提供新的菌種資源。1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土樣供試土樣采自山東省泰安、濟南、德州、菏澤等地區(qū)的棉田，種植棉花品種為魯棉11。

1.1.2供試病原菌棉花枯萎病菌（F. oxysporum ）、層出鐮孢菌（F. proliferatum）、馬鈴薯灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、白菜炭疽病菌（Colletotrichum higgisianum）、黃瓜黑斑病菌（Alternaria cucumerina），均由山東農(nóng)業(yè)大學微生物工程實驗室提供。

1.1.3供試培養(yǎng)基病原真菌培養(yǎng)及拮抗性試驗采用PDA培養(yǎng)基；拮抗細菌的分離與菌種保存采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；拮抗細菌的搖瓶培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基；盆栽試驗所用尖孢鐮刀菌菌劑的制備采用麩皮培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株篩選及抗菌譜測定土壤細菌的分離采用平板稀釋法[10]，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，長出單菌落后，根據(jù)菌落與菌體形態(tài)特征初步鑒別不同菌株并轉(zhuǎn)接至斜面，于 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

拮抗菌株的篩選采用平板對峙法，將從土壤中分離的菌株與尖孢鐮刀菌活化后分別進行平板培養(yǎng)。用直徑5 mm打孔器在尖孢鐮刀菌邊緣打取菌塊，接種到PDA平板中央。培養(yǎng)3 d后，在距離尖孢鐮刀菌菌塊2 cm處的4個對接點中3個接種土壤中分離的菌株，另外1個接點不接種菌株作為空白對照，于28℃恒溫培養(yǎng)7 d ，測量拮抗細菌菌落直徑與抑菌間隙寬度。拮抗效果以抑菌圈與拮抗細菌菌落直徑的比值表示，其中：抑菌圈直徑=2×抑菌間隙寬度+拮抗菌菌落直徑。每處理重復3 次。

抗菌譜的測定采用平板對峙法，方法同上。供試病原菌見表3。

1.2.2拮抗細菌菌株SN06的鑒定拮抗細菌形態(tài)特征與生理生化特征的鑒定參照文獻[11]進行。將菌株SN06采用稀釋涂布平板法接種到牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培養(yǎng) 24 h，觀察菌落形態(tài)，并采用簡單染色、革蘭氏染色和芽孢染色法觀察其細胞形態(tài)。將菌株SN06移至吲哚試驗培養(yǎng)基、甲基紅試驗培養(yǎng)基等14種供試培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，鑒定其生理生化特征。

拮抗菌株SN06在LB培養(yǎng)基上進行搖瓶培養(yǎng)，收集菌體，采用 CTAB 法[12]提取總DNA，以其為模板，在原核生物16S rRNA 基因的通用正向引物27F： 5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′的引導下進行PCR 擴增。擴增條件為：95℃ 預變性3 min，94℃變性1 min，55℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)，72℃延伸 10 min。擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，并采用膠回收試劑盒進行回收，然后委托上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序。所獲得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，并用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行多序列同源性分析。

1.2.3粗提液穩(wěn)定性測定將拮抗細菌菌株SN06接種于LB培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，3 500 r/min離心10 min，上清液采用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，濾液即為粗提液。

粗提液分別于60、80、90、100、120℃熱處理30 min，冷卻至室溫后，采用牛津杯法[13]測定其對尖孢鐮刀菌的拮抗活性，以研究其熱穩(wěn)定性。

用0.5 mol/L NaOH 或 0.5 mol/L HCl分別將粗提液的pH值調(diào)至3、5、7、9、11，室溫保持1 h，然后再回調(diào)至初始pH值，采用牛津杯法測定其對尖孢鐮刀菌的拮抗活性，以研究其酸堿穩(wěn)定性。

粗提液分別采用蛋白酶K、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶進行水解，酶濃度為1 μg/mL，于45℃水解30 min，然后測定其拮抗活性，以研究其對蛋白酶的穩(wěn)定性。

試驗以未經(jīng)處理的粗提液為對照，其對尖孢鐮刀菌的拮抗活性為100%，處理樣品的活性定義為與對照活性比值的百分數(shù)。

1.2.4 拮抗細菌菌株SN06對棉花種子萌發(fā)的影響精選飽滿、大小一致的棉花種子，用10%NaClO消毒10 min，用無菌水沖洗干凈，然后用粗提液浸泡24 h，以無菌水浸泡24 h為對照。無菌水沖洗干凈分裝于鋪有濕潤濾紙的空培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿30粒，每個處理3皿，重復3次。25℃恒溫保濕培養(yǎng)，進行發(fā)芽試驗[14]。

1.2.5棉花盆栽試驗將拮抗細菌菌株SN06接種于LB培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，然后采用平板菌落計數(shù)法測定有效活菌濃度，并將其調(diào)整至1×109 cfu/mL，即為SN06菌劑，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將尖孢鐮刀菌菌株接種于麩皮培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7 d，長滿菌絲后于30℃風干，然后粉碎至80目，即為尖孢鐮刀菌菌劑。

取健康土壤裝盆，按表 1 接種量接種尖孢鐮刀菌菌劑和SN06菌劑，進行盆栽試驗。尖孢鐮刀菌菌劑在栽培前與土壤拌勻，SN06菌劑在播種后隨水澆入。棉苗株高至5 cm 時進行疏苗，苗齡為15 d，每盆保留1株，按常規(guī)方式進行管理，于播種后40、60、80 d觀察記錄發(fā)病株數(shù)。

病情嚴重度分級如下：0級：棉株健康，無病葉，生長正常；1級：棉株1～2片子葉變黃萎蔫；2級：棉株2片子葉和1片真葉變黃萎蔫，葉脈呈黃色網(wǎng)紋狀；3級：棉株2片子葉及 2片及以上真葉變黃萎蔫，葉脈呈黃色網(wǎng)紋狀或青枯狀，棉株矮化或萎蔫；4級：棉株所有葉片發(fā)病，棉株枯死。

病情指數(shù)及相對防效按下述公式計算：

病情指數(shù)=∑（發(fā)病棉花株數(shù)×病情級別數(shù)）/（棉花總株數(shù)×病情最高級別數(shù)）×100；

相對防效（%）=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0，處理間的差異顯著性分析采用Duncan 氏新復極差法。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株的篩選結(jié)果

從土壤中共分離出58株細菌，以尖孢鐮刀菌為指示菌，采用平板對峙法篩選拮抗菌，共獲得6株拮抗效應較好的菌株，依次命名為SN01—SN06，其抑菌能力如表2所示，其中以SN06的拮抗能力最強，抑菌圈直徑和菌落直徑比值達2.82，其平板對峙培養(yǎng)圖見圖1。

2.2拮抗菌株SN06的抑菌譜

拮抗菌株SN06對6種病原菌的拮抗作用如表3所示，該菌株抑菌譜較廣，對受試病原菌均具有一定的拮抗作用，但對不同病原菌的拮抗作用差異顯著，其中對棉花枯萎病菌的拮抗作用最強，層出鐮孢菌與白菜炭疽病菌次之，對馬鈴薯灰霉病菌、辣椒疫病菌、黃瓜黑斑病菌的拮抗效果較差。

2.3拮抗菌株SN06的鑒定

2.3.1拮抗菌株SN06的形態(tài)與生理生化特征拮抗菌株SN06在牛肉膏蛋白胨平板上于37℃培養(yǎng)24 h 后，菌落呈圓形，白色至灰白色，表面濕潤，平坦，不透明；菌體呈桿狀，產(chǎn)芽孢，芽孢圓形，不膨大，無伴孢晶體；革蘭氏染色陽性。其生理生化特征如表4所示。

2.3.216S rDNA 序列分析拮抗菌株SN06的測序結(jié)果表明，用16s rDNA通用引物擴增出一條1 425 kb的片斷，將其序列利用 BLAST 程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對，并用MEGA 4.0 軟件進行多序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。

通過形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA 序列分析可知，菌株SN06為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.4粗提液穩(wěn)定性

拮抗菌株SN06發(fā)酵液的粗提液具有較高的熱穩(wěn)定性，在100℃與120℃條件下處理 30 min，拮抗活性仍能保留75%與62%，如圖3a所示。生產(chǎn)實踐中，菌劑的生產(chǎn)與使用溫度一般低于60℃，不會影響粗提液的拮抗能力。粗提液在pH值5～11之間具有穩(wěn)定的拮抗活性，但在酸性條件下穩(wěn)定性稍差，在pH值3 時，活性僅能保留65%，如圖3b所示。粗提液對蛋白酶具有較高的穩(wěn)定性，經(jīng)蛋白酶K、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶于45℃水解30 min后，拮抗活性均能保留75%以上，如圖3c所示。

2.5拮抗菌株SN06粗提液對棉花種子萌芽的影響

由表5可知，拮抗菌株SN06 粗提液對棉花種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均有促進作用，尤其對胚根的生長促進顯著（P<0.05）。

2.6棉花盆栽試驗結(jié)果

棉花盆栽試驗結(jié)果如表6所示， CK1病情指數(shù)為0，而CK2病情指數(shù)高達52.45%～65.43%，說明試驗所用病原菌對受試棉花具有較強致病性。與CK2相比，接種SN06菌劑的處理發(fā)病指數(shù)僅為12.42%～28.78%，平均相對防效高達65.19%，說明SN06菌株對棉花枯萎病具有較好的防治效果。盆栽試驗還表明，不同栽培時期，SN06菌株對棉花枯萎病的相對防效均較高。此外，還表明隨著栽培期的延長，防效有所下降。

3討論與結(jié)論

應用拮抗微生物防治植物病害可以減少化學農(nóng)藥對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的污染。本研究從棉花根際土壤中篩選出對棉花枯萎病菌有顯著抑制作用的細菌SN06，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌相似度極高的革蘭氏陽性菌，繁殖速度快，易培養(yǎng)，有芽孢，環(huán)境適應性強，生長繁殖過程中可產(chǎn)生多種具有促生與抑菌作用的代謝產(chǎn)物，是生物肥料生產(chǎn)中應用較為普遍的微生物之一。 本研究結(jié)果表明，SN06對6種供試病原菌均有較強的抑菌活性，說明SN06具有高效、廣譜性，具有開發(fā)生防菌劑的潛能。這與解淀粉芽孢桿菌對枯萎病、疫霉病、灰霉病、菌核病等多種植物病害均有較好的防治效果[15-18]相符合。SN06發(fā)酵粗提液具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性與蛋白酶穩(wěn)定性，表明SN06不僅可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，而且抗菌物質(zhì)的活性穩(wěn)定性強。目前研究表明，解淀粉芽孢桿菌主要產(chǎn)生抗菌蛋白、寡肽與脂肽類物質(zhì)等[15-17]，但具體產(chǎn)生的物質(zhì)及產(chǎn)生條件還需進一步研究。棉花盆栽試驗結(jié)果表明，接種解淀粉芽孢桿菌SN06可顯著降低棉花枯萎病的病情指數(shù)，平均相對防效高達65.19%，與文獻[5，19]報道的綠色木霉、枯草芽孢桿菌等對棉花枯萎病的防效相比，處于較高水平?？傊?，解淀粉芽孢桿菌SN06對棉花枯萎病菌抑菌效果強，在棉花枯萎病的生物防治方面具有一定的應用價值、應用潛力。參考文獻：

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