貴州主栽藍(lán)莓品種活性成分及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

謝國芳，王新華，王瑞，金傳緒，周笑犁，劉志剛，鄭雄

(貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽，550005)

貴州主栽藍(lán)莓品種活性成分及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

謝國芳*，王新華，王瑞，金傳緒，周笑犁，劉志剛，鄭雄

(貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽，550005)

為了解貴州主栽藍(lán)莓品種果實(shí)中活性成分含量及其綜合抗氧化活性，以貴州規(guī)模化種植的粉藍(lán)、圓藍(lán)、巴爾德溫和燦爛為試材，測定其9種酚類組分含量、多酚、總黃酮、花色苷，并用FRAP法、總還原力(TRAP)、DPPH法和ABTS法開展體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，采用皮爾森相關(guān)性分析對(duì)4個(gè)品種各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：沒食子酸、表兒茶素、蘆丁、p-香豆酸、槲皮素、兒茶素、鞣花酸、綠原酸、阿魏酸是供試藍(lán)莓果實(shí)中的酚類成分較高，4個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)中活性成分含量差異顯著(P<0.05)，粉藍(lán)中沒食子酸、阿魏酸和總黃酮含量最高，圓藍(lán)中綠原酸、鞣花酸和蘆丁含量最高，巴爾德溫中槲皮素和花色苷含量最高，燦爛果實(shí)中兒茶素、表兒茶素、p-香豆酸和總酚含量最高；4個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)的抗氧化活性差異顯著(P<0.05)，燦爛的抗氧化活性指數(shù)最高；藍(lán)莓果實(shí)中不同活性成分對(duì)抗氧化活性差異顯著(P<0.05)，綠原酸含量對(duì)FRAP值具有較強(qiáng)貢獻(xiàn)，阿魏酸、多酚和總黃酮含量對(duì)TRAP值的貢獻(xiàn)極強(qiáng)，沒食子酸含量對(duì)DPPH值的貢獻(xiàn)極強(qiáng)，花色苷含量對(duì)ABTS值的貢獻(xiàn)較強(qiáng)，抗氧化活性指數(shù)(ACI)與表兒茶素和p-香豆酸含量呈現(xiàn)極其顯著的正相關(guān)(P<0.01)。

藍(lán)莓；活性成分；抗氧化活性；相關(guān)性分析

藍(lán)莓又名越橘，富含花色苷、黃酮類化合物，低糖、低脂肪，具有改善視力、提高免疫力和抗氧化等功效[1-3]。 2000年貴州省黔東南州共引入藍(lán)莓4大類30多個(gè)品種，現(xiàn)已篩出‘圓藍(lán)’、‘頂峰’、‘芭爾德溫’、‘梯夫藍(lán)’、‘燦爛’、‘粉藍(lán)’、‘杰兔’、‘S13’等8個(gè)藍(lán)莓品種進(jìn)行規(guī)?；N植[4]。前期研究及文獻(xiàn)顯示，藍(lán)莓果實(shí)中酚類物質(zhì)含量顯著高于花色苷含量，其不同品種和產(chǎn)地對(duì)總酚含量影響較大[5-10]，目前，國內(nèi)外對(duì)藍(lán)莓的花色苷的提取、純化、穩(wěn)定性、功效及其開發(fā)應(yīng)用等方面報(bào)道較為全面[11～15]，而酚類物質(zhì)的研究仍以總酚、粗提取及其抗氧化活性研究為主，僅DASTMALCHI等、PERTUZATTI等及劉翼翔等對(duì)藍(lán)莓果實(shí)中酚類組分及其抗氧化活性進(jìn)行分析[16～18]，發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域和品種果實(shí)中酚類組分差異明顯，尚無貴州引種藍(lán)莓果實(shí)酚類組分的相關(guān)報(bào)道。本文以貴州省黔東南州規(guī)?；N植的粉藍(lán)、圓藍(lán)、巴爾德溫和燦爛4個(gè)藍(lán)莓品種為試驗(yàn)材料，對(duì)總酚、總黃酮及其9種酚類組成成分進(jìn)行分析，使用DPPH法、ABTS法、FRAP法和總還原力開展體外抗氧化活性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以種植10年樹齡藍(lán)莓為實(shí)驗(yàn)樹，種植均按照黔東南州《藍(lán)莓栽培與管理技術(shù)》實(shí)施，2015年7月14日在麻江縣龍奔藍(lán)莓種植基地采摘粉藍(lán)、圓藍(lán)、巴爾德溫和燦爛4個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)，采摘完全成熟(果實(shí)呈現(xiàn)深藍(lán)色)、大小均勻的果實(shí)；具體按照GB/T 8855—2008 《新鮮水果和蔬菜 取樣方法》，采摘后以125 g/盒分裝于PE保鮮盒中，貯藏于4 ℃采樣箱中，運(yùn)回貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室，保留于-70 ℃超低溫冰箱。

沒食子酸(99%)、表兒茶素(≥98.0%)、p-香豆酸(≥99.0%)、槲皮素(≥98.5%)、兒茶素(≥95.0%)、鞣花酸(≥96.0%)、綠原酸(≥98.0%)、阿魏酸(≥99.5%)、甲醇(色譜純)、三氟乙酸(≥99.5%，色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司(中國上海)；DPPH、TPTZ、ABTS、Gallic Acid、Rutin(99.0%)、Trolox(99.0%)，美國Sigma公司；其他分析劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；超聲清洗器( KQ5200DE)，昆山市超聲儀器有限公司；IKA A11研磨機(jī)，IKA公司(德國)；C18色譜柱(250mm x 4.6mm,5 μm)，Waters公司(中國上海)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酚類成分提取

參考白鴿等[19]的方法并作適當(dāng)修改。稱取10 g凍果研磨成漿，取2 g果漿裝入10 mL離心管中，加入4.0 mL體積分?jǐn)?shù)為70% 甲醇溶液，50 ℃超聲波輔助提取30 min，冷卻后10 000 r/min離心15 min，將上清液過濾到10 mL的容量瓶中，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇溶液于殘?jiān)性偬崛?0 min，在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，合并上清液，用體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇溶液定容，用0.45 μm的濾膜過濾后待測，取1.0 mL轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中等待進(jìn)樣，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3.2 花色苷、總酚和總黃酮含量測定

花色苷含量測定：采用pH示差法測定，以100 g鮮樣中所含矢車菊素-3-葡萄糖苷量(mg)表示[20]；多酚含量：采用福林-酚比色法測定[21]，以1 g鮮樣所含沒食子酸當(dāng)量(mg)表示，即mg GAE/g；總黃酮采用比色法，以1 g鮮樣中所含蘆丁當(dāng)量(mg)表示，即mg RE/g[22]。

1.3.3 色譜條件

準(zhǔn)確稱取 9種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10.00 mL，配制成1.00 mg/mL的酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，溶液A(甲醇)和溶液B(0.3% 三氟乙酸)，利用溶液B進(jìn)行線性梯度洗脫：0～5 min，88%B；5～10 min，88%～75%B;10～15 min，75%B；15～20 min，75%～70%B；20～25 min，70%B；25～35 min,70%～65%B；35～40 min，65%B；40～50 min，50%B；50～60 min，88%B。柱溫：30 ℃；流動(dòng)相速率：0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測器：紫外檢測器；波長：258 nm和280 nm。

1.3.4 抗氧化活性測定

抗氧化能力(FRAP)參照TODOROVIC等的方法，以100 g鮮樣中所含當(dāng)量Trolox(mmol)的清除能力表示，即mmol TE/g[23]；DPPH自由基清除能力參照TAUCHEN等的方法，以100 g鮮樣中所含當(dāng)量Trolox的清除能力(mmol)表示，即mmol TE/g[24]；總還原力參照OLIVEIRA等的方法，以100 g鮮樣中所含當(dāng)量Trolox的清除能力(mmol)表示即mmol TE/g[25]；ABTS自由基清除能力參照SCHAICH等的方法，以100 g鮮樣中所含當(dāng)量Trolox的清除能力(mmol)表示，即mmol TE/g[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用 IBM SPSS19.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)和作圖，測定結(jié)果用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)來表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素差異分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，皮爾森相關(guān)性分析(pearson′s correlation analysis)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種藍(lán)莓果實(shí)中活性成分分析

4個(gè)藍(lán)莓中活性成分含量見表1。由表1結(jié)果可知，4個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)中活性成分及其含量差異顯著(P<0.05)，粉藍(lán)中沒食子酸[(750.37±52.03) μg/g FW]、阿魏酸[(128.95±4.73) μg/g FW]和總黃酮[(3.08±0.01) mg/g]含量最高，粉藍(lán)中沒食子酸含量顯著高于其他3品種，粉藍(lán)中沒食子酸含量是圓藍(lán)[(51.13±1.11) μg/g FW]的14倍，與PERTUZATTI等(2012)的研究結(jié)果基本一致[17]，綠原酸[(0.93±0.02) μg/g FW]、香豆酸[(2.78±0.05) μg/g FW]、槲皮素[(2.77±0.02) μg/g FW]含量最低；圓藍(lán)中綠原酸含量[(56.62±2.16) μg/g FW]、鞣花酸[(79.01±3.51) μg/g FW]和蘆丁[(30.41±1.88) μg/g FW]含量最高，綠原酸含量接近是巴爾德溫[(0.59±0.02) μg/g FW]的100倍，鞣花酸含量是燦爛中的9倍，香豆酸、阿魏酸、總酚和花色苷含量最低；巴爾德溫中槲皮素[(14.58±0.67) μg/g FW]、花色苷[(140.55±2.01) mg/100g FW]含量最高，顯著高于其他3個(gè)品種，其中槲皮素是燦爛果實(shí)的5倍，鞣花酸[(74.35±2.65) μg/g FW]和蘆丁[(0.59±0.02) μg/g FW]含量與圓藍(lán)果實(shí)的無明顯差異(P>0.05)，綠原酸[(0.59±0.02) μg/g FW]、兒茶素[(2.60±0.19) μg/g FW]和表兒茶素[(1.09±0.38) μg/g FW]和總黃酮[(2.07±0.00) mg/g FW]含量最低；燦爛果實(shí)中兒茶素含量[(6.10±0.12) μg/g FW]、表兒茶素[(66.49±2.4) μg/g FW]、香豆酸[(7.57±0.43) μg/g FW]和總酚[(26.32±0.38) μg/g FW]顯著(P≤0.001)高于其他3個(gè)品種，總酚含量是圓藍(lán)[(12.79±0.57) mg/g FW]的2倍，表兒茶素含量是巴爾德溫[(1.09±0.38) μg/g FW]的60倍，鞣花酸[(8.52±0.38) mg/g FW]、槲皮素[(2.54±0.06) mg/g FW]含量最低；粉藍(lán)與燦爛中花色苷含量差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同品種藍(lán)莓果實(shí)中活性成分分析

注：同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同品種藍(lán)莓果實(shí)抗氧化活性分析

不同藍(lán)莓果實(shí)中抗氧化活性結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同品種藍(lán)莓果實(shí)抗氧化活性分析Fig.1 Antioxidant activity analysis in blueberry of different cultivars

通過單因素方差分析，圓藍(lán)的FRAP值[(91.78±0.00) mmol TE /g FW]顯著高于其他3個(gè)品種(P<0.05)；燦爛的TRPA[(200.04±8.12) mmol TE/100g FW]顯著高于其他品種果實(shí)(P<0.05)，圓藍(lán)和巴爾德溫的TRPA差異不顯著(P>0.05)，巴爾德溫的TRPA[(99.09±5.17) mmol TE/100g FW]最低，僅為燦爛的1/2；燦爛的DPPH[(27.37±1.10) mmol TE/100g FW]顯著高于其他3個(gè)品種(P<0.05)，圓藍(lán)和巴爾德溫的DPPH值差異不顯著(P>0.05)，粉藍(lán)的DPPH值[(3.21±0.68) mmol TE/100g FW]極其顯著低于其他3個(gè)品種(P<0.001)，僅為燦爛的1/8；粉藍(lán)的ABTS值[(170.98±3.77) mmol TE/g FW]顯著高于其他3個(gè)品種(P<0.05)，圓藍(lán)的ABTS值[(98.20±5.67) mmol TE/g FW]著低于其他3個(gè)品種(P<0.001)。

2.3 酚類物質(zhì)及抗氧化活性的相關(guān)性分析

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對(duì)4個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果如表2所示。由表2可知，多酚含量與阿魏酸含量呈極顯著正相關(guān)，與表兒茶素含量呈顯著正相關(guān)，與鞣花酸和蘆丁含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與槲皮素含量呈顯著負(fù)相關(guān)；總黃酮含量與沒食子酸、阿魏酸含量呈極顯著正相關(guān)，與鞣花酸、蘆丁和槲皮素呈極顯著負(fù)相關(guān)；FRAP值與綠原酸呈極顯著正相關(guān)，與鞣花酸和蘆丁含量呈顯著正相關(guān)，與阿魏酸和花色苷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與多酚和總黃酮呈顯著負(fù)相關(guān)；TRPA值與阿魏酸、多酚和總黃酮呈極顯著正相關(guān)，與兒茶素呈顯著正相關(guān)，與鞣花酸和槲皮素呈極顯著負(fù)相關(guān)，與蘆丁呈顯著負(fù)相關(guān)；DPPH值與沒食子酸和總黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)；ABTS值與花色苷含量呈極其顯著正相關(guān)，ABTS值與阿魏酸和花色苷含量呈顯著正相關(guān)，與綠原酸和總黃酮呈極顯著負(fù)相關(guān)；抗氧化活性指數(shù)與表兒茶素和p-香豆酸呈極顯著正相關(guān)，與多酚呈顯著正相關(guān)。

3 結(jié)論

不同品種間藍(lán)莓果實(shí)的酚類物質(zhì)成分及其含量差異顯著，主要以沒食子酸、綠原酸、阿魏酸和蘆丁為主，粉藍(lán)果實(shí)中含有豐富的沒食子酸、阿魏酸和總黃酮，圓藍(lán)果實(shí)中含有豐富的綠原酸、鞣花酸和蘆丁，巴爾德溫中含有豐富的槲皮素，燦爛果實(shí)中含有豐富的表兒茶素、p-香豆酸和多酚；藍(lán)莓果實(shí)中酚類單體成分對(duì)不同抗氧化活性存在極其顯著的差異，其中，綠原酸含量對(duì)FRAP值具有較強(qiáng)貢獻(xiàn)，阿魏酸、多酚和總黃酮含量對(duì)TRAP值的極強(qiáng)貢獻(xiàn)，而蘆丁和槲皮素卻呈極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；沒食子酸含量對(duì)DPPH值的貢獻(xiàn)最強(qiáng)；花色苷含量對(duì)ABTS值的貢獻(xiàn)最強(qiáng)；表兒茶素和p-香豆酸對(duì)抗氧化活性指數(shù)具有極強(qiáng)的貢獻(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)不同藍(lán)莓品種果實(shí)的活性成分對(duì)其體外抗氧化活性的貢獻(xiàn)并不相同，且對(duì)不同抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)的抗氧化效果也不相同，這與藍(lán)莓果實(shí)中活性成分含量差異、粗提液中其他抗氧化成分的存在及其各種抗氧化評(píng)價(jià)方法的原理差異有著密切聯(lián)系。

表2 各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：*表示顯著(P<0.05)；**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。

因此，在后續(xù)研究中將對(duì)粗提物進(jìn)行分離、純化后結(jié)合體內(nèi)外抗氧化活性評(píng)價(jià)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，綜合各種抗氧化活性效果，進(jìn)而合理評(píng)價(jià)各種因素對(duì)果蔬的抗氧化活性的影響。

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Evaluation of bioactive compounds and antioxidant activity of major blueberry cultivars in Guizhou province

XIE Guo-fang*, WANG Xin-hua, WANG Rui, JIN Chuan-xu,ZHOU Xiao-li, LIU Zhi-gang, ZHENG Xiong

(Food and Pharmaceutical Engineering Institute, Guizhou Engineering Research Center for Fruit Processing,Guiyang University, Guiyang 550005, China)

To investigate the phenolics compounds and antioxidant activity of major blueberry cultivars in Guizhou province, the phenolics compounds, polyphenols, total flavonoids, anthocyanin, and in vitro antioxidant activity of four cultivars in Guizhou province were analyzed using Pearson's correlation analysis. The results indicated that the major phenolic compounds, including gallic acid, epcatechin, rutin,p-coumaric acid, quercetin, catechin, ellagic acid, chlorogenic acid and ferulic acid in the tested blueberry fruits were the highest. The contents of phenolic compounds were significantly different in the 4 cultivars (P<0.05), the gallic acid, ferulic acid and total flavonoids of Powderblue was the highest, the chlorogenic acid, ellagic acid and rutin of Gardenblue was the highest, the quercetin and anthocyanin of Baldwin were the highest, the catechin, epcatechin,p-coumaric acid and polyphenols of Bright Well was the highest. Antioxidant activities of four cultivars were significantly different (P<0.05), and the highest antioxidant activity of Bright Well was the highest. The difference of phenolic compounds on the antioxidant activity was significant (P<0.05). Chlorogenic acid has a strong contribution to FRAP value. The ferulic acid, total polyphenols and total flavonoids has a strong contribution to TRAP value; the gallic acid has a strong contribution to DPPH value, the anthocyanin has a strong contribution to ABTS value. The antioxidant potential composite index (ACI) showed a significant positive correlation with the content of epcatechin andp-coumaric acid (P<0.01).

blueberry; bioactive composition; antioxidant activity; correlation analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702030

碩士，副教授(本文通訊作者，E-mail:xieguofang616@sina.com)。

貴州省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(黔教合KY字[2014]276)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510976029)；貴州省科技廳—貴陽市科技局—貴陽學(xué)院聯(lián)合基金(黔科合LH字[2014]7179號(hào))

2016-06-09，改回日期：2016-07-04