surfactin高產(chǎn)菌株的等離子體誘變及其高通量篩選

surfactin高產(chǎn)菌株的等離子體誘變及其高通量篩選

利用常壓室溫等離子體(atmospheric pressure and room temperature plasma, ARTP)方法對(duì)枯草芽孢桿菌BacillussubtilisE7進(jìn)行快速誘變，篩選表面活性素(surfactin)高產(chǎn)菌株。采用表觀初篩，溶血圈初篩，孔板復(fù)篩，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)，搖瓶驗(yàn)證相結(jié)合的方法提高了篩選通量，加快了篩選進(jìn)程，構(gòu)建了高通量誘變篩選surfactin高產(chǎn)菌株的體系，并使用高效液相(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)化處理時(shí)間為220 s，獲得了遺傳穩(wěn)定的突變菌株BacillussubtillusSF90-5，其產(chǎn)surfactin能力提高到約0.8 g/L，是原始菌株的5倍。ARTP誘變技術(shù)結(jié)合高通量篩選體系極大程度減少了工作量，提高了篩選通量，加快了篩選進(jìn)度，并快速獲得了目的菌株，為脂肽類表面活性劑進(jìn)一步的工藝研究提供了基礎(chǔ)。

surfactin；常壓室溫等離子體；枯草芽孢桿菌；高通量

脂肽類生物表面活性劑是一種由肽鏈和脂肪酸鏈組成的兩性分子，其一端為多個(gè)氨基酸組成的親水基肽鏈，另一端為親油基脂肪烴鏈。常見的脂肽類生物表面活性劑主要以同系物方式存在，主要成分有surfactin、fengycin、iturin等[1]。該類表面活性劑獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其擁有廣譜抗菌性、更高的表面活性及耐熱、耐酸、穩(wěn)定等特點(diǎn)，同時(shí)具有天然、低毒、可降解的優(yōu)點(diǎn)，在食品、化妝品、專用化學(xué)品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、石油開采及生物修復(fù)方面具有巨大的應(yīng)用潛力[2]。隨著人們生活水平的提高，對(duì)食品添加劑及防腐劑的安全性要求越來越高，與傳統(tǒng)食品添加劑相比，脂肽類表面活性劑的廣譜抗菌性使其對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較好的抑制性，且無毒、可降解、乳化性強(qiáng)、不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，因此在新型食品保鮮中替代現(xiàn)有防腐劑、乳化劑等方面具有重要意義[3]。

目前所報(bào)道的產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑的菌株主要有芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、沙雷氏菌屬(Serratiasp.)、曲霉菌屬 (Aspergillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、梭菌屬 (Clotridiumsp.)、隱桿菌屬(Empedobacterhaloabiumsp.)及游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanessp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)、分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)等，研究較為深入的菌株主要集中在芽孢桿菌屬[4-6]。但天然芽孢桿菌產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑的能力相對(duì)較低，開發(fā)成本較高，因此提高菌株的產(chǎn)脂肽能力，一直是研究人員追求的目標(biāo)。閆冬等人采用原生質(zhì)體融合的方法選育出抗菌脂肽高產(chǎn)菌株，最終以HPLC方法檢測(cè)得到surfactin產(chǎn)量為0.274g/L[7]。YAO等人在對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行調(diào)節(jié)后采用干重法最終獲得4g/L的脂肽類生物表面活性劑產(chǎn)量[8]。傳統(tǒng)的搖瓶篩選方式工作量大，步驟繁瑣，得到高產(chǎn)菌株的周期較長，因此，高通量的菌株篩選能有效加快高產(chǎn)菌株獲得速度,ZHU等人通過微孔板的方式最終獲得1株surfactin產(chǎn)量為0.473g/L的枯草芽孢桿菌[9]。

出發(fā)菌株B.subtilisE7，為河南大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的1株surfactin高產(chǎn)菌株。為了進(jìn)一步提高surfactin的產(chǎn)量，本研究采用常壓室溫等離子(atmospheric pressure and room temperature plasma， ARTP)的誘變方法，對(duì)B.subtilisE7進(jìn)行誘變，以多孔板培養(yǎng)的方式擴(kuò)大篩選量，構(gòu)建了surfactin生產(chǎn)菌誘變及篩選的高通量模式，并獲得1株產(chǎn)量較高的surfactin生產(chǎn)菌，為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株生產(chǎn)surfactin提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

枯草芽孢桿菌BacillussubtilisE7(河南大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室篩選保藏)。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)液：葡萄糖20 g/L、酵母膏5 g/L、味精10 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO40.25 g/L。

血平板培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏0.1 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L，羊血50 mL/L。

搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L、尿素4 g/L、酵母膏1 g/L、KH2PO410 g/L、Na2HPO44g/L、NaCl 5 g/L、MgSO40.3 g/L，pH 8.2～8.3，滅菌條件為121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

疊加式大容量恒溫培養(yǎng)搖床，常州英德生物科技有限公司；ARTP誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀MD SpectraMax M2，Molecular Devices公司；高效液相色譜儀，島津Prominence LC-20A。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將4 ℃保藏菌種轉(zhuǎn)接活化平板，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接入到種子活化瓶，37 ℃，200 r/min再次活化培養(yǎng)9 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將活化種子液以1%接種量接入搖瓶或24孔板中37 ℃，200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)60 h。

1.3.3 ARTP誘變

在無菌環(huán)境內(nèi)取10 μL種子液涂于無菌載片上，使菌液在載片表面均勻鋪開。置于ARTP中進(jìn)行處理，處理距離2 mm、氣量10 SLM、功率120 W(以上參數(shù)均為機(jī)器恒定最佳參數(shù)，不需改變)[10]，處理時(shí)間梯度在60～300 s之間。將誘變處理后的載片置于1 mL無菌生理鹽水中，在漩渦振蕩器上振蕩約2 min將菌種洗下。將洗脫液稀釋至合適濃度后均勻涂布于種子平板進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇完成后根據(jù)菌株表觀特征選取菌株點(diǎn)接至血平板。挑取有明顯溶血圈的單菌落二次活化后保藏同時(shí)進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.4 高通量培養(yǎng)

傳統(tǒng)的搖瓶篩選方式工作量大，步驟繁瑣，單次處理量較低，不適合高通量篩選模式。深孔板由于其通量大、體積小而逐漸成為微生物培養(yǎng)及檢測(cè)等研究的主要選擇[9]，近些年來隨著微孔板搖床的研發(fā)水平進(jìn)步，孔板培養(yǎng)的方式也逐步發(fā)展起來。根據(jù)孔的形狀微孔板主要分為圓形和方形兩種，根據(jù)孔數(shù)量適合微生物培養(yǎng)的主要有24、48、96孔等類型。由于發(fā)酵結(jié)束后需要足夠的發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，考慮裝液量及實(shí)際培養(yǎng)效果后最終選定24孔方形孔板進(jìn)行菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)[11]。

24孔板的最大裝液量為10 mL，發(fā)酵周期較長，裝液量過少在培養(yǎng)結(jié)束后剩余發(fā)酵液無法滿足檢測(cè)所需，裝液量過多則會(huì)影響發(fā)酵液中溶氧，且在搖床振動(dòng)過程中發(fā)酵液會(huì)溢出，增加染菌風(fēng)險(xiǎn)，在經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比效果后最終確定裝液量為2 mL[11]。

使用24孔深孔板對(duì)誘變所得菌種進(jìn)行活化，種子液裝液量2 mL，挑取適量菌落后37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)9 h，1%接種量轉(zhuǎn)接至裝有2 mL發(fā)酵液的24孔深孔板中，37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)60 h。發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)其OD600及發(fā)酵液排油圈直徑，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)以驗(yàn)證微孔板孔間平行性。

1.3.5 surfactin含量檢測(cè)

排油圈法[12]。發(fā)酵液離心取上清液。潔凈平板中倒入40 mL 40 ℃左右溫水，滴加15 μL原油液使其鋪勻，加入5 μL的發(fā)酵液上清，靜置30 s，量取排油圈的直徑Φ(cm)。

HPLC檢測(cè)：Inertsil ODS-SP C18反向色譜柱(5 μm×150 mm)。柱溫30 ℃，流動(dòng)相分別為乙腈(含0.1%TFA)、去離子水(含0.1%TFA)。流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長214 nm。0～3 min，乙腈濃度從45%梯度至50%；3～8min乙腈濃度由50%梯度至80%；8～25 min乙腈濃度由80%梯度至100%[13]。發(fā)酵液調(diào)pH 2使產(chǎn)物沉淀?xiàng)壣锨?，甲醇?fù)溶，0.4 μm濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3.6 高通量檢測(cè)方法

氯化十六烷基吡啶-溴百里酚藍(lán)(CPC-BTB)比色法[14]： 0.2 mmol/L CPC(氯化十六烷基吡啶)和0.2 mmol/L BTB(溴百里酚藍(lán))等體積混合在0.1 mol/L PBS(磷酸緩沖溶液，NaH2PO4/Na2HPO4，pH 8.0)中配制成CPC-BTB溶液。在酶標(biāo)板內(nèi)分別加入800 μL CPC-BTB溶液和100 μL發(fā)酵液上清樣品，25 ℃下反應(yīng)5 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定其A600nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變條件的確立

2.1.1 出發(fā)菌株生長曲線

B.subtillusE7從保藏斜面轉(zhuǎn)接至種子平板活化12 h后再次轉(zhuǎn)接至三角瓶內(nèi)，37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)獲得其生長曲線見圖1。

圖1 枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株生長曲線Fig.1 Growth curve of B.subtilis E7

由圖1可看出，菌株在4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，12 h后結(jié)束對(duì)數(shù)生長期開始進(jìn)入穩(wěn)定期。一般對(duì)數(shù)中期的菌株在濃度以及生理特性方面都達(dá)到了較優(yōu)水平，比較適合進(jìn)行誘變處理[15]，因此本實(shí)驗(yàn)選用9 h的菌株作為誘變樣品。

2.1.2 ARTP誘變處理時(shí)間

使用種子液，以不同的處理時(shí)間進(jìn)行ARTP誘變，對(duì)菌株ARTP致死率進(jìn)行測(cè)定。由圖2可以看出，誘變處理時(shí)間在60～150 s時(shí)，隨處理時(shí)間的增加，致死率增加；180 s時(shí)致死率達(dá)到99%；210 s時(shí)致死率達(dá)到99.4%；300 s致死率達(dá)到99.9%。為獲得surfactin高產(chǎn)及生存力較強(qiáng)的菌株，本研究選擇將致死率控制在99%以上。因此對(duì)產(chǎn)surfactin菌株合適的誘變處理時(shí)間為100～220 s。研究中發(fā)現(xiàn)220 s的處理劑量下菌株正突變率較高，在后續(xù)的研究中選取220 s作為實(shí)驗(yàn)處理劑量。

圖2 脂肽合成菌ARTP誘變致死率曲線Fig.2 Plasma mutagenic lethality rate curve of B. subtis E7

2.1.3 高產(chǎn)surfactin突變株的初篩

經(jīng)ARTP誘變后的菌株由于其基因發(fā)生突變，致使某些菌株在其表現(xiàn)型上也會(huì)發(fā)生部分變化，突變株形態(tài)大致可分為9種類型，分別對(duì)其從a-i進(jìn)行編號(hào)。對(duì)不同形態(tài)菌株進(jìn)行培養(yǎng)并對(duì)比其OD600和排油圈直徑后發(fā)現(xiàn)，菌落中間部位有凸起的為正突變菌株，其形態(tài)與原始菌株形態(tài)(a)相似(如圖3中b、c、e、f)，其OD600及發(fā)酵液排油能力都稍高；中間處凹陷，菌落偏小的為負(fù)突變株(如圖3中 d、g、h、i)發(fā)酵液排油能力較低或無排油能力[16]。

圖3 誘變后菌株外觀(左)與溶血圈初篩(右)Fig.3 Appearance of strain after mutagenesis (left) , diametr of hemolytic circle (right)

在對(duì)surfatin的研究中發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的溶解血細(xì)胞的能力，因此在含血液的平板培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)溶血圈[17]。結(jié)合這一特性建立了通過溶血圈來篩選產(chǎn)surfactin菌株的經(jīng)典血平板法。選取表觀初篩后所得的正突變表型菌株轉(zhuǎn)接至含有新鮮羊血細(xì)胞的的血平板培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h選取在血平板上有明顯溶血圈的菌株進(jìn)行下一步篩選。

2.2 高通量篩選流程的建立

2.2.1 孔間平行性分析

由于深孔板孔數(shù)較多，因此實(shí)驗(yàn)過程中在同一塊孔板中孔與孔之間發(fā)酵結(jié)果的平行是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可行且能與搖瓶發(fā)酵結(jié)果對(duì)比的關(guān)鍵[11]。

圖4 24孔板孔間平行性Fig.4 The parallelism between differentplates of 24 square deepwell plates

分別對(duì)24孔板中各孔發(fā)酵液OD600及發(fā)酵上清排油能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。根據(jù)圖4所得結(jié)果比較其標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值后發(fā)現(xiàn)孔間OD600標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為4.93%，發(fā)酵液排油圈直徑標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為4.42%，兩標(biāo)準(zhǔn)偏差值均小于5%，證明孔間平行性達(dá)到要求，可用于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

2.2.2 高通量檢測(cè)體系

溴百里酚藍(lán)(BTB)與氯化十六烷基吡啶(CPC)結(jié)合后顏色由深藍(lán)色變?yōu)闇\黃綠色，surfactin作為一種帶負(fù)電荷的生物表面活性劑會(huì)與陽離子CPC結(jié)合從而使BTB游離出來，surfactin濃度不同，與CPC結(jié)合程度也會(huì)有差異，使作為顯色劑的BTB游離出的濃度也不同，從而顯色體系的顏色會(huì)由淺黃綠色漸變?yōu)轷r藍(lán)色[18-19]，顏色二次轉(zhuǎn)變的過程可以用分光光度計(jì)或者酶標(biāo)儀測(cè)量。制作相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到surfactin濃度與A600nm之間關(guān)系的公式為:

y=0.034 25+0.352 88x

式中：y為surfactin濃度；x為A600nm。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可看出x與y值存在正相關(guān)性。但該標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值偏小，僅為0.988 69，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線并不能作為準(zhǔn)確定量發(fā)酵液中surfactin濃度的依據(jù)，該方法只能作為一個(gè)快速檢測(cè)模式在前期初篩的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選出產(chǎn)量相對(duì)較高的菌株。在之后仍需其他數(shù)據(jù)輔助驗(yàn)證并進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。

圖5 600 nm處surfactin標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve at 600 nm of surfactin

發(fā)酵樣本稀釋至合適濃度后加入含有CPC-BTB試劑的微孔板中，混合均勻后25 ℃下反應(yīng)5 min，取120 μL轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板并使用酶標(biāo)儀測(cè)定其A600nm，將篩選出的顏色亮藍(lán)或在600 nm處吸光值較大的樣品使用250 mL三角瓶進(jìn)行第二輪復(fù)篩，并用HPLC對(duì)復(fù)篩所得發(fā)酵樣本進(jìn)行產(chǎn)量檢測(cè)后對(duì)比篩選出產(chǎn)量最高菌株。在經(jīng)過多次ARTP誘變篩選后最終獲得1株surfactin高產(chǎn)菌株，經(jīng)HPLC檢測(cè)其產(chǎn)量為0.8 g/L，并將其命名為B.subtilisSF90-5。

2.3 菌株驗(yàn)證

2.3.1 與出發(fā)菌株的比較

使用三角瓶(250 mL裝液量40 mL)在37 ℃，200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)突變菌株B.subtilisSF90-5及原始菌株60 h，發(fā)酵結(jié)束后其生物量和產(chǎn)量對(duì)比結(jié)果如圖6。與原始菌株相比，B.subtilisSF90-5菌株發(fā)酵液生物量稍高于出發(fā)菌株，脂肽類表面活性劑合成明顯增加，且通過排油圈方法測(cè)得其排油能力相比出發(fā)菌株提高約2.3倍。

圖6 出發(fā)菌株B. subtis E7與B. subtis SF90-5菌株對(duì)比結(jié)果Fig.6 The different between B. subtis E7 and B. subtis SF90-5

分別將原始菌株與B.subtisSF90-5菌株發(fā)酵液調(diào)pH 2酸沉過夜，離心棄上清，沉淀用等量甲醇溶解，并用0.4 μm濾膜過濾。進(jìn)樣50 μL并對(duì)比原始菌株及突變株B.subtisSF90-5在214 nm下的出峰圖，由圖7可以看出，原始菌株中surfactin產(chǎn)量為0.12 g/L，而突變株中surfactin含量則達(dá)到0.8 g/L，是原始菌株的7倍，在目前已發(fā)文獻(xiàn)中同樣處于較高水平，使用價(jià)值較強(qiáng)。

圖7 原始菌株與B. subtis SF90-5 HPLC檢測(cè)surfactin對(duì)比圖Fig.7 HPLC profile of surfactin produced by parent strain and B. Subtilis SF90-5

2.3.2B.subtilisSF90-5突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

為了驗(yàn)證所獲突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，將誘變所得B.subtilisSF90-5菌株用固體種子平板連續(xù)傳代5次，對(duì)5代菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵；同時(shí)對(duì)-85 ℃甘油管保存3個(gè)月的B.subtilisSF90-5菌株經(jīng)活化后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果見表1。由表1可知，在連續(xù)傳代培養(yǎng)后發(fā)酵液排油能力均在7.5左右,HPLC檢測(cè)所得產(chǎn)量均在0.8 g/L左右，表明誘變所得菌株B.SubtilisSF90-5具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 B. subtilis SF90-5菌株的遺傳穩(wěn)定性生物表面活性檢測(cè)

3 討論

本研究采用的誘變方式為常溫常壓等離子體(ARTP)誘變，ARTP是近些年來新興的一種誘變處理方式，其具有處理溫度低、常壓下就可產(chǎn)生高活性等離子體射流等優(yōu)點(diǎn)。高活性的等離子體射流通過改變細(xì)胞膜通透性從而引起細(xì)胞基因損傷最終使其產(chǎn)生突變[20-21]。原始菌株在平板培養(yǎng)時(shí)菌落中間會(huì)有凸起，對(duì)突變株進(jìn)行產(chǎn)surfactin驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，突變株形態(tài)與原始株相似時(shí)surfactin產(chǎn)量較高，而當(dāng)突變株菌落形態(tài)中間凸起消失，與原始菌形態(tài)差異較大時(shí)發(fā)酵不產(chǎn)或少產(chǎn)surfactin。WANG等人在阿維菌素鏈霉菌的ARTP誘變中發(fā)現(xiàn)了經(jīng)ARTP誘變后的菌體形態(tài)與產(chǎn)量之間有著一定的相關(guān)性[22]，與本研究中枯草芽孢桿菌經(jīng)ARTP誘變后，菌落形態(tài)與脂肽產(chǎn)量具有的相關(guān)性現(xiàn)象類似。因此，在誘變后首先以簡(jiǎn)單表型初篩作為篩選依據(jù)可減少工作量，提高篩選效率[23]。

誘變育種與基因工程育種不同，ARTP引起細(xì)胞基因突變的效率雖高但卻有著很大的隨機(jī)性，因此大量的篩選工作是在誘變后獲得目的菌株的關(guān)鍵。高通量作為近年來比較熱門的一種研究思路，孔板在經(jīng)過選型、裝液量及孔間平行性等預(yù)實(shí)驗(yàn)之后可以完美代替搖瓶的工作，改善了搖瓶篩菌中工作量大，通量小等問題，短期內(nèi)使篩選通量增加數(shù)十倍。多孔板的應(yīng)用必然要結(jié)合高速快捷的檢測(cè)方法才能有效提高工作效率，真正實(shí)現(xiàn)高通量篩選。血平板法能有效在初篩過程中排除不產(chǎn)surfactin或產(chǎn)surfactin較少的菌株，CPC-BTB法可快速對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)surfactin的能力進(jìn)行評(píng)定，2種方法的使用極大程度加快了篩選的進(jìn)度。但CPC-BTB法并不能十分精確地對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量，該方法只能作為經(jīng)過簡(jiǎn)單初篩后快速篩選出產(chǎn)surfactin能力較強(qiáng)的菌株的依據(jù)，后續(xù)仍需通過傳統(tǒng)檢測(cè)方式對(duì)所篩選出的突變株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩并檢測(cè)產(chǎn)量?，F(xiàn)階段深孔板搖床的使用已解決高通量發(fā)酵的問題，但為進(jìn)一步加快篩菌速率，產(chǎn)物的快速檢測(cè)方法仍需進(jìn)一步完善。

本研究旨在提供一種高效快捷的高通量誘變篩選流程。通過ARTP誘變結(jié)合高通量篩菌的方式成功獲得脂肽高產(chǎn)菌株B.SubtilisSF90-5。其發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到0.8 g/L，這為進(jìn)一步的發(fā)酵工藝放大提供了有利的先導(dǎo)條件，為surfactin的進(jìn)一步研究提供了重要基礎(chǔ)。而surfactin的產(chǎn)量與多種不同因素有關(guān)，除了菌種誘變外，發(fā)酵工藝的優(yōu)化對(duì)其產(chǎn)量的提高也相當(dāng)重要，同時(shí)易產(chǎn)泡的特性對(duì)surfactin發(fā)酵過程的穩(wěn)定進(jìn)行造成了一定困難，因此更高效的發(fā)酵模式的提出對(duì)surfactin的大規(guī)模生產(chǎn)也有著重要的影響。

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李光1，唐小玲1，韋璇3，朱學(xué)亮1，張勇2，張樂樂2，陳雙喜1*

1(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 開封，475000) 2(無錫源清天木生物科技有限公司，江蘇 無錫，214000)3(沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽，110000)

High-throughput screening ofBacillussubtilismutants with high yield of surfactinby ARTP

LI Guang1, TANG Xiao-ling1, WEI Xuan3, ZHU Xue-liang1,ZHANG Yong2, ZHANG Le-le2, CHEN Shuang-xi1*

1(School of Life Science, Henan University, Kaifeng 475000, China)2(Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co., Ltd, Wuxi 214000, China)3(College of Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

In this study,ARTP(atmospheric pressure and room temperature plasma, ARTP) method was used to obtain rapid mutagenesis ofBacillussubtilisE7 in atmospheric pressure and room temperature, to screen strain with high yield of surfactin. Several methods such as appearance screening, determination of diameter of hemolytic circle, culture in Microflask, detection by multifunctional enzyme standard detector, and shake flask test were combined to improve screening throughput and speed up screening process. A high-throughput screening system for mutant strain with high yield of surfactin was preliminarily built.High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect target product. After mutagenesis for 220 s,Bacillussubtillusstrain SF90-5 with good genetic stability was obtained. Its surfactin yield increased to 0.8 g/L, which was 5 times of that of the original strain. Mutagenesis with ARTP resulted inreduced workload,effectively increased screening flux, and accelerated screening process. Desired target strain was obtained fleetly. This experiment provided a foundation for study of strain with high yield of surfactin.

surfactin; atmospheric pressure and room temperature plasma (ARTP);Bacillussubtilis; high-throughput

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702012

碩士研究生(陳雙喜教授為通訊作者，E-mail：csx1231@126.com)。

2016-08-16，改回日期：2016-10-21